翁幸鐾，糜祖煌，王春新，朱健銘

（1.寧波市第一醫(yī)院 檢驗科，浙江 寧波 315010；2.無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所 生物信息學(xué)室，江蘇無錫 214026；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院 檢驗科，江蘇 無錫 214023；4.杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院 檢驗科，浙江 杭州 311106）

高通量全基因組測序法對尿道致病性大腸埃希菌NB8株毒力因子數(shù)據(jù)的初步分析

翁幸鐾1，糜祖煌2，王春新3，朱健銘4

（1.寧波市第一醫(yī)院 檢驗科，浙江 寧波 315010；2.無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所 生物信息學(xué)室，江蘇無錫 214026；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院 檢驗科，江蘇 無錫 214023；4.杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院 檢驗科，浙江 杭州 311106）

目的：調(diào)查1株尿道致病性大腸埃希菌（UPEC）NB8株攜帶的毒力因子和可能存在的致病機制。方法：UPEC NB8株分離自2012年4月寧波市第一醫(yī)院住院患者尿液標(biāo)本，做16SrDNA和gyrA基因測序BLASTn比對確認(rèn)為UPEC，用Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM這2種大規(guī)模并行測序儀進行全基因組分析，再進行人工測序補缺口。再對NB8株做毒力因子數(shù)據(jù)挖掘和分析，最后把NB8株和9株全基因組測序的UPEC的毒力因子做比較基因組學(xué)研究。結(jié)果：UPEC NB8株全基因組測序得到一條推定的染色體序列，長4 550 369 bp（內(nèi)含14個缺口）。推定的質(zhì)粒序列，長635 377 bp（內(nèi)含33個缺口）。NB8株全基因組中挖掘出黏附（黏附素、P菌毛、1型菌毛、大腸埃希菌共同菌毛）、鐵攝取系統(tǒng)（產(chǎn)氣菌素、血紅素攝取、腸桿菌素）、蛋白酶（分泌自轉(zhuǎn)運毒素）、毒素（溶血素）、抗原43、SHI-2毒力島等多種毒力因子。結(jié)論：UPEC NB8株中檢出的多種毒力因子可能會在細(xì)菌黏附、侵襲、溶細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性等方面起著重要作用，并能增強細(xì)菌的生存能力和致病力，導(dǎo)致宿主的泌尿道感染。全基因組測序技術(shù)具有超高速、高通量、低成本和高效益的優(yōu)勢，值得推廣。

大腸埃希菌；全基因組；多藥耐藥；尿道致病性；毒力因子

每年超過800萬美國女性受尿道致病性大腸埃希菌（uropathogenic Escherichia Coli，UPEC）感染而產(chǎn)生泌尿道感染（urianary tract infaction，UTI）癥狀[1]，33%女性在24歲時已有UTI史并接受抗生素治療，超過半數(shù)的女性在一生中曾有過UTI史[2]，大于80%的UTI由UPEC引起[3]。急性UTI可致急性膀胱炎和急性腎盂腎炎，最終甚至可致腎衰竭、尿毒癥。國內(nèi)對UPEC的研究較少，我們曾報道了用PCR法對1組28株多耐藥UPEC做了β-內(nèi)酰胺類[4-5]、氨基糖苷類[6]、喹諾酮類耐藥基因[7]、抗菌制劑外排泵基因[8]、可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記[9]介導(dǎo)的分子耐藥機制研究和幾種毒力因子[10]介導(dǎo)的分子致病機制研究。為了更深入了解UPEC的遺傳學(xué)背景，本研究分別采用了Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM這2種大規(guī)模并行測序儀對1株多耐藥UPEC NB8株進行全基因組分析，并從全基因組序列中挖掘了多種毒力因子，現(xiàn)報告如下。

1　材料和方法

1.1菌株來源 UPEC NB8株分離自2012年4月寧波市第一醫(yī)院高干病房1名83歲女性住院患者的尿液標(biāo)本。該患者因“尿路感染”住院，立即予以哌拉西林/他唑巴坦進行治療，但患者病情迅速惡化并死亡。該菌株先用法國生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套革蘭陰性菌鑒定卡進行鑒定，再作16SrDNA和gyrA基因測序，經(jīng)GenBank比對進一步確認(rèn)為UPEC。

1.2藥物敏感性試驗 采用法國生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套革蘭陰性菌藥敏卡進行16種藥物敏感性檢測；紅霉素、四環(huán)素、美羅培南的藥敏試驗采用紙片擴散法，M-H瓊脂為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。再根據(jù)2012年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)進行抗菌藥物敏感性判斷。NB8株對氨芐西林（≥32）、頭孢唑啉（≥64）、頭孢曲松（≥64）、頭孢他啶（≥64）、頭孢吡肟（≥64）、氨曲南（≥64）、頭孢替坦（≥64）、氨芐西林/舒巴坦（≥32）、慶大霉素（≥16）、妥布霉素（≥16）、丁胺卡那（≥64）、環(huán)丙沙星（≥4）、左氧氟沙星（≥8）、復(fù)方新諾明（≥320）、紅霉素（7 mm）、四環(huán)素（7 mm）均耐藥；對哌拉西林/他唑巴坦（64）、頭孢哌酮/舒巴坦（17 mm）中介；對亞胺培南（≤1）、美羅培南（27 mm）敏感。

1.3全基因組測序

1.3.1測序策略：樣本DNA采取隨機散彈式打斷來構(gòu)建DNA文庫，并使用Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM這2種平臺進行測序。組裝之后再利用PCR等方法進行補缺口。

1.3.2測序流程：在Illumina HiSeq平臺的測序流程，取1 μg的genomic DNA，利用Nebulization方法將DNA打斷成約800 bp的片段，純化后接上PE adaptors然后進行雙向定序，得到序列數(shù)據(jù)。在Ion Torrent PGM平臺的測序流程，取100 ng的genomic DNA，利用Ultrasonication方法將DNA打斷成約400 bp的片段，純化后接上adaptor。然后個別與磁珠上的adaptor雜合并進行擴增，最后在314半導(dǎo)體芯片上進行定序反應(yīng)，得到序列數(shù)據(jù)。

1.3.3組裝結(jié)果：使用軟件將clean reads先進行de novo組裝后，得到的contigs除了利用paired-end information得到scaffolds之外，再與參考基因組：大腸埃希菌SE15（Accession number：NC_013654）進行對照與排列順序，可以得到1條推定的染色體（有缺口）。全基因組測序委托中國臺灣基龍米克斯生物科技股份有限公司進行。

1.3.4補缺口：針對缺口設(shè)計引物，得到PCR產(chǎn)物后再使用Sanger測序法，將大部分缺口補起來。

1.4生物信息分析

1.4.1基因注釋：使用Glimmer v3.02與prokaryotic GeneMark.hmm v2.10f對推定的染色體與contigs進行ORF預(yù)測（Start codons使用ATG & GTT；Stop codons使用TAG & TGA & TAA），并利用RBSfinder程序找出基因的轉(zhuǎn)錄起始點附近的核糖體連接位點。使用RNAmmer（v1.2）與tRNAscan-SE（v1.23），進行rRNA & tRNA基因的預(yù)測。

1.4.2功能注釋：將預(yù)測出的基因段落轉(zhuǎn)成蛋白質(zhì)序列分別與NCBI的nr & microbial RefSeq protein databases & COG databases以及KEGG的protein database進行BLASTP比對，得到基因注釋。

1.5毒力因子比較基因組學(xué)研究 把NB8株和9株完成全基因組測序的UPEC做毒力因子的比較基因組學(xué)研究。

2　結(jié)果

2.1全基因組組裝結(jié)果 UPEC NB8株經(jīng)Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM測序儀進行平行測序，2種儀器測得序列合并組裝后PCR法補缺口。最終得到1條推定的染色體序列，長4 550 369 bp（內(nèi)含14個缺口）。推定的質(zhì)粒序列，長635 377 bp（內(nèi)含33個缺口）。

2.2全基因組功能注釋結(jié)果 COG基因功能分類提示NB8株的功能基因共有3 922個，按功能分為3類：代謝類基因最多，共1 643個（占41.89%），其中糖類轉(zhuǎn)運和代謝基因371個（占9.46%），氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝基因359個（占9.15%），產(chǎn)能和儲能基因275個（占7.01%），無機鐵轉(zhuǎn)運和代謝基因245個（占6.25%），輔酶轉(zhuǎn)運和代謝基因147個（占3.75%）；第2類為信息儲存和處理基因，共629個（占16.03%），其中轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因242個（占6.17%），復(fù)制、重組和修復(fù)基因208個（占5.30%），翻譯、染色體結(jié)構(gòu)和起源基因177個（占4.51%）；第3類為細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，共860個（占21.92%），其中細(xì)胞壁/膜/外殼起源基因239個（占6.09%），翻譯修飾、蛋白翻轉(zhuǎn)、分子伴侶基因基因142個（占3.62%），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因137個（占3.49%），細(xì)胞內(nèi)運輸，分泌和小泡運輸基因129個（占3.29%），細(xì)胞運動基因122個（占3.11%）。另有功能預(yù)測基因460個，功能未知基因330個。用KEGG反應(yīng)代謝通路分析也得到類似的結(jié)果。同源蛋白來源物種表提示NB8株來源于大腸埃希菌的蛋白有5 003個，占97.5%，還有少量的蛋白可能來源于肺炎克雷伯菌、沙門菌和志賀菌等，需要做進一步的群體遺傳學(xué)分析。NB8株全基因組中挖掘出黏附（黏附素、P菌毛、1型菌毛、大腸埃希菌共同菌毛）、鐵攝取系統(tǒng)[產(chǎn)氣菌素、血紅素攝?。–hu）、腸桿菌素]、蛋白酶[分泌自轉(zhuǎn)運毒素（Sat）]、毒素（溶血素）、抗原43、SHI-2毒力島等多種毒力因子，見表1。對于細(xì)菌分泌系統(tǒng)通路，NB8株參與I、 II、 IV、V 4種分泌系統(tǒng)通路，主要參與 II型分泌系統(tǒng)，見圖1。NB8株攜帶的FliD與菌毛帽相關(guān)，F(xiàn)lgL和FlgK與鉤-菌毛結(jié)合相關(guān)，F(xiàn)lgF、FlgB、FlgC與近端桿相關(guān)，F(xiàn)lgG與遠(yuǎn)端桿相關(guān)，F(xiàn)lgH與L環(huán)相關(guān)，F(xiàn)lgI與P環(huán)相關(guān)，F(xiàn)liF與MS環(huán)相關(guān)，F(xiàn)liG、FliN與C環(huán)相關(guān)，F(xiàn)lhA、FlhB與鞭毛輸出裝置相關(guān)，F(xiàn)liI、FliP與 III型分泌系統(tǒng)相關(guān)，MotA、MotB與鞭毛馬達(dá)相關(guān)，見圖2。

將NB8和NCBI中9株已完成全基因組測序的UPEC，共10株菌做了毒力因子比較基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)這10株菌都有黏附、自轉(zhuǎn)運蛋白、侵襲、鐵攝取、毒素等多種毒力因子，但NB8株攜帶的菌毛基因和ACE T6SS較少，鐵攝取基因非常豐富，見表2。

表1　UPEC NB8株全基因組測序后毒力因子挖掘

續(xù)表1

3　討論

本研究中的NB8株因產(chǎn)生高毒力，導(dǎo)致患者病情迅速惡化后死亡，因此，挖掘并分析NB8株攜帶的多種毒力因子就有重要的研究價值。UPEC致病性強、黏附力強、難以清除，使得泌尿道感染病情反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，其中菌毛在黏附、侵襲等方面起著重要作用。常見的菌毛主要包括1型菌毛和P菌毛，本研究均有檢出。其中1型菌毛最常見，90%的菌株均有攜帶。由fim基因編碼的Fim蛋白位于1型菌毛的頂端，可以識別泌尿道上皮的甘露糖受體，并與之結(jié)合，使大腸埃希菌吸附于膀胱上皮細(xì)胞起關(guān)鍵作用[12]，避免因震蕩、沖刷而脫離黏膜上皮，為進一步侵入機體創(chuàng)造條件。pap基因編碼的P菌毛是UPEC黏附定植的關(guān)鍵因子，有助于細(xì)菌與上尿路泌尿道上皮細(xì)胞的黏附并能直接介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。

圖1　UPEC NB8株全基因組中細(xì)菌分泌系統(tǒng)通路圖

除了菌毛，UPEC的致病性還取決于從宿主體內(nèi)競爭鐵的能力，UPEC在環(huán)境中獲得所需的鐵，能增強其生存能力和致病力。一種直接的攝鐵方式是從血紅素或含血紅素蛋白中競爭鐵離子，UPEC血紅素的利用是由chu基因簇（ccmA、B、C、D基因）編碼一系列蛋白，參與轉(zhuǎn)運血紅素到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)還有后續(xù)的加工處理。第二種是間接的攝鐵機制，是利用鐵結(jié)合復(fù)合物，它們能高親和性地結(jié)合鐵離子。第三種攝鐵機制是分泌一些低分子量鐵載體，將鐵轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)。fep是腸桿菌素的轉(zhuǎn)運基因，本研究檢出的fepC為ATP結(jié)合蛋白，編碼高鐵腸桿菌素轉(zhuǎn)運ATP結(jié)合蛋白，該基因簇與鐵載體—腸桿菌素的轉(zhuǎn)運有關(guān)。iuc基因簇（iucA、iucB、iucC）和鐵載體相關(guān)，其中iucA和含鐵產(chǎn)氣菌素一個特定的外膜受體蛋白的表達(dá)相關(guān)，iucB和產(chǎn)氣菌素的合成相關(guān)[14]。上述3種攝鐵方式在本研究中均有檢出，提示NB8株有強大的攝取鐵能力來增強其致病力。分泌自轉(zhuǎn)運毒素（Sat）對膀胱和腎臟來源的細(xì)胞具有毒性：能引起腎臟的嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致腎小球膜的溶解，腎小管上皮細(xì)胞的操作和腎臟組織的空泡化[15]。本研究檢出3種絲氨酸蛋白酶自轉(zhuǎn)運體基因，50% UPEC能檢出hlyA編碼的α-溶血素，HlyD屬于膜融合蛋白，是α-溶血素分泌途徑特異性通道蛋白。成熟的α-溶血素進入宿主細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放，具有溶細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性[16]。

抗原43是大腸埃希菌表達(dá)的一種表面抗原蛋白分子，具有強大的免疫原性，含有多種T細(xì)胞和B細(xì)胞表位[17]。SHI-2毒力島基因來源于志賀氏菌，位于selC基因下游，主要介導(dǎo)鐵結(jié)合蛋白產(chǎn)氣菌素的合成和運輸[18]，本研究檢出雙拷貝SHI-2毒力島基因。

把NB8株和NCBI中9株已完成全基因組測序的UPEC，共10株菌做了毒力因子比較基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)這10株菌都有黏附、自轉(zhuǎn)運蛋白、侵襲、鐵攝取、毒素等多種毒力因子，但NB8株攜帶的菌毛基因和ACE T6SS較少，提示NB8株人黏附能力和細(xì)菌分泌功能較弱，需要進一步做功能驗證。而鐵攝取基因非常豐富，提示NB8株有強大的攝取鐵能力來增強其致病力。

圖2　NB8株全基因組中鞭毛裝配通路圖

表2　10株UPEC全基因組測序后毒力因子比較基因組學(xué)研究

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

與傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)相比，新一代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)具有超高速、高通量、低成本、高效益、無需設(shè)計引物、能檢出基因的多拷貝和新基因等優(yōu)勢。NGS技術(shù)已經(jīng)用在細(xì)菌毒力因子挖掘的研究中[19]。現(xiàn)有NGS技術(shù)缺憾為測序儀讀序列（reads）長度較短，通常會包含錯誤。當(dāng)基因組中出現(xiàn)大量短的重復(fù)序列時即無法正準(zhǔn)拼接序列，不能測通全長染色體而出現(xiàn)缺口。NB8株經(jīng)Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM儀器測得序列合并組裝后PCR法補缺口，最終得到推定的染色體序列中有14個contig之間的順序及正反關(guān)系均未知，因此含14個缺口，同理推定的質(zhì)粒序列含33個缺口。全基因組測序理論上可測出細(xì)菌的全部染色體和質(zhì)粒序列，可讀出全部功能基因，包括耐藥基因和臨床醫(yī)師深度關(guān)切的與細(xì)菌致病性相關(guān)的毒力基因，故全基因組分析在國內(nèi)外已逐步用在細(xì)菌的耐藥機制和致病機制，以及耐藥菌傳播途徑分析中[20-21]。

本研究對UPEC NB8株毒力因子進行了初步的生物信息學(xué)分析，后續(xù)會進一步做毒力因子的功能驗證，以明確毒力因子的機制和致病機制。

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（本文編輯：吳彬）

Data analysis of virulence factors in uropathogemic Escherichia coli NB8 by whole genome sequencing

WENG Xingbei1, MI Zuhuang2, WANG Chunxin3, ZHU Jianming4. 1.Department of Medical Laboratory, Ningbo First Hospital, Ningbo, 315010; 2.Department of Bioinformation, W uxi Clon-Gen Techonology Institute, Wuxi, 214026; 3.Department of Medical Laboratory, Wuxi People’s Hospital Aff liated to Nanjing Medical University, Wuxi, 214023; 4.Department of Medical Laboratory, Hangzhou Yuhang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou, 311106

Objective: To investigate virulence factors and pathogenic mechanisms in uropathogemic Escherichia coli (UPEC) NB8. Methods: UPEC NB8 was collected from urine sample of an inpatient in Ningbo First Hospital, in April, 2012. Sequencing gyrA and parC, BLASTn algorithm were performed to identify E.coli. Then, whole genome were sequenced by Illumina HiSeq and Ion Torrent PGM, and PCR was performed to fi ll gaps. Data mining of virulence factors were performed, and comparative genomics of virulence factors in NB8 and 9 strains of UPEC after whole genome sequencing were performed. Results: By whole genome sequencing, a putative chromosome sequence (14 gaps inside) was 4 550 369 bp, a putative plasmid sequence (33 gaps inside) was 635 377 bp. Some classes of virulence factors were positive in NB8, including adhesion (adhesin, type P fi mbriae, type I fi mbriae, Escherichia coli common pilus), iron uptake(aerobactin, heme, enterobactin), protease (secreted autotransporter toxin), toxin (hemolysin), Ag43, SHI-2 pathogenicity island protein. Conclusion: Virulence factors in UPEC NB8 played an important role in adhesion, invasion, cell viability, cell toxicity, and contribute to enhance the survival and virulence of the bacteria, so lead to urinary tract infection. Whole genome sequencing technology has the advantages of high speed, high throughput, low cost and high effi ciency, which is worth of promoting.

Escherichia coli; whole genome; multi-drug resistance; uropathogemic; virulence factor

R378.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.11.004

2016-01-27

寧波市自然科學(xué)基金資助項目（2012A610186）；浙江省中醫(yī)藥資助項目（2011ZB126）。

翁幸鐾（1980-），男，浙江寧波人，副主任技師。