佟桂芝,宋 斌,李信濤,董正德,王偉霞,海 龍,郭立宏,王嘉厚

(1. 黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學研究院，吉林 長春 130000)

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良種肉羊體外胚胎高效生產(chǎn)技術(shù)的研究

佟桂芝1,宋 斌1,李信濤2,董正德1,王偉霞2,海 龍1,郭立宏1,王嘉厚1

(1. 黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學研究院，吉林 長春 130000)

本研究旨在比較小尾寒羊6周齡、13周齡羔羊、成母羊激素處理后卵巢卵泡發(fā)育及體外胚胎發(fā)育的影響。通過促卵泡激素(FSH)和孕馬血清促性腺激素(PMSG)處理，比較卵巢上2～8 mm卵泡的數(shù)量及體外胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果表明：6周齡羔羊卵巢發(fā)育的卵泡數(shù)和采集到的卵母細胞數(shù)(58.3±1.7、41.6±3.2)都高于13周齡羔羊及成母羊的卵泡數(shù)和卵母細胞數(shù)(16.7±2.6、10.5±2.1；19.6±4.5、11.8±1.6)，且差異顯著(P<0.05)。6周齡、13周齡羔羊卵母細胞受精后的卵裂率(64.1%±1.5%、63.8%±3.4%)及囊胚率(31.2%±1.9%、30.4%±3.7%)略低于成母羊組(67.4%±3.7%、34.4%±1.2%)，但沒有顯著差異(P>0.05)。

寒羊；羔羊；激素處理；月齡；卵泡發(fā)育；成母羊；取卵方式；體外胚胎

通過外源激素誘導，從羔羊獲得大量卵母細胞，受精后進行胚胎移植，能顯著提高良種母羊的繁殖潛力、縮短世代間隔，加速遺傳改良進程。本研究旨在比較小尾寒羊6周齡、13周齡羔羊、成母羊激素處理后卵巢卵泡發(fā)育及對體外胚胎發(fā)育的影響。通過促卵泡激素和孕馬血清促性腺激素處理，比較卵巢上2～8 mm卵泡的數(shù)量及體外胚胎的發(fā)育情況。

1 材料與方法

1.1 母羊選擇

分別于2016年4、5、6月份，選擇體況良好、年齡分別為成母羊、6周齡、13周齡羔羊各9只，共有27只，品種為小尾寒羊。

1.2 母羊激素處理方案

成母羊組及羔羊組(6周齡組、13周齡組)，分別在第一、二、三天的早6：00、晚18：00時肌肉注射2.5mL、1.5mL、1.0mL FSH(20IU/mL)，并在最后一次注射FSH同時每只羔羊加注0.4 mL PMSG(500 IU/mL)。

1.3 卵母細胞的采集

母羊在注射FSH 48h后空腹、術(shù)部剪毛，在母羊腹下切一個切口，引出卵巢，用吸有約2 mL抽卵液 TCM199(5%發(fā)情羊血清、100IU/mL肝素、100g/mL鏈霉素、100IU/mL青霉素)的10mL注射器(接12號針頭)吸一個卵巢表面2～8mm的卵泡。在實體顯微鏡下檢出A、B級卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，記錄所采集的COCs數(shù)，分別比較成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及采集的卵母細胞數(shù)。

1.4 卵母細胞的體外成熟

將采集到的卵母細胞在38.5℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進行24 h的成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)法，滴上覆蓋石蠟油。在直徑為35 mm 的細胞培養(yǎng)皿作6～8個滴(100μL/滴)，在培養(yǎng)箱預平衡2 h。成熟培養(yǎng)液為TCM-199(10%胎牛血清、10 μg/mL促卵泡激素、1 μg/mL促黃體激素、1 μg/mL雌二醇)。

1.5 卵母細胞的體外受精

卵母細胞體外成熟24h后，挑選顆粒細胞擴散效果較好的進行受精。受精液為合成輸卵管液(synthetic oviduct fluid，SOF)并添加20%發(fā)情羊血清、10μg/mL肝素、3%牛脫脂血清白蛋白(BSA)。羊冷凍精液在37℃水浴中解凍15s，然后將解凍后的精液緩慢加入5mL精子洗滌液SOF(10%發(fā)情羊血清、10μg/mL肝素)混勻后進行離心(1500r/min，5min)，離心沉淀后的精子團再用5mL HSOF離心洗滌(1000r/min，5min)1次。去上清液后，用受精液將精子密度稀釋至5×106個/mL用于體外受精。體外成熟的卵母細胞在受精液中洗1～2次，每20個卵母細胞移入50μL受精液滴中。

1.6 早期胚胎的體外培養(yǎng)

精子與卵子受精培養(yǎng)24 h后在SOF液中洗滌2次后，移入預先在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2 h培養(yǎng)滴內(nèi)。將20～25枚受精卵分別移入100μL的發(fā)育培養(yǎng)液SOF(2%的必需氨基酸、1%的非必需氨基酸、2 mmol/L的谷氨酰胺、3 mg/mL BSA、10 ng/mL 上皮生長因子)中，在38.5℃ 、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7～8天。48 h統(tǒng)計卵裂率，每隔48 h半量更換培養(yǎng)液。第8天，統(tǒng)計囊胚率。統(tǒng)計分析采用SPSS統(tǒng)計軟件@Independent-samples t檢驗和One-way ANOVA進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵泡數(shù)和卵母細胞數(shù)比較

由表1可知，6周齡羔羊卵巢發(fā)育的卵泡數(shù)和采集到的卵母細胞數(shù)都遠遠高于13周齡羔羊及成母羊的卵泡數(shù)和卵母細胞數(shù)，且差異顯著(P<0.05)。摘取卵巢組卵母細胞獲得率(80%)顯著高于活體采卵組(65%)。

表1 各試驗組母羊在外源激素誘導后發(fā)育的卵泡數(shù)和卵母細胞數(shù)

注：同列內(nèi)不同上標字母間差異顯著(P<0.05)，同列內(nèi)有相同上標字母間差異不顯著(P>0.05)

2.2 羔羊個體差異對激素誘導效果的影響

在本試驗中，通過激素誘導羔羊卵泡發(fā)育，羔羊之間差異較大。在獲卵總數(shù)方面，獲卵數(shù)量小于25枚的有4只，大于45枚的有8只，5只獲卵數(shù)量在25～45枚之間，1只羔羊沒有反應(見表2)。

表2 羔羊個體差異對激素誘導效果的影響

注：同列內(nèi)不同上標字母間差異顯著(P<0.05)，同列內(nèi)有相同上標字母間差異不顯著(P>0.05)

2.3 成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵母細胞發(fā)育能力及不同取卵方式對體外胚胎發(fā)育能力的比較

由表3可見，6周齡、13周齡羔羊卵母細胞受精后的卵裂率及囊胚率與成母羊組沒有顯著差異(P>0.05)。其中成母羊組卵裂率及囊胚率略好于羔羊組。不同的取卵方式對體外胚胎的發(fā)育能力影響差異不顯著。

表3 各試驗組母羊年齡及不同取卵方式對體外胚胎發(fā)育能力的影響

注：同列內(nèi)不同上標字母間差異顯著(P<0.05)，同列內(nèi)有相同上標字母間差異不顯著(P>0.05)

3 討論

3.1 母羊年齡對卵泡數(shù)及卵母細胞數(shù)的影響

不同月齡的母羊經(jīng)外源激素處理后卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及卵母細胞數(shù)差異很大。6周齡羔羊卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及卵母細胞數(shù)最多，顯著地多于13周齡羔羊及成母羊(P<0.05)。于勇等[1]試驗證明：1月齡、3月齡羔羊超排處理效果上的差異與血液中FSH水平有關(guān)，較高的FSH水平會促進卵巢上卵泡發(fā)育。本研究結(jié)果也證明了這一結(jié)論。

3.2 個體差異對激素誘導效果的影響

在本試驗中，通過激素誘導母羊卵泡發(fā)育，羔羊之間差異較大。在獲卵總數(shù)方面，獲卵數(shù)量小于25枚的有4只，大于45枚的有7只，3只獲卵數(shù)量在25～45枚之間，1只羔羊沒有反應。可見，激素誘導羔羊卵泡發(fā)育存在較大的個體差異。這個結(jié)果與成年母羊的激素誘導效果相似。

3.3 母羊年齡及不同取卵方式對卵母細胞體外發(fā)育能力的影響

本試驗表明，6周齡、13周齡的羔羊所獲卵母細胞在體外成熟、體外受精后的桑葚胚和囊胚率接近于成母羊(P>0.05)。趙宏遠[2]試驗證明，30～50日齡組與51～70日齡組所獲得卵母細胞體外發(fā)育能力差異不大。Morton[3]試驗證明，6～7周齡羔羊比3～4周齡羊卵母細胞體外受精后囊胚率高(21.4%VS17.4%)。陳曉勇等[4]報道，羔羊卵母細胞與成年羊卵母細胞體外發(fā)育能力是否有差異尚存在爭議。Jorio等[5]研究表明，隨著年齡增長卵母細胞在體外的發(fā)育能力增強，成年羊的卵母細胞發(fā)育能力強于羔羊，本試驗結(jié)果證明羔羊卵母細胞的發(fā)育能力略次于成年母羊的。造成此現(xiàn)象的原因除了年齡因素外，也與體外培養(yǎng)體系、個體體況差異等因素有關(guān)，但其內(nèi)在的機理還不是很清楚，需要擴大群體數(shù)量進一步研究。

4 結(jié)論

本試驗通過對成母羊及6周齡、13周齡羔羊進行FSH+PMSG外源激素處理，發(fā)現(xiàn)6周齡羔羊在激素誘導后卵巢上卵泡數(shù)顯著高于成母羊及13周齡羔羊，獲得的卵母細胞數(shù)也遠遠高于成母羊及13周齡羔羊；獲得的卵母細胞經(jīng)過體外成熟、體外受精、早期胚胎體外培養(yǎng)試驗后，6周齡羔羊卵母細胞體外成熟、受精后發(fā)育的囊胚率與成母羊及13周齡羔羊結(jié)果相近。羊是多胎動物，一個卵巢上可以同時排多個成熟卵子，為了提高卵母細胞獲得率，摘除一個卵巢并不會影響母羊以后的繁殖性能。

[1] 于勇，鐘旭，王芬露，等.不同月齡綿羔羊卵泡發(fā)育的比較研究[J].中國畜牧雜志，2012，48(9).

[2] 趙宏遠．影響山羊幼羔卵泡發(fā)育與體外受精效果主要因素研究[D]．保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2009．

[3] Morton K M，Catt S L，Maxwell W M，et al．Effects of lamb age，horm one stimulation and response to hormone stimulation on the yield and in vitro developmental competence of prepubertal lamb ooeytes[J]．Reprod Fertil Dev，2005，17：593-601．

[4] 陳曉勇，敦偉濤，田樹軍，等．幼羔超早期繁殖技術(shù)研究[J]．中國農(nóng)學通報，2010，26(2)：21-25．

[5] Jorio A，Mariana J C，Lahlou-Kassic A，et al．Patten of FSH secretion from birth to 4 months of age in two Moroccan ewe breeds varying in prolificacy[J] ．Small Rumin Res ，1999，33(2)：135-140．

2015-08-23

佟桂芝(1967-)，女，研究生，研究方向：反芻動物飼養(yǎng)與繁殖。Email：178269821@qq.com

黑龍江省財政廳項目(2016-10)和齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(NYGG-201425)

10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.10.002

S826.3+5

A

2095-9737(2016)10-0004-02