龐朝廷, 張 婷, 李 娜, 吳文艷, 高菊芳

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

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擬南芥雄性不育突變體opw(only pollen wall)候選突變基因的克隆

龐朝廷, 張 婷, 李 娜, 吳文艷, 高菊芳

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

在T-DNA插入突變體Salk_059463株系的群體中,篩選到兩株雄性不育突變體,對T-DNA序列上的一對引物進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果表明:其基因組中沒有T-DNA插入.遺傳分析表明這兩株雄性不育突變體由同一單個隱性基因控制,引起不育的主要原因是從花藥發(fā)育的第8期開始,小孢子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物逐漸減少直至消失,到花藥發(fā)育的第12期,藥室內(nèi)的小孢子只剩下一個花粉壁空殼,故該突變體命名為opw(only pollen wall).利用圖位克隆的方法對OPW基因進(jìn)行了定位,結(jié)果表明OPW基因位于第二條染色體上分子標(biāo)記T28M21和T3G21之間的12 kb區(qū)間內(nèi),該區(qū)間內(nèi)一共有21個基因注釋.通過克隆區(qū)間內(nèi)的基因并測序發(fā)現(xiàn)opw-1突變體基因組中At2g40140基因編碼序列的外顯子在第289和第290個堿基之間插入了一個A堿基,而opw-2突變體基因組中At2g40140基因編碼序列的外顯子在第412和第413個堿基之間插入了一個T堿基,造成的編碼序列移碼使第424至第426堿基成為終止密碼子,故At2g40140是編碼OPW的候選基因.

擬南芥; 雄性不育; 花粉壁空殼; 圖位克隆

0 引 言

植物雄性不育是指植物在有性繁殖過程中不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子的遺傳現(xiàn)象.Heslop-Harrison[1]按世代交替把雄性不育劃分為孢子體不育和配子體不育兩種類型.孢子體不育指花粉育性受孢子體(植株)基因型控制,表現(xiàn)為純合突變體不能產(chǎn)生種子;而配子體不育是指花粉育性直接受雄配子體(花粉)本身基因型控制,表現(xiàn)為雜合突變體花粉缺陷比率1∶1,而無法產(chǎn)生純合突變體.

花粉在花藥中的發(fā)育過程涉及一系列復(fù)雜而精細(xì)的分子機(jī)制,包括早期的細(xì)胞分化和命運(yùn)決定、減數(shù)分裂、花粉壁形成以及花粉細(xì)胞核有絲分裂等等.AG、SPL/NOZZLE、BAM1/BAM2、WUS、EMS1/EXS等基因與早期的細(xì)胞分化和命運(yùn)決定相關(guān)[2-8];SYN1、AHP2、AtSPO11-1、ATK1、ATK5、ASK1、MPS1等基因的功能分別涉及染色體的黏著、配對、聯(lián)會、重組、分離和胞質(zhì)分裂等關(guān)鍵過程[9-10].花粉壁發(fā)育的分子機(jī)制極其保守,主要涉及胼胝質(zhì)壁的合成、初生外壁的形成以及花粉外壁和花粉內(nèi)壁形成等[11].研究發(fā)現(xiàn)CALS5(Callose Synthase5)、CDKG1、ARF17、DEX1、NEF1、RPG1、NUP、CESA(Cellululose Synthase) 和AtUSP(Arabidopsis UDP-sugar pyrophosporylase)等基因與花粉壁的正常發(fā)育相關(guān)[12-21],進(jìn)一步的研究還表明在絨氈層發(fā)育過程中,遺傳通路“DYT1-TDF1-AMS-MS188”負(fù)責(zé)花粉外壁外層的形成;“DYT1-TDF1-AMS-TEK”負(fù)責(zé)花粉外壁內(nèi)層的形成[22-23].

小孢子從四分體中釋放出來之后,除了形成花粉壁之外,其細(xì)胞核還要經(jīng)歷兩次有絲分裂、細(xì)胞質(zhì)還需積累營養(yǎng)物質(zhì)才能形成成熟的花粉粒.然而,哪些基因控制著這些過程仍不清楚.本文作者報道的是從Salk_059463株系的群體中篩選到的由單個隱性基因控制的擬南芥雄性不育突變體,其花粉壁發(fā)育基本正常,但從花藥發(fā)育的第8期開始,小孢子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物逐漸減少直至消失,到花藥發(fā)育的第12期,藥室內(nèi)的小孢子只剩下一個花粉壁空殼,故該突變體命名為opw(only pollen wall).利用圖位克隆的方法克隆了OPW候選基因,測序結(jié)果表明突變體基因組中At2g40140基因編碼序列的外顯子部分有一個單堿基插入,造成編碼序列提前出現(xiàn)終止密碼子,故At2g40140是編碼OPW的候選基因,該基因可能參與小孢子的后續(xù)發(fā)育.

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana)分別以Columbia(Col)和Lansberg erecta(Ler)為遺傳背景,擬南芥雄性不育突變體opw-1和opw-2從Salk_059463中分離獲得,背景為Col.

1.2 方 法

1.2.1 等位分析

以Col♂×opw-1♀F1代為父本,opw-2為母本或者Col♂×opw-2♀F1代為父本,opw-1為母本雜交獲得測交種子.種植測交所得種子,觀察后代植株的表型,如果出現(xiàn)可育植株和不育植株1∶1分離的現(xiàn)象,則判斷opw-1和opw-2等位.

1.2.2 遺傳分析

以野生型Col為父本,突變體opw-1為母本進(jìn)行雜交得到F1代種子,F1代植株自交得到F2代種子.種植F2代種子,觀察F2代植株表型,統(tǒng)計F2代植株中可育植株與不育植株的比例.

1.2.3 雄性不育基因opw的初定位和精細(xì)定位

收集用野生型Ler作為父本與突變體雜交所得到的F2遺傳群體中的突變體植株用于基因定位.基因初定位的方法及所用分子標(biāo)記同[24],一旦找到了連鎖的分子標(biāo)記,就在該分子標(biāo)記附近設(shè)計新的分子標(biāo)記(表1),對突變體單株進(jìn)行基因型分析,對目的基因作進(jìn)一步定位.

表1 本研究所涉及的分子標(biāo)記引物序列

1.2.4opw基因克隆

根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果,以www.arabidopsis.org網(wǎng)提供的基因序列為依據(jù)設(shè)計引物,將其中的基因克隆后送杰李生物技術(shù)有限公司測序,根據(jù)測序結(jié)果確定候選基因.

1.2.5 DNA提取、PCR反應(yīng)和多態(tài)性檢測

方法同[24].

1.2.6 花藥發(fā)育的光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察

方法同[25].

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體opw-1和opw-2的表型分析

突變體opw-1和opw-2是從Salk_059463植株群體中分離獲得的,用T-DNA序列上的一對引物進(jìn)行PCR鑒定,鑒定結(jié)果表明其基因組中沒有T-DNA插入.突變體在生長過程中表現(xiàn)出正常的營養(yǎng)生長和花發(fā)育,但是,與野生型植株比較,突變體的果莢短小,成熟后不含種子(圖1上).而用Col或Ler野生型植株的花粉與其雜交,可以獲得種子,說明其雌蕊是正常的,該突變體是雄性不育突變體.對13期花藥進(jìn)行亞歷山大染色,發(fā)現(xiàn)突變體的藥室中的花粉粒,只有染成綠色的花粉壁,沒有染成紫紅色的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物,結(jié)合后續(xù)的掃描電鏡和樹脂半薄切片結(jié)果,故將突變體命名為花粉壁空殼opw-1和opw-2(圖1).

圖1 野生型和突變體植株形態(tài)和花粉育性比較.(a) 野生型(WT)植株具有正常的果莢;(b)、(c) opw-1和opw-2突變體植株具有短小的果莢; (d)亞歷山大染色野生型(WT)花藥中的花粉顯示可育的紫紅色; (e)、(f) opw-1和opw-2突變體花藥中的花粉為不育的綠色

2.2 突變體opw-1和opw-2是等位突變體

由于突變體opw-1和opw-2的表型極為相似,為了驗(yàn)證兩者是否等位,以Col♂×opw-1♀F1代為父本,opw-2為母本雜交獲得測交種子,后代植株75株,其中可育植株37棵,不育植株38棵;以Col♂×opw-2♀F1代為父本,opw-1為母本雜交獲得測交種子,后代植株57棵中可育植株30棵,不育植株27棵.兩種測交的結(jié)果均表明不育植株和可育植株的比例接近1∶1,經(jīng)卡方檢測表明實(shí)際比例和理論比例沒有明顯差異,突變體opw-1和opw-2是等位突變體.

2.3 突變體opw-1的遺傳分析

為了確定opw-1突變體是否由單個基因控制,將野生型Col作為父本,突變體作為母本雜交得到F1一代種子,F1代植株均為可育的野生型表型.F1代植株通過自交得到F2代種子.觀察F2代植株表型,并統(tǒng)計F2一代中可育植株與不育植株的比例.結(jié)果顯示可育植株與不育植株比為893∶38,接近3∶1.經(jīng)卡方檢測表明實(shí)際比例和理論比例沒有明顯差異,表明該突變體表型是隱性單基因控制的.

2.4 突變體opw-1和opw-2的遺傳定位

為了進(jìn)一步研究opw突變體并最終克隆opw基因,通過遺傳定位以確定該突變基因在染色體上的位置.首先,選用了在擬南芥基因組五條染色體上均勻分布的20對分子標(biāo)記進(jìn)行了基因的初定位連鎖分析.以這些分子標(biāo)記為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明突變基因opw-1與和opw-2均與第2條染色體上的分子標(biāo)記 F12L6連鎖.利用新設(shè)計的分子標(biāo)記(表1)對2000株突變體opw-1 和1800株opw-2基因多態(tài)性進(jìn)行分析,將opw基因定位在第2條染色體分子標(biāo)記T28M21和T3G21之間的12 kb的區(qū)間內(nèi)(圖2).

圖2 opw基因定位在第2條染色體上分子標(biāo)記T28M21和T3G21之間的12 kb的區(qū)間內(nèi)

該區(qū)間內(nèi)一共注釋有21個基因,通過克隆區(qū)間內(nèi)的基因并測序發(fā)現(xiàn)opw-1突變體基因組中At2g40140基因編碼序列的外顯子部分在第280與290個堿基之間插入了一個堿基A,opw-2突變體基因組中At2g40140基因編碼序列的外顯子部分在第412與413個堿基之間插入了一個堿基T,均造成編碼序列移碼,從而使突變體編碼At2g40140基因序列中的第424-426堿基出現(xiàn)了TAA終止密碼子,造成編碼序列提前終止(圖3),故At2g40140是編碼OPW的候選基因.

圖3 opw-1和opw-2突變體基因組中At2g40140基因編碼序列的突變示意圖

2.5OPW基因功能的初步分析

為了了解OPW基因在花粉發(fā)育過程中的作用,利用樹脂半薄切片技術(shù)對突變體opw-1花藥發(fā)育過程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察,結(jié)果表明在花藥發(fā)育的第1至第7期,突變體opw-1花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)變化與野生型的相比,未出現(xiàn)明顯的變化(圖4(a)和(e)、(b)和(f)).花藥發(fā)育的第8期,野生型四分體中釋放出來的小孢子已形成完整的細(xì)胞壁,形態(tài)呈不規(guī)則多邊形(圖4(c));而突變體四分體中釋放出來的小孢子形態(tài)呈圓形(圖4(g)),提示小孢子細(xì)胞壁出現(xiàn)了問題.在花藥發(fā)育的第9至第10期,野生型藥室中小孢子花粉外壁基本形成(圖4(d)),細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入單核液泡期(圖4(i)),花粉外壁和胞質(zhì)著色較深;而突變體藥室中小孢子花粉外壁雖能形成(圖4),但小孢子內(nèi)容物逐漸減少,胞質(zhì)著色較淡(圖4(m)).在花藥發(fā)育的第11至第13期,野生型藥室中小孢子的細(xì)胞核經(jīng)過了兩次有絲分裂,形成細(xì)胞質(zhì)濃密的成熟花粉粒子(圖4(j)、(k)),掃描電鏡下花粉外形飽滿,為長橢圓狀,花粉外壁結(jié)構(gòu)完整,具有典型的萌發(fā)溝(圖4(l));而突變體藥室中小孢子的細(xì)胞內(nèi)容物逐漸降解消失,只剩下花粉壁(圖4(n)、(o)),掃描電鏡下花粉外壁結(jié)構(gòu)較完整,也具有典型的萌發(fā)溝,但形狀不夠飽滿(圖4(p)).從上述突變體花藥發(fā)育過程中小孢子的形態(tài)變化中可以預(yù)測OPW基因功能可能主要涉及花粉外壁形成之后的小孢子后續(xù)發(fā)育過程,即小孢子細(xì)胞核的有絲分裂及胞質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)積累過程.

圖4 野生型和opw-1突變體花藥橫切面和花粉外貌觀察.(a)和(e)：第6期花藥橫切;(b)和(f)：第7期花藥橫切;(c)和(g)：第8期花藥橫切;(d)和(h)：第9期花藥橫切;(i)和(m)：第10期花藥橫切;(j)和(n)：第11期花藥橫切;(k)和(o)O：第12期花藥橫切(標(biāo)尺=20 μm);(l)和(p)：第13期花藥中花粉的外貌.(a)～(d)和(i)～(l)：野生型；(e)～(h)和(m)～(p) ：opw-1突變體.

3 討 論

3.1 At2g40140是OPW的候選基因

為了克隆OPW基因,首先建立了野生型Ler作為父本與突變體雜交所得的F2遺傳群體,以其中的突變體作為圖位克隆的材料.然后根據(jù)網(wǎng)上公布的擬南芥基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)庫,在擬南芥5條染色體上選擇In /Del標(biāo)記,并利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物,用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證2個親本Ler和Col之間的多態(tài)性.由于opw-1和opw-2突變體初定位的結(jié)果都表明與第2條染色體上的分子標(biāo)記F12L6緊密連鎖,結(jié)合opw-1和opw-2突變體13期花藥亞歷山大染色和掃描電鏡的結(jié)果極其相似,故又進(jìn)行了測交實(shí)驗(yàn).以Col♂×opw-1♀F1代為父本,opw-2為母本雜交或以Col♂×opw-2♀F1代為父本,opw-1為母本雜交的結(jié)果都是后代植株中可育植株和不育植株出現(xiàn)了1∶1分離的現(xiàn)象,表明兩個突變體是等位突變體.

精細(xì)定位的結(jié)果表明opw基因定位在第2條染色體分子標(biāo)記T28M21和T3G21之間的12 kb的區(qū)間內(nèi)(圖2).通過克隆區(qū)間內(nèi)的基因并測序發(fā)現(xiàn)opw-1和opw-2這兩個等位突變體基因組中At2g40140基因編碼序列的外顯子部分有一個單堿基插入,造成編碼序列提前出現(xiàn)終止密碼子(圖3),故判斷At2g40140是編碼OPW的候選基因.下一步的工作是構(gòu)建At2g40140基因的互補(bǔ)載體,通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定OPW基因.

3.2OPW的功能與小孢子發(fā)育為成熟花粉粒相關(guān)

野生型小孢子從四分體中釋放出來后,除了完成花粉壁發(fā)育以外,其細(xì)胞核還要經(jīng)歷兩次有絲分裂,并且合成大量營養(yǎng)物質(zhì)才能形成成熟的花粉粒.對突變體opw-1花藥發(fā)育過程進(jìn)行的細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)花粉發(fā)育在花藥發(fā)育的第8期開始顯現(xiàn)異常(圖4(g)),在花粉壁初步形成以后,小孢子內(nèi)容物逐漸減少,只剩下空的花粉壁(圖4(o)),掃描電鏡下花粉外壁結(jié)構(gòu)較完整,也具有典型的萌發(fā)溝,但形狀不夠飽滿(圖4(p)).從上述突變體花藥發(fā)育過程中小孢子的形態(tài)變化中可以預(yù)測OPW基因功能可能主要涉及花粉外壁形成之后的小孢子后續(xù)發(fā)育過程,即小孢子細(xì)胞壁發(fā)育以及細(xì)胞核的有絲分裂及胞質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)積累過程.由于突變體opw-1是受單個隱性基因控制的雄性不育突變體,對OPW基因功能的深入研究可以幫助我深入理解孢子體基因如何調(diào)控雄配子的發(fā)育.

致謝 本文的實(shí)驗(yàn)工作在上海師范大學(xué)植物功能基因?qū)嶒?yàn)室完成.感謝ABRC提供突變體種子.

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(責(zé)任編輯：顧浩然)

Cloning of Gene of male sterile mutant opw(only pollen wall)in Arabidopsis thaliana

PANG Chaoting, ZHANG Ting, LI Na, WU Wenyan, GAO Jufang

(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

Two male sterile mutant lines with normal vegetative and flora development but no seed yields were screened out from Salk_059463 line,a population ofArabidopsis ecotypeColumbia (Col) mutagenized by T-DNA insertion (provided by ARBC).The identification of T-DNA insertion site showed that there were no T-DNA sequences in the genome of these two mutants.Genetic analysis indicated that the mutants were allele and controlled by the same single recessive nuclear gene namedonly pollen wall,of which the cytoplasm of microspores becomes vanished from anther development stage 8,and there are only pollen wall of pollen grains in the anther at the anther development stage 12.TheOPWgene was mapped to a region of 12 kb between the molecular makers T28M21 and T3G21 on chromosome 2 using map-based cloning technique.There are 21 genes annotations in that region.Cloning and sequencing the At2g40140 of the mutants,we found that there was a single A base insertion between 289 to 290 bases in theopw-1 and another single T base insertion between 412 to 413 bases in theopw-2,therefore caused the end code appear in 424-426 bases.So At2g40140 is considered the candidate gene of theOPW.

Arabidopsis thaliana; male sterile;only pollen wall; map-based cloning

2015-07-06

國家自然科學(xué)基金(30970268);上海師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目

高菊芳,中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號,上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,郵編:200234,E-mail:gaojufan@shnu.edu.cn

Q 78; Q 943

A

1000-5137(2016)05-0624-07

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2016.05.018