王科云, 葉明亮, 鄒漢法

(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家色譜研究分析中心, 遼寧大連 116023)

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蛋白質(zhì)甲基化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法新進(jìn)展

王科云, 葉明亮*, 鄒漢法#

(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家色譜研究分析中心, 遼寧大連 116023)

蛋白質(zhì)的甲基化修飾是一類重要的翻譯后修飾。但與磷酸化、糖基化和泛素化等翻譯后修飾相比,甲基化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法開發(fā)還是一個(gè)較新的研究領(lǐng)域。近幾年,由于甲基化修飾在表觀遺傳調(diào)控中的重要作用,這一修飾類型得到了越來越多的關(guān)注,相關(guān)的分析技術(shù)和分析方法也取得了較多進(jìn)展。其中,基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法在甲基化修飾中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,實(shí)現(xiàn)了這一甲基化修飾的高通量分析。該綜述將從甲基化修飾的分離富集、假陽性率控制以及定量蛋白質(zhì)組學(xué)等方面對(duì)一些蛋白質(zhì)甲基化修飾的分析技術(shù)和方法的最新進(jìn)展進(jìn)行介紹。

蛋白質(zhì)甲基化修飾;選擇性富集;可信度控制;定量蛋白組學(xué);綜述

蛋白質(zhì)的甲基化修飾由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生[1,2],是最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。甲基化修飾在很多生理過程的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[3]。研究表明:蛋白質(zhì)甲基化可以調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的相互作用;影響它們和RNA的親和作用,從而影響多種細(xì)胞進(jìn)程,如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞定位、核糖體裝配、RNA加工、不均一核糖核酸核糖體蛋白(hnRNPs)的成熟、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、準(zhǔn)確翻譯、細(xì)胞核運(yùn)輸、蛋白質(zhì)與核酸的運(yùn)輸和代謝、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等[4-6]。最近發(fā)現(xiàn)的具有賴氨酸去甲基化活性的酶[7,8]說明蛋白質(zhì)的賴氨酸甲基化修飾也是一類動(dòng)態(tài)調(diào)控的修飾類型,這進(jìn)一步促使研究人員深入研究甲基化修飾在生理過程中的調(diào)控作用。到目前為止,對(duì)組蛋白以及參與轉(zhuǎn)錄翻譯過程的蛋白質(zhì)上的甲基化已經(jīng)有了比較深入的研究[5,9-12],但對(duì)其他蛋白質(zhì)上發(fā)生的甲基化修飾參與的調(diào)控過程的認(rèn)識(shí)還比較欠缺。目前已知的大多數(shù)甲基化事件發(fā)生在精氨酸和賴氨酸殘基上,屬于N-甲基化,并且存在不同的甲基化類型,比如賴氨酸可以發(fā)生單甲基化、二甲基化和三甲基化,而精氨酸能發(fā)生單甲基化、對(duì)稱二甲基化和非對(duì)稱二甲基化[13]。除了N-甲基化,甲基化修飾還可以發(fā)生在氧和硫中心原子上[13],但相關(guān)的研究還比較少。雖然已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道蛋白質(zhì)的甲基化修飾,由于甲基化的多樣性及復(fù)雜性,在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上鑒定甲基化位點(diǎn)仍然十分困難,這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中甲基的引入除了增加甲基化氨基酸殘基的空間位阻和減少氨基酸殘基的氫鍵作用力外,并沒有顯著改變氨基酸殘基的凈電荷或者等電點(diǎn)[14],這使甲基化蛋白質(zhì)/肽段的高效分離富集比較困難,極大地影響了分析的靈敏度。

甲基化肽段的分離富集是對(duì)甲基化蛋白質(zhì)組(methylome)[15]進(jìn)行深入研究的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的甲基化是一種低豐度的翻譯后修飾類型,因而在基于質(zhì)譜的“鳥槍法”[16]蛋白質(zhì)組學(xué)研究中容易受到非甲基化肽段的干擾而難以得到高效的鑒定。目前用于甲基化蛋白質(zhì)/肽段分離的方法主要包括基于抗體的免疫沉淀法、基于結(jié)合結(jié)構(gòu)域的免疫沉淀法和色譜分離法。這些富集處理可以顯著提高樣品中甲基化肽段的豐度,從而使低豐度的甲基化肽段也可以被鑒定到,因而是深入研究甲基化修飾的一個(gè)關(guān)鍵步驟。假陽性率(false discovery rate, FDR)的控制是甲基化修飾研究中另一個(gè)需要重視的問題。甲基化引入的相對(duì)分子質(zhì)量差異(+14 Da)與很多氨基酸之間的相對(duì)分子質(zhì)量差異相同[17],因而在基于質(zhì)譜的分析中,單純依靠相對(duì)分子質(zhì)量之間的差異很難將甲基化修飾與可能發(fā)生的氨基酸替換有效區(qū)分開,所以會(huì)引入很大的不確定性。為了提高鑒定結(jié)果的可信度,重標(biāo)甲硫氨酸-細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(heavy methyl stable isotope labelling by amino acids in cell culture, hM-SILAC)技術(shù)被用來在甲基化修飾上引入額外的質(zhì)量差異,從而提升甲基化修飾與氨基酸替換的質(zhì)量區(qū)分度。此外,基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略也在甲基化修飾的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。通過與細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labelling by amino acids in cell culture, SILAC)技術(shù)相結(jié)合,可以對(duì)不同生理狀況下甲基化修飾的豐度進(jìn)行定量分析,從而更加深入地研究甲基化修飾參與的生理過程。到目前為止,基于質(zhì)譜的“鳥槍法”分析策略在甲基化修飾的高通量研究中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用,也取得了一系列的重要進(jìn)展。在本綜述中,我們將從甲基化修飾蛋白質(zhì)/肽段的分離富集、假陽性率的控制、定量分析等方面來介紹甲基化蛋白質(zhì)組的研究新進(jìn)展。

1 甲基化修飾蛋白質(zhì)/肽段的分離富集

蛋白質(zhì)甲基化修飾的豐度很低,在進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析時(shí),甲基化肽段的鑒定經(jīng)常會(huì)受到高豐度非甲基化肽段的干擾。因此,對(duì)甲基化修飾進(jìn)行深入研究的關(guān)鍵步驟就是對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,提高甲基化肽段的豐度。基于抗體的免疫沉淀方法是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中很常見的一種分離翻譯后修飾肽段的方法,這一方法已經(jīng)在蛋白質(zhì)的乙?；揎梉18,19]、泛素化修飾[20,21]等翻譯后修飾的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。但由于甲基化引入的修飾基團(tuán)比較小,對(duì)修飾后的氨基酸殘基的理化性質(zhì)改變也比較小,所以在利用抗體進(jìn)行分離富集的時(shí)候,富集特異性比較差,尤其是對(duì)于賴氨酸甲基化[22,23],其檢測(cè)靈敏度及特異性完全依賴于制備抗體的質(zhì)量。2014年,CST(Cell Signaling Technology)公司開發(fā)了一類針對(duì)甲基化模體(motif)的廣譜抗體[24],這類抗體對(duì)甲基化修飾肽段具有比較高的結(jié)合能力和特異性,在單次實(shí)驗(yàn)中從人源細(xì)胞系和老鼠組織樣品中鑒定到超過1 000個(gè)精氨酸甲基化修飾位點(diǎn)和160個(gè)以上的賴氨酸甲基化修飾位點(diǎn)。這些抗體在后續(xù)的研究中得到了廣泛的應(yīng)用,被用于甲基化位點(diǎn)的規(guī)?；b定以及甲基化修飾的定量研究[25,26],極大地促進(jìn)了甲基化修飾的深入研究。Garcia課題組[27]開發(fā)了一類賴氨酸甲基化抗體,從HeLa細(xì)胞中鑒定到493個(gè)甲基化肽段,對(duì)應(yīng)413個(gè)蛋白質(zhì)上的552個(gè)賴氨酸甲基化位點(diǎn),取得了比較好的分離效果。并在后續(xù)的研究中從食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)細(xì)胞中鑒定到多達(dá)1 800個(gè)賴氨酸單甲基化修飾位點(diǎn)[28],是到目前為止單次實(shí)驗(yàn)鑒定到的最大的賴氨酸甲基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)集。與二甲基化和三甲基化相比,賴氨酸單甲基化修飾對(duì)賴氨酸殘基的理化性質(zhì)改變比較小,這一特點(diǎn)使得化學(xué)富集和特異性抗體的制備都比較困難。趙英明課題組[29]巧妙地通過化學(xué)衍生法在單甲基化的賴氨酸殘基上添加一個(gè)丙?；鶊F(tuán),而二甲基化賴氨酸和三甲基化賴氨酸不能與丙酸酐(propionic anhydride)反應(yīng),因此該方法可以特異性地對(duì)單甲基化賴氨酸進(jìn)行衍生化反應(yīng),而且該反應(yīng)在細(xì)胞裂解液中的效率高達(dá)98%以上;衍生得到的丙酰-單甲基化基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度提高,可以制備特異性較高的抗體,用來對(duì)單甲基化修飾的賴氨酸肽段進(jìn)行親和富集;最后通過高通量的質(zhì)譜分析以達(dá)到賴氨酸單甲基化修飾的規(guī)?；b定。作者對(duì)多種人源細(xì)胞(HeLa、K562、SW620、A549和SMM7721細(xì)胞)進(jìn)行了分析,共鑒定出446個(gè)修飾位點(diǎn),對(duì)應(yīng)398個(gè)蛋白質(zhì),大多數(shù)修飾位點(diǎn)都屬首次發(fā)現(xiàn)；作者還將該方法用于人肝癌組織樣品分析,鑒定出59個(gè)修飾位點(diǎn),對(duì)應(yīng)49個(gè)蛋白質(zhì)。

近年來,基于甲基化賴氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和方法也被引入甲基化蛋白質(zhì)組的研究中,主要用于賴氨酸甲基化蛋白質(zhì)的分離。Gozani研究組[22,23]利用含甲基化賴氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)為富集工具,對(duì)賴氨酸甲基化的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離。L3MBTL1蛋白質(zhì)的三重惡性腦瘤域(the triple malignant brain tumor domains, 3×MBT)含有一個(gè)能識(shí)別甲基化賴氨酸的結(jié)合口袋,其特異性不受周圍氨基酸殘基的影響。作者制備了一種固載了3×MBT結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能化樹脂,對(duì)HEK293T細(xì)胞中單甲基化和二甲基化賴氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離并用質(zhì)譜分析,成功鑒定了上百個(gè)甲基化事件。與此同時(shí),Shawn研究組[30]利用HP1β上的染色質(zhì)域?qū)嚢彼峒谆揎椀牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行分離,鑒定到一個(gè)高質(zhì)量的HP1β相互作用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集?；诮Y(jié)合結(jié)構(gòu)域的甲基化蛋白質(zhì)組的研究不僅擴(kuò)展了已知的賴氨酸甲基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)集,還加深了對(duì)甲基化引導(dǎo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)的理解[30]。但這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)谆亩蔚淖饔昧Ρ容^弱,所以不能有效地應(yīng)用于甲基化肽段的富集,因而即使對(duì)甲基化蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,酶解后樣品的復(fù)雜度還是很高,難以實(shí)現(xiàn)甲基化位點(diǎn)的高效鑒定[23]。

另外,基于親水色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)[31]、等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)以及強(qiáng)陽離子交換色譜(strong cation exchange chromatography, SCX)[31]的色譜分離方法也在甲基化修飾的高通量分析中得到了成功的應(yīng)用。精氨酸的甲基化修飾容易發(fā)生在蛋白質(zhì)的親水區(qū)域內(nèi),因而經(jīng)酶解得到的精氨酸甲基化肽段的親水性一般會(huì)比較強(qiáng),可以通過親水色譜法對(duì)甲基化肽段進(jìn)行一定程度的富集[31]。在對(duì)hM-SILAC標(biāo)記的HeLa細(xì)胞的研究中,Acuto研究組[31]利用HILIC分離成功鑒定到131個(gè)蛋白質(zhì)上的249個(gè)精氨酸甲基化位點(diǎn),其中有190個(gè)位點(diǎn)是之前沒有報(bào)道過的新位點(diǎn)。另外,發(fā)生甲基化修飾后的賴氨酸殘基和精氨酸殘基的碳端(C端)不容易被胰蛋白酶識(shí)別而導(dǎo)致漏切。因?yàn)榧谆揎棽粫?huì)改變賴氨酸殘基和精氨酸殘基的帶電性質(zhì),這些漏切肽段會(huì)比普通的酶切肽段多帶一些正電荷,因而可以利用SCX對(duì)這些甲基化肽段進(jìn)行分離。該研究組[31]利用低pH范圍的離線SCX分離策略,成功地鑒定到39個(gè)精氨酸甲基化位點(diǎn),其中25個(gè)位點(diǎn)是之前沒有報(bào)道過的新位點(diǎn)。但是低pH范圍的SCX分離條件下,非甲基化的漏切肽段和含有組氨酸的肽段也會(huì)多帶一些正電荷,因而會(huì)對(duì)甲基化肽段的高效分離造成干擾。該研究組[31]報(bào)道,在甲基化肽段比較集中的SCX餾分中,含有組氨酸的肽段占全部肽段的60%～70%,極大地影響了分離的特異性。因?yàn)槁┣形恢枚喑龅馁嚢彼峄蛘呔彼?這些帶有漏切位點(diǎn)的甲基化肽段的等電點(diǎn)比普通酶切肽段的等電點(diǎn)高,因而可以利用等電聚焦對(duì)甲基化肽段進(jìn)行分離。該研究組[31]通過分析包含已知精氨酸甲基化位點(diǎn)的肽段,發(fā)現(xiàn)90%以上的精氨酸甲基化肽段的等電點(diǎn)都大于9,因而可以利用這一性質(zhì)對(duì)精氨酸甲基化肽段進(jìn)行分離。在接下來的實(shí)驗(yàn)中,作者利用等電聚焦分離和質(zhì)譜分析,成功地鑒定到66個(gè)精氨酸甲基化位點(diǎn),其中34個(gè)是新位點(diǎn)。但是由于缺乏pH范圍合適的梯度膠條(IPG strip),一些堿性太強(qiáng)的甲基化肽段不能得到很好的回收,因而影響了最終鑒定的甲基化位點(diǎn)數(shù)目。

另外一種方法是添加帶有反應(yīng)基團(tuán)的甲基供體對(duì)甲基化蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記[32,33],對(duì)帶有反應(yīng)基團(tuán)的蛋白質(zhì)進(jìn)行基于“生物正交化學(xué)”[34]的分離,然后通過質(zhì)譜分析對(duì)這些甲基化蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。Luo課題組[32,33]將SAM類似物的標(biāo)記策略應(yīng)用于全細(xì)胞體系蛋白質(zhì)甲基化位點(diǎn)的修飾,結(jié)合生物素-親和素富集技術(shù)及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)發(fā)展了一種基于SAM類似物的生物正交蛋白質(zhì)底物譜技術(shù)。由于這些SAM類似物的結(jié)構(gòu)與天然的SAM存在比較大的差異,因而通過基因工程手段獲得的能夠特異性識(shí)別對(duì)應(yīng)SAM類似物的甲基轉(zhuǎn)移酶研究策略僅能獲得某一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶的底物蛋白質(zhì)譜,不能真正成為甲基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的工具。為了尋找一種能被天然的蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶廣泛利用的SAM類似物,并應(yīng)用于甲基化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,趙宗保課題組和鄒漢法課題組[35]針對(duì)一株SAM營養(yǎng)缺陷型酵母發(fā)展了一種基于allyl-SAM代謝標(biāo)記的甲基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略。釀酒酵母被敲除掉基因SAM1和SAM2后自身不能合成SAM。在培養(yǎng)酵母的時(shí)候,添加能被甲基轉(zhuǎn)移酶廣譜利用的SAM類似物allyl-SAM,它可以在SAM轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下進(jìn)入胞內(nèi)并對(duì)潛在的甲基化底物蛋白質(zhì)進(jìn)行烯丙基化修飾。通過合成含生物素官能團(tuán)的探針分子,借助“生物正交化學(xué)”反應(yīng)對(duì)烯丙基修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行捕獲并利用生物素與親和素樹脂之間的相互作用對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。通過質(zhì)譜分析檢測(cè)及數(shù)據(jù)庫搜索鑒定,成功實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母甲基化蛋白質(zhì)組的規(guī)?；治?為釀酒酵母甲基化功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的分析,共篩選出167個(gè)目標(biāo)甲基化蛋白質(zhì),其中24%的蛋白質(zhì)之前曾被證實(shí)為甲基化蛋白質(zhì),另外76%的甲基化事件則為首次發(fā)現(xiàn)。對(duì)得到的甲基化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明細(xì)胞質(zhì)和核糖體是釀酒酵母甲基化蛋白質(zhì)豐度比較高的區(qū)域,而甲基化蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能較多涉及mRNA結(jié)合、核糖體裝配、生物大分子復(fù)合、連接酶活性以及參與細(xì)胞質(zhì)翻譯和氨基酸代謝等,這表明甲基化修飾可能在這些生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用?；凇吧镎换瘜W(xué)”的方法,其最主要的缺點(diǎn)是只能鑒定到甲基化蛋白質(zhì)而不能鑒定到具體的甲基化位點(diǎn),限制了這類方法在甲基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用。

目前,這些分離富集方法在應(yīng)用于甲基化蛋白質(zhì)/肽段分析時(shí)都存在特異性差的缺點(diǎn),嚴(yán)重阻礙了蛋白質(zhì)甲基化修飾的高通量分析。因而,該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)在于開發(fā)選擇性更高的甲基化肽段分離方法,為規(guī)模化分析甲基化修飾組及闡釋甲基化參與調(diào)控的生理過程提供重要的技術(shù)支撐。

2 甲基化修飾鑒定的可信度控制

假陽性率的控制是蛋白質(zhì)甲基化研究中另外一個(gè)需要關(guān)注的問題。甲基化修飾引入的相對(duì)分子質(zhì)量差異(+14 Da)與很多氨基酸之間的相對(duì)分子質(zhì)量差異相同。因而在基于質(zhì)譜的分析中很難有效區(qū)分甲基化修飾與可能發(fā)生的氨基酸替換[17]。hM-SILAC策略通常被用來提高鑒定結(jié)果的可信度。2004年,Ong等[17]發(fā)展了一種基于抗體富集和細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記相結(jié)合的鑒定和定量甲基化位點(diǎn)的方法。這一方法的大致流程如圖1所示:輕標(biāo)樣品中加入正常的甲硫氨酸,重標(biāo)樣品中加入同位素標(biāo)記的甲硫氨酸;在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),添加的甲硫氨酸可以在SAM合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為甲基供體-SAM,從而在輕標(biāo)樣品和重標(biāo)樣品中引入不同的同位素標(biāo)簽。將輕標(biāo)樣品和重標(biāo)樣品按照1∶1混合,在基于質(zhì)譜的鑒定過程中,不同標(biāo)記的同一條甲基化肽段將成對(duì)出現(xiàn),它們除了相對(duì)分子質(zhì)量上的差異外,物理化學(xué)性質(zhì)基本一致。這一策略首先通過數(shù)據(jù)庫搜索鑒定肽段序列和修飾位點(diǎn),然后比較其一級(jí)譜的XIC(extracted ion current)圖,借助甲基化位點(diǎn)的定量信息進(jìn)一步確定甲基化位點(diǎn)。通過這一策略對(duì)鑒定的甲基化肽段進(jìn)行后續(xù)確認(rèn)，可以顯著提高位點(diǎn)鑒定的可信度。另外,在該策略中,同一條肽段相當(dāng)于通過兩張獨(dú)立的質(zhì)譜碎裂譜圖得到鑒定,進(jìn)一步增加了鑒定的可靠性。通過結(jié)合抗體富集和hM-SILAC策略,作者在宮頸癌細(xì)胞(HeLa)中共鑒定到33個(gè)甲基化蛋白質(zhì)上的59個(gè)甲基化位點(diǎn)。但由于甲基化抗體的富集特異性不是很高,所以鑒定的甲基化位點(diǎn)數(shù)目受到了限制。hM-SILAC策略可以顯著提高甲基化鑒定的可信度,但是這一方法也存在不足。首先,[13CD3]-甲硫氨酸不僅可以標(biāo)記發(fā)生甲基化的氨基酸殘基,它自身也會(huì)參與蛋白質(zhì)的合成,這就增加了后續(xù)數(shù)據(jù)庫檢索和分析的復(fù)雜性,也會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果的可信度造成影響。其次,SAM-依賴的蛋白質(zhì)甲基化伴隨著副產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸的產(chǎn)生。半胱氨酸合酶是細(xì)胞自身存在的一種重要的酶,能以甲基四氫葉酸酯作為甲基供體在高半胱氨酸上加一個(gè)甲基使其生成甲硫氨酸[36]。因此,雖然在細(xì)胞培養(yǎng)基中有標(biāo)記的甲硫氨酸,但無標(biāo)記的甲硫氨酸也可以由細(xì)胞自身合成,從而產(chǎn)生無標(biāo)記的SAM。細(xì)胞的這一生理過程使重標(biāo)樣品標(biāo)記不完全,從而使分析復(fù)雜化,而且會(huì)增加分析結(jié)果的假陰性。

圖 1 hM-SILAC策略的分析流程Fig. 1 Workflow of the hM-SILAC approach

圖 2 MILS策略的分析流程Fig. 2 Overview of workflow for the MILS strategy MILS: methylation by isotope labeled SAM; SAM: S-adenosyl methionine.

為了克服傳統(tǒng)的hM-SILAC標(biāo)記方法的缺陷,鄒漢法課題組與趙宗保課題組[37]合作發(fā)展了一種借助SAM營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株研究甲基化蛋白質(zhì)組的方法(見圖2)。釀酒酵母在敲除基因SAM1和SAM2后自身不能合成SAM。通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記的SAM直接標(biāo)記甲基化位點(diǎn)。然后利用在線多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)釀酒酵母中的甲基化蛋白質(zhì)和位點(diǎn)進(jìn)行全面的鑒定分析。在SAM缺陷型細(xì)胞中,甲硫氨酸不能轉(zhuǎn)變?yōu)镾AM,因而添加的SAM是唯一的甲基供體,成對(duì)的峰(色譜峰面積1∶1)只會(huì)出現(xiàn)在含甲基化修飾的肽段上,可以極大地提高鑒定的可信度。在該文章中,作者還提出了一種MILS(methylation by isotope labeled SAM)假陽性控制策略,極大地提高了鑒定的可信度。傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)篩選策略考慮所有鑒定的肽段或者是有修飾的肽段,通過調(diào)節(jié)打分值來控制鑒定結(jié)果的假陽性率。但在甲基化修飾的研究中,由于多個(gè)可變修飾的引入,檢索空間急劇增大,假陽性率也會(huì)隨之提高,這就需要很高的打分值才能確保最終結(jié)果的可信度,而這會(huì)損失掉大量的甲基化位點(diǎn)信息。但在MILS策略中,同一條甲基化肽段可以通過成對(duì)出現(xiàn)的、由輕標(biāo)和重標(biāo)引入的兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定,二級(jí)譜連續(xù)的b/y離子進(jìn)一步提高了鑒定的可信度。通過對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的甲基化蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面分析,共鑒定了43個(gè)甲基化蛋白質(zhì),包括分布在64個(gè)甲基化中心的68個(gè)甲基化事件。這一結(jié)果表明釀酒酵母中超過2.6%的蛋白質(zhì)可以發(fā)生甲基化修飾,這是迄今為止來自釀酒酵母的最全面的甲基化位點(diǎn)鑒定結(jié)果,發(fā)生在不同氨基酸殘基上的甲基化事件按數(shù)量排序如下:賴氨酸?精氨酸>天冬氨酸>天冬酰胺≈谷酰胺≈組氨酸>谷氨酸>半胱氨酸。此外,在重標(biāo)SAM標(biāo)記的樣品中基本上沒有鑒定到重標(biāo)甲硫氨酸,說明這一方法有效地克服了傳統(tǒng)hM-SILAC方法的缺陷,加入的重標(biāo)SAM并沒有轉(zhuǎn)化為重標(biāo)甲硫氨酸,極大地提高了鑒定結(jié)果的可信度。但由于該方法未經(jīng)過抗體富集,對(duì)低豐度甲基化修飾肽段可能存在漏檢,一些已知的甲基化事件并未鑒定到。Acuto研究組[25]提出了一種標(biāo)記策略iMethyl-SILAC(isomethionine methyl-SILAC)來避免含有甲硫氨酸肽段的干擾。在該策略中,作者利用兩種同位素標(biāo)記的甲硫氨酸(見圖3)對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。T淋巴細(xì)胞分別在含有不同同位素標(biāo)記的甲硫氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng),在收取細(xì)胞的時(shí)候按照細(xì)胞數(shù)目1∶1混合,然后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。通過iMethyl-SILAC標(biāo)記策略,酶解得到序列相同的甲基化肽段會(huì)帶有4 Da的相對(duì)分子質(zhì)量差異,并成對(duì)(1∶1)出現(xiàn),而序列相同的含有甲硫氨酸的肽段相對(duì)分子質(zhì)量基本相同,不會(huì)對(duì)甲基化肽段的假陽性率控制造成干擾。作者通過iMethyl-SILAC標(biāo)記策略獲得了比傳統(tǒng)hM-SILAC策略更好的假陽性控制結(jié)果。通過結(jié)合抗體富集和SCX分級(jí),作者從人源T細(xì)胞(human T cells)中共鑒定到1 257個(gè)蛋白質(zhì)上的2 502個(gè)精氨酸甲基化位點(diǎn),這是到目前為止單次實(shí)驗(yàn)鑒定的最大精氨酸甲基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

圖 3 iMethyl-SILAC策略中使用的甲硫氨酸的結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structures of the methionine used in the iMethyl-SILAC strategy iMethyl-SILAC: isomethionine methyl-stable isotope labelling by amino acids in cell culture.

雖然通過hM-SILAC策略可以極大地提高甲基化位點(diǎn)鑒定的可信度,但這類方法也存在一定的局限性。由于同位素標(biāo)簽是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中引入的,因而難以用于組織樣品中甲基化位點(diǎn)的標(biāo)記。為了實(shí)現(xiàn)組織樣品中甲基化修飾位點(diǎn)的高可信度鑒定,需要開發(fā)新的控制假陽性率的方法。

3 甲基化修飾的定量分析

蛋白質(zhì)甲基化一直被認(rèn)為是一種很穩(wěn)定的翻譯后修飾,直到2006年發(fā)現(xiàn)賴氨酸去甲基化酶[38],越來越多的證據(jù)表明蛋白質(zhì)的甲基化修飾是一類動(dòng)態(tài)調(diào)控的修飾類型[3]。研究不同生理狀態(tài)下甲基化水平的變化對(duì)于闡釋甲基化參與的調(diào)控過程十分重要,因而蛋白質(zhì)甲基化的研究越來越側(cè)重于定量水平的分析。Shawn研究組[30]利用HP1β富集以及SILAC標(biāo)記對(duì)DNA損傷修復(fù)過程中賴氨酸甲基化的動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行了研究,利用LC-MRM-MS策略[39]對(duì)14個(gè)蛋白質(zhì)上的19個(gè)賴氨酸甲基化位點(diǎn)在DNA損傷修復(fù)過程中的含量進(jìn)行了定量分析。在依托泊甙(etoposide)的刺激之下,DNA-PKcs(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase)第3 248位賴氨酸上的二甲基化含量上調(diào)了一百多倍,而蛋白質(zhì)Ku80第7位賴氨酸的三甲基化含量則下調(diào)了一百多倍。這一結(jié)果表明,賴氨酸的甲基化修飾是高度動(dòng)態(tài)變化的。Nielsen研究組[26]利用放線菌素-D(actinomycin D)抑制RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)合SILAC技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄過程中精氨酸甲基化的動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行了分析。他們的結(jié)果表明,在抑制轉(zhuǎn)錄的幾個(gè)小時(shí)之內(nèi),有部分精氨酸修飾位點(diǎn)的單甲基化水平出現(xiàn)了明顯的下調(diào),而這些位點(diǎn)的二甲基化水平和對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并沒有發(fā)生明顯的改變,這一結(jié)果表明精氨酸的單甲基化修飾可能存在著單獨(dú)的調(diào)控途徑。Nguyen研究組[28]利用賴氨酸單甲基化抗體和SILAC標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)正常的ESCC細(xì)胞和過表達(dá)SMYD2的ESCC細(xì)胞的賴氨酸單甲基化修飾水平進(jìn)行分析,利用LLY-507(5-cyano-2′-[4-[2-(3-methyl-1H-indol-1-yl)ethyl]-1-piperazinyl]-N-[3-(1-pyrrolidinyl)propyl]-[1,1′-biphenyl]-3-carboxamide)對(duì)SMYD2進(jìn)行抑制或者利用shRNA(short hairpin RNA)對(duì)SMYD2進(jìn)行基因沉默,發(fā)現(xiàn)了35個(gè)具有下調(diào)趨勢(shì)的賴氨酸單甲基化修飾位點(diǎn)。為了研究T細(xì)胞的激活是否會(huì)對(duì)精氨酸的甲基化水平造成影響,Acuto課題組[25]利用抗體富集與SILAC標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)激活前后的精氨酸甲基化修飾水平進(jìn)行了研究,共獲得365個(gè)甲基化肽段的定量信息,對(duì)應(yīng)202個(gè)蛋白質(zhì)上319個(gè)甲基化位點(diǎn)。另外,該研究組也對(duì)這些蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化進(jìn)行了分析,并利用對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的定量信息對(duì)甲基化肽段的含量變化進(jìn)行了校正,從而得到甲基化占有率方面的信息。他們的結(jié)果表明:27/282 (9.6%)的精氨酸甲基化位點(diǎn)的位點(diǎn)占有率確實(shí)因?yàn)門細(xì)胞的激活而發(fā)生了顯著性的變化。

目前,甲基化修飾的定量研究還處于比較初級(jí)的階段,主要集中在不同生理狀態(tài)下甲基化水平的差異分析上。甲基化修飾的絕對(duì)占有率對(duì)于深入研究甲基化的調(diào)控功能至關(guān)重要,這也是甲基化修飾定量研究的下一步努力方向。

4 展望

到目前為止,甲基化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究還是一個(gè)較新的領(lǐng)域。鑒于甲基化修飾在很多生理過程的調(diào)控中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用,而對(duì)甲基化修飾進(jìn)行高通量分析對(duì)于深入了解甲基化修飾的調(diào)控機(jī)理至關(guān)重要,所以甲基化修飾的研究方法還需要進(jìn)一步的發(fā)展。今后的研究重點(diǎn)包括開發(fā)選擇性更高的甲基化肽段分離方法、組織樣品中甲基化修飾位點(diǎn)的高可信度鑒定、甲基化修飾位點(diǎn)絕對(duì)占有率的分析,這些研究方向的突破也將為甲基化修飾組的規(guī)?；治黾瓣U釋甲基化參與調(diào)控的生理過程提供重要的技術(shù)支撐。

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Recent advances in proteomic analysis of protein methylation

WANG Keyun, YE Mingliang*, ZOU Hanfa#

(KeyLaboratoryofSeparationScienceforAnalyticalChemistry,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,NationalChromatographicResearchandAnalysisCenter,Dalian116023,China)

Protein methylation is one of the most important post-modificational modifications. Compared with the widely studied phoshporylation, glycosylation and ubiquitylation, the methylome analysis is still at nascent stage. In recent years, more and more attentions have been drawn to the researches of protein methylation for its important role in the epigenetic regulation and considerable advances have been achieved. Of them, the MS based proteomic approaches play a key role by achieving the high-throughput analysis of protein methylation. In this review, advances in proteomic analysis of protein methylation are summarized in three aspects: selective enrichment, identification confidence controlling and quantitative analysis.

protein methylation; selective enrichment; confidence controlling; quantitative proteomics; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08023

2016-08-22

基金委杰出青年基金(21525524);國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFA0501402).

Foundation item: National Science Fund of China for Distinguished Young Scholars (No. 21525524); China State Key Basic Research Program Grants (No. 2016YFA0501402). # 鄒漢法研究員已于2016年4月25日去世。他是我們的導(dǎo)師,也是我國杰出的分析化學(xué)家,在蛋白質(zhì)組等復(fù)雜體系的分離分析方面發(fā)展了多項(xiàng)具有原始創(chuàng)新意義的新型分析方法。蛋白質(zhì)甲基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,但是其分析水平還比較低,是鄒老師領(lǐng)導(dǎo)我們致力攻克的一個(gè)重要難題。謹(jǐn)以此文紀(jì)念鄒老師,希望我們能在不遠(yuǎn)的將來取得技術(shù)突破,解決這一分析難題。

O658

A

1000-8713(2016)12-1161-07

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0411)84379620,E-mail:mingliang@dicp.ac.cn.