吳佩亮，王良興，黃曉穎

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科 呼吸循環(huán)重點實驗室，浙江 溫州 325015）

不同動脈血采集方法對小鼠血氣分析結(jié)果的影響

吳佩亮，王良興，黃曉穎

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科 呼吸循環(huán)重點實驗室，浙江 溫州 325015）

目的：對比研究不同動脈血采集方法對小鼠動脈血氣、電解質(zhì)及生化指標的影響，以期篩選出小動物血氣分析的理想采血途徑。方法：將90只雄性Balb/c小鼠按體質(zhì)量隨機分為頸總動脈插管組、腹主動脈穿刺組、經(jīng)皮左心室穿刺組，分別采集動脈血，記錄成功率、動物損傷程度，并經(jīng)微量血氣分析儀檢測血氣、電解質(zhì)及生化指標，觀察不同動脈血采集方法對上述指標的影響。結(jié)果：經(jīng)皮左心室穿刺組切口長度、動脈血采集時間、成功率、血氧分壓（PaO2）、血氧飽和度（SaO2）、氧合血紅蛋白（O2Hb）均顯著低于頸總動脈插管組和腹主動脈穿刺組，去氧血紅蛋白（RHb）顯著高于頸總動脈插管組和腹主動脈穿刺組（P＜0.05）。腹主動脈穿刺組血K+濃度顯著高于頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組，而血Na+濃度、血Cl-濃度顯著低于頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組（P＜0.05）。腹主動脈穿刺組血糖（Glu）、血乳酸（Lac）濃度顯著高于頸總動脈插管組（P＜0.05）。經(jīng)皮左心室穿刺組血紅蛋白總濃度（tHb）、堿剩余（cBase）顯著低于腹主動脈穿刺組，標準碳酸氫根（SBC）濃度顯著高于腹主動脈穿刺組（P＜0.05）。結(jié)論：有創(chuàng)右側(cè)頸總動脈插管法采集動脈血對血氣、電解質(zhì)、生化指標影響較小，且操作方便、用時較短、插管穩(wěn)定性強、成功率高、創(chuàng)傷小、重復(fù)性好，值得推廣應(yīng)用。

頸總動脈；腹腔動脈；心臟；血氣分析；小鼠

動脈血氣分析所測的血氣、電解質(zhì)、生化是呼吸系統(tǒng)疾病中最常見的觀察指標之一[1-4]，可以反映機體通氣功能、換氣功能（主要是缺氧和二氧化碳潴留情況）、電解質(zhì)紊亂程度及機體的酸堿狀態(tài)。動脈血氣分析及生化檢測對于評估動物模型復(fù)制是否成功、評價藥效和機體呼吸功能具有重要意義。查閱國外文獻，大小鼠動脈血氣分析多采用機械通氣開胸采集動脈血[5]、股動脈采血[6-7]、腹主動脈穿刺采血[8]，其中開胸采集動脈血具有創(chuàng)傷大、設(shè)備要求高等缺點，并且既往文獻未見詳細介紹操作步驟。本研究采用有創(chuàng)右側(cè)頸總動脈插管、有創(chuàng)腹主動脈穿刺、經(jīng)皮左心室穿刺3種方法分別測定Balb/c小鼠的動脈血氣指標，詳細闡述操作方法，并對比分析研究3種不同方法的操作難易程度、成功率、動物損傷程度及其對動脈血氣、電解質(zhì)及相關(guān)生化指標的干擾和影響，以期篩選出小動物血氣分析的理想采血途徑。

1　材料和方法

1.1實驗動物及分組 健康清潔級雄性Balb/c小鼠90只，體質(zhì)量20～25 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，按體質(zhì)量隨機分成3組，每組30只：頸總動脈插管組、腹主動脈穿刺組、經(jīng)皮左心室穿刺組。本研究通過動物實驗倫理委員會批準。

1.2實驗器械、藥品、儀器 顯微鑷，顯微剪，自制PE微導(dǎo)管（內(nèi)徑0.28 mm，外徑0.61 mm），自制動脈血氣采血針套裝，三通閥，直鑷，彎鑷，眼科剪，動脈夾，肝素鈉生理鹽水（10 U/mL）[9]，20%烏拉坦，III- 0絲線，NIKON SMZ745T解剖顯微鏡，Radiometer ABL90微量血氣分析儀，血氣-電解質(zhì)試劑包（批號：YZB/DEN 1889-2014），血氣-電解質(zhì)試劑卡（批號：YZB/DEN 3691-2014）。

1.3小鼠動脈血采集套裝的制作及使用 取一段10 cm長PE微導(dǎo)管，尾端連接5號注射器針頭以方便連接三通閥，保證導(dǎo)管暢通。三通閥的一端連接5 mL注射器，另一端連接1 mL注射器。具體使用方法：在使用自制動脈血氣套裝采集動脈血以前，將關(guān)閉閥（OFF）指向5 mL注射器，然后將PE微導(dǎo)管置于肝素鈉生理鹽水中，用1 mL注射器抽取肝素鈉生理鹽水0.5～1 mL，完全濕潤整個針管后棄去肝素稀釋液，使1 mL注射器的活塞位于1 mL刻度線位置，再將關(guān)閉閥（OFF）指向微導(dǎo)管位置，隨后用5 mL注射器反復(fù)抽吸，將1 mL注射器抽成預(yù)真空狀態(tài)待用，見圖1。

1.4小鼠動脈血標本采集方法

圖1　自制小鼠動脈血采集裝置

1.4.1右側(cè)頸總動脈插管法：小鼠腹腔注射20%烏拉坦溶液（1 mL/100 g），用膠布將小鼠四肢仰臥固定在木板上。酒精消毒皮膚后，沿頸部正中線由上至下剪開皮膚約1.5 cm，用組織鑷沿胸骨乳突肌前緣分離胸骨舌骨肌與胸骨甲狀肌之間的結(jié)締組織，在氣管旁右深側(cè)即可見到搏動的頸總動脈，用玻璃分針將伴行的神經(jīng)分離，沿血管走行方向分離出長約1.5 cm頸總動脈，遠心端絲線結(jié)扎，近心端用動脈夾夾住并穿一根絲線備用，將鼠板移至解剖顯微鏡下，用顯微剪在動脈靠近遠心端輕剪一“V”字形向心切口，長度約為動脈直徑的1/2，與血管長軸約成30～45°角，左手持顯微鑷提起切口，右手持已肝素化的預(yù)真空動脈血采集裝置，將PE微導(dǎo)管插入動脈并用備用絲線打結(jié)固定，松開動脈夾，將預(yù)真空動脈血采集套裝關(guān)閉閥（OFF）打至5 mL注射器位置，立即用1 mL注射器抽吸0.1～0.2 mL動脈血，再次將關(guān)閉閥（OFF）轉(zhuǎn)至微導(dǎo)管位置，撤下1 mL注射器，堵住注射器頭端，立即在Radiometer ABL90微量血氣分析儀上檢測，見圖2。

1.4.2腹主動脈穿刺法：小鼠腹腔注射20%烏拉坦溶液（1 mL/100 g）麻醉后固定于鼠板，消毒皮膚后，沿腹正中線自劍突下至恥骨上剪開皮膚約2.5 cm。剪開壁腹膜，持皮膚拉鉤將腹壁拉向左右兩側(cè)，充分暴露腹腔。右手持無齒鑷自左向右推移腸管，腸管表面給予覆蓋0.9%氯化鈉溶液濕潤的紗布，暴露出腹后壁，將鼠板移至解剖顯微鏡下，小心清除腹膜后脂肪組織，在脊柱前方可見到腹主動脈與腹腔靜脈。雙手持玻璃分針小心剝離動脈管壁上的筋膜組織，待腹主動脈表面的筋膜組織剝離干凈后，右手持已肝素化的1 mL注射器，針尖斜面朝上，入針角度約45～60°，向近心端方向刺入，抽取0.1～0.2 mL動脈血，封堵注射器端口，立即檢測，見圖3。

1.4.3經(jīng)皮左心室穿刺術(shù)：小鼠腹腔注射20%烏拉坦溶液（1 mL/100 g），將四肢固定在鼠板上。先大體確定心臟穿刺位置（左側(cè)第3至第4肋間，雙上肢連線與正中線交點偏下偏左0.5 cm），隨后用右手食指觸及心臟搏動最明顯處，右手持已肝素化的1 mL注射器，使針尖角度與胸部垂直，快速進針，刺入深度約1 cm，隨即緩慢調(diào)整進針深淺，當(dāng)針頭正確刺入心臟左心室時，由于心臟快速跳動的力量，可見到鮮紅的血液自動流入注射器，抽取0.1～0.2 mL血標本，封堵注射器，立即檢測，見圖4。

圖2　頸總動脈插管法采血步驟

圖3　腹主動脈穿刺法采血步驟

圖4　經(jīng)皮左心室穿刺術(shù)采血步驟

1.5測定指標 ①小鼠剪開皮膚或經(jīng)皮穿刺開始至成功采集動脈血所需的時間；②皮膚切口長度；③血氣指標：pH，血氧分壓（PaO2），血二氧化碳分壓（PaCO2），血紅蛋白總濃度（tHb），血氧飽和度（SaO2），半飽和氧分壓（P50），氧合血紅蛋白（O2Hb），一氧化碳血紅蛋白（COHb），去氧血紅蛋白（RHb），血K+、Na+、Ca2+、Cl-，血糖（Glu），血乳酸（Lac），堿剩余（cBase），標準碳酸氫根濃度（SBC）；④采集動脈血成功率。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法或Tamhane’s T2檢驗，率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.13組小鼠皮膚切口長度、成功采集動脈血所需時間、成功率比較 經(jīng)皮左心室穿刺組切口長度、動脈采集時間、成功率均顯著低于頸總動脈插管組和腹主動脈穿刺組（P＜0.05），見表1。頸總動脈插管組成功采集動脈血28例，2例死于動脈微導(dǎo)管脫出頸動脈；腹主動脈穿刺組成功采集動脈血25例，1例死于麻醉時腹腔出血，1例死于注射器脫出腹主動脈，3例死于剝離腹部血管筋膜時大出血；經(jīng)皮左心室穿刺組成功采集動脈血20只，6例因注射器穿透室間隔至右心室所采集的標本為靜脈血，4例持續(xù)經(jīng)皮心臟穿刺超過5 min仍未成功采集動脈血或觸及小鼠心臟搏動減弱，給予開胸解剖，發(fā)現(xiàn)其中1例心包積血，3例心臟破裂胸腔大量積血。

表1　3組小鼠皮膚切口長度、采集動脈血所需時間、成功率比較（±s）

表1　3組小鼠皮膚切口長度、采集動脈血所需時間、成功率比較（±s）

與頸總動脈插管組比：aP＜0.05；與腹主動脈穿刺組比：bP＜0.05

組別例數(shù)體質(zhì)量（g）切口長度（cm）動脈血采集時間（s）成功率（%）頸總動脈插管組2823.69±1.091.29±0.08125.57±16.0693.3腹主動脈穿刺組2523.29±0.882.45±0.10a193.40±19.99a83.3經(jīng)皮左心室穿刺組2023.39±0.780.00±0.00ab14.87± 4.95ab66.7ab

2.23組不同采集動脈血方法對小鼠動脈血電解質(zhì)、生化指標的影響 腹主動脈穿刺組的血K+濃度顯著高于頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組（P＜0.05），腹主動脈穿刺組的血Na+、Cl-濃度均顯著低于頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組（P＜0.05），腹主動脈穿刺組的Glu、Lac濃度顯著高于頸總動脈插管組（P＜0.05），見表2。

2.33組不同采集動脈血方法對小鼠動脈血氣的影響 經(jīng)皮左心室穿刺組的PO2、SaO2、O2Hb均顯著低于頸總動脈插管組和腹主動脈穿刺組（P＜0.05），RHb顯著高于頸總動脈插管組和腹主動脈穿刺組（P＜0.05），tHb、cBase顯著低于腹主動脈穿刺組，SBC顯著高于腹主動脈穿刺組（P＜0.05），見表3。

表2　3組不同采集動脈血方法對小鼠動脈血電解質(zhì)、生化指標的影響（±s）

表2　3組不同采集動脈血方法對小鼠動脈血電解質(zhì)、生化指標的影響（±s）

與頸總動脈插管組比：aP＜0.05；與腹主動脈穿刺組比：bP＜0.05

組別例數(shù)K+（mmol/L）Na+（mmol/L）Cl-（mmol/L）Ca2+（mmol/L）Glu（mmol/L）Lac（mmol/L）頸總動脈插管組283.54±0.41149.89±2.39119.57±3.211.23±0.0511.66±1.571.19±0.41腹主動脈穿刺組254.01±0.61a146.16±1.74a116.95±2.30a1.22±0.0512.81±1.92a1.75±0.91a經(jīng)皮左心室穿刺組203.63±0.44b149.10±2.23b120.80±2.78b1.21±0.0411.93±1.281.59±0.75

表3　3組不同采集動脈血方法對小鼠動脈血血氣的影響（±s）

表3　3組不同采集動脈血方法對小鼠動脈血血氣的影響（±s）

與頸總動脈插管組比：aP＜0.05；與腹主動脈穿刺組比：bP＜0.05

組別例數(shù)pHPaCO2（mmHg）PaO2（mmHg）SaO2（%）tHb（g/dL）O2Hb（%）RHb（%）COHb（%）P50cBase（mmol/L）SBC（mmol/L）頸總動脈插管組287.34±0.0636.09±7.39120.36±13.1595.47±1.4615.93±0.8793.83±1.134.75±1.812.18±0.1041.19±7.98-7.51±2.3618.95±1.56腹主動脈穿刺組257.32±0.0738.08±6.84116.49±10.5694.11±1.75a16.77±0.86a92.23±1.75a5.77±1.712.14±0.0745.77±4.21a-9.15±2.14a17.40±1.45a經(jīng)皮左心室穿刺組207.32±0.0634.54±3.41 90.34±12.17ab91.75±3.22ab15.37±0.99b89.61±2.97ab8.07±3.17ab2.41±0.5842.78±1.15-7.75±2.32b18.72±1.64b

2.4與Thal等的研究結(jié)果比較 頸總動脈插管組、腹主動脈穿刺組、經(jīng)皮左心室穿刺組的pH、PaCO2分別與Thal等[10]的研究結(jié)果[pH：7.35±0.04，PaCO2：（36±4.8）mmHg]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)皮左心室穿刺組的PaO2顯著低于Thal等的研究結(jié)果[（133±46）mmHg]（P＜0.05），而頸總動脈插管組、腹主動脈穿刺組的PaO2與Thal等的研究結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

3.1不同動脈血采集方法對小鼠動脈血電解質(zhì)、生化指標的影響 研究表明，應(yīng)激能使血中的腎上腺素、胰高血糖素等濃度升高[11]，創(chuàng)傷應(yīng)激能使機體釋放大量的炎癥介質(zhì)[12]，能促進糖原分解和糖異生。同時，機體處于應(yīng)激狀態(tài)時能釋放大量內(nèi)源性兒茶酚胺，與腎上腺素能受體結(jié)合后，激活cAMP信號通路，誘導(dǎo)Na+、K+離子通道構(gòu)型發(fā)生改變，導(dǎo)致Na+內(nèi)流增加，K+外流增加，從而導(dǎo)致低鈉血癥、高鉀血癥發(fā)生[13]。創(chuàng)傷應(yīng)激也能引起鈉鉀泵工作異常，使細胞內(nèi)Na+濃度增加，最終導(dǎo)致低鈉血癥發(fā)生[14]。本研究結(jié)果顯示，腹主動脈穿刺組的Glu、Lac顯著高于頸總動脈插管組，K+濃度顯著高于頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組，Na+、Cl-濃度顯著低于頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組，切口長度、動脈血采集時間顯著高于頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組，表明大的創(chuàng)傷更易使機體處于應(yīng)激狀態(tài)，更容易發(fā)生電解質(zhì)、能量代謝、內(nèi)環(huán)境紊亂。因此對于需要采集動脈血做血氣分析的動物模型，有創(chuàng)右側(cè)頸總動脈插管法對血糖、乳酸、電解質(zhì)影響最小，有利于研究者對動物模型的呼吸功能、酸堿平衡、生化指標等做出可靠的評估。

3.2不同采集動脈血方法對小鼠動脈血氣的影響 本研究結(jié)果顯示，腹主動脈穿刺組代謝性指標cBase負值增大、SBC減少，提示腹主動脈穿刺術(shù)更易使小動物機體發(fā)生酸中毒，并且腹主動脈穿刺組Hb對O2的親和力降低，提示小動物術(shù)中對O2的需求量較頸動脈插管組顯著增加，同時比較3種方式采集動脈血所需時間及創(chuàng)口大小，表明腹主動脈穿刺術(shù)最容易發(fā)生機體缺氧和酸堿平衡紊亂。而右側(cè)頸總動脈插管法能較好地維持Hb對O2的親和力，能保持內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡穩(wěn)定。血氣分析顯示腹主動脈穿刺組小鼠的tHb較頸總動脈插管組和經(jīng)皮左心室穿刺組顯著升高，表明小鼠出現(xiàn)較明顯的應(yīng)激變化。研究[15]表明，劇烈運動或應(yīng)激反應(yīng)時，脾臟內(nèi)受體被激動，使脾臟內(nèi)高濃縮血液被排出，從而使血紅蛋白濃度升高。此外，長時間持續(xù)的外科操作，易導(dǎo)致機體細胞外液的丟失，從而造成血容量減少，血液濃縮，tHb升高。經(jīng)皮左心室穿刺組的RHb顯著高于頸總動脈插管組和腹主動脈穿刺組，表明經(jīng)皮心臟盲目穿刺采集的動脈血中可能混有靜脈血，同時經(jīng)皮左心室穿刺組的PO2、SaO2顯著低于頸總動脈插管組和腹主動脈穿刺組，也說明動脈血中可能混合有靜脈血。經(jīng)皮心臟盲穿動脈血采集成功率低，并且由于小鼠個體小，采血后死亡率高。Thal等[10]采用的方法是小鼠麻醉，予氣管插管行機械通氣后采集動脈血。雖然機械通氣能讓小動物在術(shù)中的肺通氣更加符合生理狀態(tài)及所測的指標能減少呼吸因素的影響，但是該方法同時存在機械性肺損傷的風(fēng)險，并且該法對實驗器材要求高，價格昂貴，難以普及。我們將3種方法所測得的pH、PaCO2、PaO2與其比較，發(fā)現(xiàn)頸總動脈插管法、腹主動脈穿刺法測得的數(shù)據(jù)與Thal等的研究結(jié)果較接近，經(jīng)皮左心室穿刺法測得的PaO2顯著低于Thal等的方法。

綜上所述，有創(chuàng)右側(cè)頸總動脈插管法是一種操作方便、用時較短、插管穩(wěn)定性強、成功率高、創(chuàng)傷小、重復(fù)性好的動脈血采集方法，能夠?qū)崿F(xiàn)不同時間點的動脈血采集，對實驗動物血氣、電解質(zhì)及生化指標的影響小、準確性高、可重復(fù)性好。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of different arterial blood collecting methods on the accuracy of blood gas analysis in mice

WU Peiliang, WANG Liangxing, HUANG Xiaoying. Pulmonary Division, Key Laboratory of Heart and Lung, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore ideal arterial blood collecting method in order to monitor blood gas analysis. Methods: Ninety male Balb/c mice were randomly divided into three groups: carotid artery cannula group, celiac artery puncture group, and cardiac punture group. 0.5-1.0 mL arterial blood samples were collected from carotid artery, celiac artery and left ventricle. These samples were tested in a Radiometer ABL90 Flex blood gas analyzer (Radiometer, Denmark) at 37 ℃ for pH, PaO2, SaO2, hemoglobin concentration tHb, oxyhemoglobin O2Hb, base excess cBase, standard bicarbonate SBC, P50, carboxyhemoglobin (COHb), reduced hemoglobin (RHb), K+, Na+, Cl-, Ca2+, as well as lactate and glucose concentrations. Results: There was signifi cant difference in success rate, either in operative incision length or collection time among the three groups. Compared with the carotid artery cannula and celiac artery puncture group respectively, the parameters of PO2, SaO2, O2Hb were decreased, while RHb was signifi cantly increased in cardiac punture group (P＜0.05). And cBase, tHb in cardiac punture group were sharply lower than those in celiac artery puncture group (P＜0.05). Increased K+concentration, decreased Na+, Cl- concentration were found in the celiac artery puncture group compared with other two groups (carotid artery cannula group and cardiac punture group) (P＜0.05). The concentrations of lactic acid, glucose in celiac artery puncture group were higher than those in carotid artery cannula group (P＜0.05). Conclusion: Carotid artery cannula is a good and feasible method for arterial blood collecting, by which blood gas analysis, electrolytes and energy metabolism can be detected more accurately.

carotid artery; celiac artery; heart; blood gas analysis; mice

R446.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.11.003

2016-05-31

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2016DTA005，2012ZD A033）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81473406，81470250，81 270110）。

吳佩亮（1989-），男，浙江溫州人，碩士生。

黃曉穎，教授，主任醫(yī)師，Email：zjwzhxy@126. com。