曹志敏，張志肖，王彥，范保杰，劉長友，蘇秋竹，張麗，田靜

（河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊050035）

近紅外光譜法非破壞性測定綠豆籽粒粗蛋白質含量的研究

曹志敏，張志肖，王彥，范保杰，劉長友，蘇秋竹，張麗，田靜*

（河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊050035）

為了找到一種快速、簡單的測定綠豆品質的方法，利用瑞典波通（Perten）公司生產的DA7200二極管陣列近紅外光譜儀，以來自我國綠豆主產區(qū)的77份綠豆資源為試驗材料，對樣品進行光譜掃描，并測定了直鏈淀粉含量的參比數(shù)據(jù)。結果表明：定標集和檢驗集樣品的蛋白質含量預測值與化學測定值之間均呈極顯著的正相關，相關系數(shù)分別為0.9772和0.9631；所建定標模型具有較高的預測精度。本研究利用近紅外光譜儀對完整綠豆粗蛋白質的分析，可直接用于育種材料選擇以及突變體篩選和種質資源的評價等研究。

近紅外光譜法；綠豆；粗蛋白質；定標

中國綠豆栽培歷史悠久，種質資源豐富，近年來總產量保持在83萬～97萬t，居世界前列[1]。綠豆除直接作為糧食食用外，還是重要的食品工業(yè)原料，可用于制作綠豆芽、綠豆糕和綠豆粉絲等產品。綠豆蛋白質含量為21%～28%，高于主要糧食作物水稻、小麥和玉米，是植物蛋白的重要來源[2]。利用常規(guī)方法分析農產品和食品品質時，不僅費時、費力，而且成本高。近紅外反射光譜（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）技術是近20 a年來發(fā)展較快的光譜分析技術之一，具有樣品前處理簡單、快速，可同時測定1種或多種化學成分含量的特點[3]，已經(jīng)在農業(yè)、食品、石油、化工、醫(yī)藥等多個領域得到了廣泛應用[4，5]。近年來，該技術的無損特點尤其引人注目，特別是農作物種子品質測定完成后，樣品不僅完好無損，而且還能保持種子活力。因此，NIRS技術在作物育種、種子質量檢測、種質資源創(chuàng)新等領域顯現(xiàn)出良好的應用前景[6～8]。

NIRS技術用于測定豆類品質研究已經(jīng)取得了一定進展。Willams等[9]以豆類為試驗材料，建立了NIRS的預測模型并應用于豆類的蛋白質育種中。Berardo等[10]利用NIRS技術同時測定了木豆中蛋白質、有機質等6種組分的含量，結果顯示，化學值與預測值之間顯著性較高（R2＞0.96）。Patil等[11]利用NIRS無破損技術測定了大豆的脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)不同類型的脂肪酸含量預測效果有所不同。然而，截至目前，該技術在綠豆籽粒品質鑒定方面的研究尚未見報道。

以77份綠豆資源的籽粒為試材，分別利用化學法和NIRS技術進行粗蛋白質含量測定，以化學法測定值為對照，分析了NIRS技術用于綠豆蛋白質含量測定的準確性及其用于實際檢測的可行性，并構建了綠豆蛋白質的近紅外模型，以預測綠豆各類材料的蛋白質含量。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗綠豆資源共77份（表1），來自中國綠豆主產區(qū)河北、河南、湖北、湖南、內蒙古、山西、遼寧等省份，在品種來源、蛋白質含量、農藝特性上具有較好的代表性。2014年6～10月在河北省農林科學院糧油作物研究所堤上試驗站統(tǒng)一種植，每份材料均種植2行，行長4.2 m，田間管理同大田常規(guī)。綠豆成熟后收獲，晾曬、脫粒、清選后，挑選完整籽粒，備用。

近紅外光譜儀采用瑞典波通（Perten）公司生產的DA7200二極管陣列近紅外光譜儀，帶有漫反射旋轉樣品杯。

1.2試驗方法

1.2.1籽粒蛋白質含量的化學測定每份材料均取籽粒50 g，采用NY/T 3—1982《谷類、豆類作物種子粗蛋白質測定法（半微量凱氏法）》[12]，測定籽粒的蛋白質含量。

1.2.2籽粒蛋白質含量的近紅外光譜分析

1.2.2.1樣品原始光譜數(shù)據(jù)的采集。對77份綠豆樣品在波長950～1 650 nm范圍內采集光譜，采樣間隔為2.0 nm，光程18，掃描10次，并做樣品平行試驗，取平均光譜值用于近紅外光譜分析。掃描溫度控制在21～25℃。

1.2.2.2近紅外光譜分析模型的建立。利用定標樣品集，比較不同光譜區(qū)間和光譜預處理方法對模型定標相關系數(shù)的影響，選擇合適光譜區(qū)間和利用偏最小二乘法預處理方法，以便建立準確的定標模型。

1.2.2.3近紅外光譜定標模型的驗證。將來自國家食用豆產業(yè)技術體系聯(lián)合鑒定的10個綠豆樣品作為驗證樣品集。以驗證集籽粒樣品作為未知樣品進行預測，比較模型預測值與化學測定值之前的相關性，通過相關系數(shù)大小驗證模型的預測能力。

2　結果與分析

2.1參試綠豆籽粒蛋白質含量的化學測定結果

參試綠豆材料的籽粒蛋白質含量為22.04%～27.97%（表1），差異較大，平均值為24.68%。樣品的蛋白質含量范圍基本覆蓋了綠豆種質蛋白質含量的常態(tài)分布范圍，具有良好的連續(xù)性與代表性，滿足近紅外光譜定標條件的要求。

表1　采用化學法測定的綠豆籽粒蛋白質含量（%）Table1　The protein content of mungbean tested by chemical method

2.2定標模型的建立

2.2.1近紅外光譜的采集與光譜范圍的選擇利用近紅光譜儀在波長950～1 650 nm范圍內掃描77份綠豆樣品，得到綠豆籽粒的原始近紅外光譜。結果（圖1）顯示，不同樣品的原始吸收光譜形狀基本相似。參試綠豆均分別在1 200 nm處和1 450 nm處出現(xiàn)了強烈的吸收峰，與綠豆種子含有較多的淀粉和蛋白質有關。其中，在1 200 nm處出現(xiàn)的強烈吸收峰，應該是C-H鍵伸縮振動的二級倍頻吸收帶；在1 450 nm處出現(xiàn)的強烈吸收峰，應該是N-H鍵伸縮振動的一級倍頻吸收帶。

由于不同光譜區(qū)間的蛋白質吸收強度有所差異，因此，選擇的光譜區(qū)間會直接影響所建分析模型的準確度。采用1階求導加散射校正（SNV）的預處理方法對原始近紅外光譜進行處理，得到處理后的近紅外光譜。結果（圖2）顯示，77條光譜曲線在波長900～1 200 nm范圍內一致性較差；而在波長＞1 200 nm時，光譜趨勢相同，一致性較好，未出現(xiàn)光譜異?，F(xiàn)象。因此，選取波長＞1 200 nm的光譜區(qū)間用于光譜分析與定標模型建立。

圖1　綠豆的原始近紅外光譜Fig.1　NIR original spectra of all samples

圖2　1階求導垣SNV處理后的綠豆近紅外光譜Fig.2　The spectra after 1 derivative垣SNV

2.2.2定標模型的建立利用PLS，依據(jù)化學測定結果，通過一元線性回歸，得出本研究的定標方程為y=1.09+0.955x（圖3），相關系數(shù)為0.977 2。可以看出，綠豆蛋白質含量預測值與化學值之間呈極顯著的正相關。說明定標集的預測值與化學測定值之間具有顯著的線性關系。

2.3定標模型檢驗

根據(jù)驗證集樣品蛋白質含量的化學測定值和模型預測值（表2），通過線性回歸，得到二者之間的相關方程為y=1.015 5x-0.414 8（圖4），相關系數(shù)為0.963 1，趨勢線的斜率為1.105 5，二者均接近于1。說明2種方法測定的結果一致性較高，蛋白質含量預測值與化學測定值較吻合。

圖3　綠豆蛋白質含量預測值與化學測定值之間的相關性Fig.3　The correlation of protein content of mungbean tested by two methods

表2　綠豆蛋白質含量化學測定值與模型預測值的比較（%）Table2　Compared of protein content of mungbean tested by two methods

圖4　驗證樣品蛋白質含量化學測定值與模型預測值之間的相關性Fig.4　The correlation of protein content the true and prediction in mungbean

3　結論與討論

陸艷婷等[13]認為近紅外光譜分析建模過程中選擇適當?shù)亩藰悠窋?shù)量十分重要，數(shù)量過多，雖然可以獲得準確的預測模型，但前期工作量大；而數(shù)量過少，則建模時往往主成分數(shù)偏少，易出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，預測效果差。方彥[14]利用40份玉米籽粒應用近紅外光譜和偏最小二乘回歸法預測了玉米的淀粉含量，校正數(shù)據(jù)集和獨立的檢驗數(shù)據(jù)集的預測值與實際測定值之間的相關系數(shù)分別達到了0.961 0和0.982 0，所建校正模型具有較高的預測精度和較好的推廣性，為快速、無損測定玉米籽粒淀粉含量提供了新途徑。本研究以品種來源、蛋白質含量、農藝特性具有較好代表性的77份綠豆資源為試材，采用偏最小二乘法，分析了利用近紅外光譜法測定綠豆籽粒蛋白質含量的可行性。結果顯示，近紅外分析結果與化學測定值之間具有高度的相關性（r=0.977 2），說明所建定標模型具有較高的預測準確性[15]。影響近紅外分析準確性的因素有很多[16]，包括樣品的組分含量、樣品數(shù)量、樣品的物理特性、樣品預處理方法、測試條件和儀器自身等。充分考慮各因素的影響，并采取相應的預防措施，所建立的預測模型將具有更高的可靠性與適用性。為了擴大預測范圍，應對模型進行不斷地維護，注意搜集綠豆資源，使綠豆樣品蛋白質含量能覆蓋綠豆生產或育種材料中成分的變化范圍，以便進一步優(yōu)化模型，使定標方程具有廣泛的應用范圍。

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Non-destructive Test of Crude Protein in Mungbean Grain by Near Infrared Reflectance Spectroscopy

CAO Zhi-min，ZHANG Zhi-xiao，WANG Yan，F(xiàn)AN Bao-jie，LIU Chang-you，SU Qiu-zhu，ZHANG Li，TIAN Jing*
（Institute of Cereal and Oil Crops，Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050035，China）

The feasibility of measuring crude protein contents in intact seeds of mungbean by using near infrared reflectance spectroscopy（NIRS）was studied.In order to find a quick and easy method.The chemometric method of partial least square（PLS）was used.The results showed that there was a remarkable positive correlation between the predicted values and the chemical values.The correlation coefficients to chemical values in calibration set and validation set were 0.977 2 and 0.963 1，respectively.This study can be directly used for breeding material selection，mutant screening and evaluation of germplasm resources of research.

NIRS；Mungbean；Crude protein；Calibration

S522

A

1008-1631（2016）05-0104-05

2016-03-30

國家食用豆產業(yè)技術體系項目（CARS-09-G2）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2014BAD07B05-03）；河北省農業(yè)科技成果轉化資金項目（2014GB2A200322）；河北省科技計劃項目（14226303D）

曹志敏（1975-），女，河北石家莊人，副研究員，主要從事食用豆育種及產后加工研究。E-mail：baby.cao@163.com。

田靜（1964-），女，河北石家莊人，研究員，碩士，主要從事作物育種研究。