楊 平，曾蔚欣，孫路路（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038）

HPLC-DAD多波長法同時(shí)測定丁氯麻滴眼劑中3種成分的含量Δ

楊 平＊，曾蔚欣，孫路路#（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038）

目的：建立同時(shí)測定丁氯麻滴眼劑中氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因含量的方法。方法：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器多波長法。色譜柱為ZORBAX SB-C18，流動相為pH 3.0磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（梯度洗脫），柱溫為室溫，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl，檢測波長為277 nm（氯霉素）、210 nm（鹽酸麻黃堿）、310 nm（鹽酸丁卡因）。結(jié)果：氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為12.56～125.6μg/ml（r＝0.999 8）、25.55～255.5μg/ml（r＝0.999 9）、25.25～252.5μg/ml（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；回收率分別為98.39%～100.44%（RSD＝0.79%，n＝9）、100.40～101.74%（RSD＝0.66%，n＝9）、98.83～100.67%（RSD＝0.70%，n＝9）。結(jié)論：該方法靈敏度高、定量準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于丁氯麻滴眼劑的質(zhì)量控制。

高效液相色譜-二極管陣列檢測器；丁氯麻滴眼劑；氯霉素；鹽酸麻黃堿；鹽酸丁卡因；含量測定

丁氯麻滴眼劑為法定醫(yī)院制劑，收載于《醫(yī)療單位制劑規(guī)程》中，其處方中的有效成分為氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因，該藥具有消炎、止痛的作用，可用于治療電光性眼炎[1]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測定法中僅測定了鹽酸丁卡因與鹽酸麻黃堿中的總氯量及鹽酸丁卡因的含量，無氯霉素的定量方法，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏低[1]。目前，有研究報(bào)道了同時(shí)測定這3種成分的方法，但僅為單波長[2]。由于這3種成分的紫外吸收特性有較大差異，故筆者參考2015年版《中國藥典》（二部）中氯霉素及鹽酸丁卡因的含量測定方法[3]和相關(guān)參考文獻(xiàn)[4-7]，建立了采用高效液相色譜（HPLC）-二級管陣列檢測器（DAD）多波長法同時(shí)測定丁氯麻滴眼劑中3種成分含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括DAD二極管陣列檢測器、1260四元泵、在線脫氣機(jī)（美國Agilent公司）；AG240型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

丁氯麻滴眼劑（本院制劑室提供，批號：20150710、20150717、20150806，規(guī)格：每100 ml含氯霉素0.25 g，鹽酸麻黃堿0.5 g，鹽酸丁卡因0.5 g）；氯霉素對照品（批號：30555-200602，純度：99.4%）、鹽酸麻黃堿對照品（批號：171241-201007，純度：99.7%）、鹽酸丁卡因?qū)φ掌罚ㄅ枺?00456-200301，純度：99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、三乙胺均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：pH 3.0磷酸鹽緩沖溶液（流動相A，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水至1 000 ml，再加三乙胺5 ml，混勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（流動相B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；柱溫：室溫；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長：277 nm（氯霉素）、210 nm（鹽酸麻黃堿）、310 nm（鹽酸丁卡因）。

2.2 溶液的制備

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因?qū)φ掌愤m量，置于50 ml量瓶中，加乙腈∶水（10∶90，V/V）溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml約含氯霉素250μg、鹽酸麻黃堿500μg、鹽酸丁卡因500μg的混合貯備液。精密量取上述混合貯備液2 ml，置于10 ml量瓶中，加乙腈∶水（10∶90，V/V）溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml約含氯霉素50μg、鹽酸麻黃堿100 μg、鹽酸丁卡因100μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取丁氯麻滴眼劑1 ml，置于50 ml量瓶中，加乙腈∶水（10∶90，V/V）稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按丁氯麻滴眼劑處方比例制備不含氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因的陰性對照樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因的保留時(shí)間分別為13.7、4.1、15.8 min，理論板數(shù)分別為34 863、7 777、20 724。結(jié)果表明，輔料與溶劑對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合貯備液0.5、1、2、3、4、5 ml，分別置于10 ml量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，制成系列濃度對照品溶液。取上述系列濃度對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因峰面積的RSD分別為0.39%、0.44%、0.22%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號：20150710）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因峰面積的RSD分別為1.02%、0.66%、0.84%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號：20150710）適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因的含量占標(biāo)示量的百分含量分別為98.25%、 100.43%、99.62%，RSD分別為0.68%、0.55%、0.49%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品溶液；B.陰性對照溶液；C.供試品溶液；1.氯霉素；2.鹽酸丁卡因；3.鹽酸麻黃堿Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance solution；B.negative control solution；C.test sample；1.chloramphenicol；2.tetracaine hydrochloride；3.ephedrine hydrochloride

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.8 回收率試驗(yàn)

取氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因?qū)φ掌愤m量，各自按處方量的80%、100%、120%精密稱定，加入處方比例量的其他成分，攪勻，作為模擬樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

3 討論

氯霉素的最大吸收波長為277 nm，鹽酸丁卡因?yàn)?11 nm，鹽酸麻黃堿為210 nm。有文獻(xiàn)報(bào)道，可在254 nm波長處同時(shí)檢測丁氯麻滴眼劑中3種成分[2]，但經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸丁卡因?qū)φ掌啡芤涸?54 nm波長處吸收峰極小，鹽酸麻黃堿對照品溶液在該波長下吸收峰面積不及在210 nm波長處的1/50，檢測靈敏度低，而鹽酸丁卡因在210 nm波長處幾乎無吸收，但在311 nm波長處鹽酸麻黃堿及氯霉素的峰面積很低。故采用210、277、311 nm波長分別檢測各成分，且線性范圍包括了較低的濃度區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)樣品一次稀釋，一次進(jìn)樣，3種成分同時(shí)檢測。

氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因均在酸性條件下較穩(wěn)定[2]，在堿性條件下可發(fā)生中和反應(yīng)或水解嚴(yán)重，故在分析中將流動相的pH調(diào)至酸性，有利于成分的穩(wěn)定及獲得較好的各成分在色譜柱上的保留行為。

由于氯霉素、鹽酸麻黃堿、鹽酸丁卡因的保留行為相差較大，故本研究采用梯度洗脫方式，既保證3種成分的合理洗脫時(shí)間，實(shí)現(xiàn)有效分離，又大大縮短了鹽酸丁卡因及制劑中輔料羥苯乙酯的出峰時(shí)間（分別為15.7、20.6 min），節(jié)省了分析時(shí)間及成本。

綜上所述，本方法靈敏度高、定量準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于丁氯麻滴眼劑的質(zhì)量控制。

[1] 北京市衛(wèi)生局.醫(yī)療單位制劑規(guī)程[S].1984：267.

[2] 何詠梅，杜紹禮，趙志剛.HPLC法同時(shí)測定丁氯麻滴眼液中三組分的含量[J].中國藥師，2007，10（3）：253.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1 397.

[4] 畢福鈞，林彤.HPLC法測定小兒咳喘靈口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2014，25（4）：490.

[5] 王曙東，宋炳生，李漢寶，等.RP-HPLC測定小兒麻甘沖劑水煎液中麻黃堿和偽麻黃堿的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2000，15（6）：458.

[6] Zhang QJ，Peng T，Chen DD.Determination of chloramphenicol residues in aquatic products using immunoaffinity column cleanup and high performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J].J AOAC Int，2013，96（4）：897.

[7] 李潔.RP-HPLC法測定注射用鹽酸丁卡因含量、含量均勻度及有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2012，32（10）：1 877.

Simultaneous Determination of 3 Components in Dinglyuma Eye Drop by HPLC-DAD at Multi-wavelength

YANG Ping，ZENG Weixin，SUN Lulu（Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100038，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of chloramphenicol，ephedrine hydrochloride and tetracaine hydrochloride in Dinglyuma eye drop.METHODS：HPLC-DAD at muliti-wavelength was performed on the column of ZORBAX SB-C18with mobile phase of pH 3.0 Phosphate buffer-acetonitrile（gradient elution），column temperature was room temperature，flow rate was 1.0 ml/min，injection volume was 20 μl，and the detection wavelength was 277 nm for chloramphenicol，210 nm for ephedrine hydrochloride and 310 nm for tetracaine hydrochloride.RESULTS：The linear range was 12.56-125.6μg/ml for chloramphenicol（r＝0.999 8），25.55-255.5μg/ml（r＝0.999 9）for ephedrine hydrochloride and 25.25-252.5 μg/ml for tetracaine hydrochloride（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 98.39-100.44%（RSD＝0.79%，n＝9），100.40-101.74%（RSD＝0.66%，n＝9）and 98.83-100.67%（RSD＝0.70%，n＝9）. CONCLUSIONS：The method is sensitive，accurate and specific，and can be used for the quality control of Dinglyuma eye drop.

HPLC-DAD；Dinglyuma eye drop；Chloramphenicol；Ephedrine hydrochloride；Tetracaine hydrochloride；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4698-03

2016-01-04

2016-09-20）

（編輯：陳 宏）

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目（No.首發(fā)2011-2008-01）；北京市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會科技成果和適宜技術(shù)推廣項(xiàng)目

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥物分析。電話：010-63926353。E-mail：guoguokate@163.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：010-63926362。E-mail：sunlulu@263.net

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.30