張 濤,葛成群

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·論著·

肺結(jié)核患者髓源性抑制細(xì)胞水平變化及其對T淋巴細(xì)胞增殖的影響研究

張 濤,葛成群

結(jié)核，肺；結(jié)核分枝桿菌；髓源性抑制細(xì)胞；精氨酸；一氧化氮

張濤,葛成群.肺結(jié)核患者髓源性抑制細(xì)胞水平變化及其對T淋巴細(xì)胞增殖的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(35)：4359-4363.[www.chinagp.net]

ZHANG T,GE C Q.Level changes of myeloid-derived suppressor cell and its effect on the proliferation of T lymphocytes among patients with pulmonary tuberculosis[J].Chinese General Practice，2016，19(35)：4359-4363.

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis,PTB)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性傳染病，MTB可侵及多個臟器，以肺部最為常見。MTB逃脫宿主的免疫防御機(jī)制以及對藥物的抗藥性是治療結(jié)核病的主要障礙，使得結(jié)核病已成為全球發(fā)病率和病死率較高的傳染病之一[1]。因此，深入研究PTB發(fā)病機(jī)制，尋找和研發(fā)針對PTB的靶向治療藥物是當(dāng)前亟須解決的問題。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年1月—2014年1月于臨沂市人民醫(yī)院診斷為活動性PTB患者30例，其中男19例，女11例；年齡18～65歲，平均年齡(47.4±11.5)歲。患者經(jīng)MTB指示培養(yǎng)基痰液培養(yǎng)呈陽性，并經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確認(rèn)。選取痰液涂片鏡檢MTB陽性和結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)陽性(TST+)的活動性PTB患者家屬，即接觸PTB患者12例，其中男8例，女4例；年齡22～70歲，平均年齡(46.5±13.0)歲。選取同期經(jīng)本院結(jié)核內(nèi)科檢查為非結(jié)核病的健康對照者15例，其中男7例，女8例；年齡21～68歲，平均年齡(45.5±9.6)歲。選取同期本院痰液涂片鏡檢MTB陰性的肺部感染疾病患者7例，其中男5例，女2例；年齡28～65歲，平均年齡(46.0±10.5)歲。受試者均未接受過免疫抑制治療。受試者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療 活動性PTB患者和接觸PTB患者經(jīng)異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇治療2個月，再經(jīng)異煙肼和利福平單獨(dú)治療4個月。痰液涂片鏡檢呈陰性者為治愈，觀察1年后未復(fù)發(fā)者為康復(fù)。

1.3 方法

1.3.1 試劑 CD11b、CD14、CD15、CD33、CD3抗體購自英國Abcam公司；絲裂霉素C、HLA-DR抗體購自美國Sigma公司。

1.3.2 外周血單核細(xì)胞(PBMC)和支氣管肺泡細(xì)胞(BALC)的制備 參照文獻(xiàn)[12]，取活動性PTB患者、接觸PTB患者和健康對照者外周血，采用葡聚糖密度梯度離心法分離制備PBMC；緩慢滴入0.9%氯化鈉溶液至活動性PTB患者、肺部感染疾病患者肺部，收集支氣管肺泡灌洗液，用Sputasol痰消化液(OXOID，英國)室溫處理15 min后再經(jīng)100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，分離制備BALC。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù) PBMC和BALC經(jīng)FACSFlow平衡緩沖液重懸吹打混勻后，加入熒光素標(biāo)記的單克隆抗體CD11b、CD14、CD15、CD33、CD3和HLA-DR，4 ℃孵育30 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，PBMC用1%多聚甲醛溶液固定，BALC用4%多聚甲醛溶液固定，再重懸于FACSFlow平衡緩沖液中，立即運(yùn)用流式細(xì)胞儀(FACS CANTO Ⅱ，美國)進(jìn)行流式分選。每個樣本以4.5×105個細(xì)胞上流式細(xì)胞儀，采用CellQuest流式分析軟件進(jìn)行細(xì)胞分類，記錄MDSC在PBMC和BALC中的比例。按上述方法再次對治療結(jié)束的活動性PTB患者、治愈PTB患者和康復(fù)PTB患者檢測MDSC在PBMC中的比例。

1.3.4 MDSC形態(tài)學(xué)觀察 收集部分細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞離心涂片機(jī)(Shandon Cytospin 4，美國)說明書制備細(xì)胞涂片，500×g離心5 min。制備的細(xì)胞涂片經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察和拍照。

1.3.6 高效液相色譜法(HPLC)檢測L-精氨酸、NO、鳥氨酸水平 取活動性PTB患者和健康對照者血樣本以12 300×g離心15 min，去除雜質(zhì)，收集血清，加入內(nèi)標(biāo)物纈氨酸和肌氨酸，吹打混勻制成血清懸液。通過10 K超濾管(0.5 ml,Millipore，美國)進(jìn)行超濾濃縮去除蛋白，收集濃縮液，運(yùn)用1200自動進(jìn)樣器加入鄰苯二甲醛(OPA)和9-芴甲氧羰酰氯(FMOC)進(jìn)行衍生化作用。參照文獻(xiàn)[13]，以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合物作為OPA衍生物和次級氨基酸混合物作為FMOC衍生物注射進(jìn)入反相柱，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸在激發(fā)波長為230 nm，發(fā)射波長為455 nm處檢測；次級氨基酸在激發(fā)波長為266 nm，發(fā)射波長為310 nm處檢測。運(yùn)用1200系列高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)進(jìn)行分離和測定熒光強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重比較調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05/比較次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同受試者M(jìn)DSC比例比較 活動性PTB患者、接觸PTB患者、健康對照者PBMC中MDSC比例分別為0.338(0.274，0.399)、0.115(0.073，0.201)和0.042(0.031，0.103)，不同受試者PBMC中MDSC比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=16.450，P<0.001)；其中活動性PTB患者PBMC中MDSC比例高于接觸PTB患者、健康對照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；接觸PTB患者PBMC中MDSC比例與健康對照者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.374)?；顒有訮TB患者BALC中MDSC比例為0.425(0.219，0.483)，高于肺部感染疾病患者的0.031(0.011，0.100)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=9.675，P=0.004)。光學(xué)顯微鏡下，MDSC呈規(guī)則的圓形或橢圓形(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下MDSC形態(tài)(HE染色，×40)

2.3 血清L-精氨酸、NO、鳥氨酸水平比較 活動性PTB患者血清L-精氨酸水平為31.72(18.37，59.58)μmol/L，低于健康對照者的57.88(35.11，77.93)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=9.030，P=0.008)?；顒有訮TB患者血清NO水平為63.54(51.83，81.33)μmol/L，高于健康對照者的30.31(28.19，40.28)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=10.033，P=0.004)?；顒有訮TB患者、健康對照者血清鳥氨酸水平分別為47.76(30.72，82.58)μmol/L、52.47(34.32，58.96)μmol/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.288，P=0.874)。

2.4 抗PTB治療與MDSC的關(guān)系 活動性PTB患者治愈10例，康復(fù)5例。治療結(jié)束時治愈PTB患者PBMC中MDSC比例為0.024(0.008，0.0389)，低于活動性PTB患者治療期間PBMC中MDSC的比例0.323(0.264，0.388)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=18.880，P<0.001)?？祻?fù)PTB患者PBMC中MDSC比例為0.034(0.018，0.039)，低于其治療結(jié)束時PBMC中MDSC的比例0.053(0.017，0.084)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=11.125，P=0.004)。

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，MTB感染部位的MTB特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量是周圍未感染部位的10倍[14]。胸膜液中的MDSC顯著增加[11]，而本研究發(fā)現(xiàn)BLAC中MDSC比例升高，提示MDSC對MTB感染引起的炎性反應(yīng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

綜上所述，活動性PTB患者M(jìn)DSC比例增加，治愈及康復(fù)者M(jìn)DSC比例下降；MDSC可抑制T淋巴細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與激活NO信號通路有關(guān)。MDSC在MTB傳染性疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，通過增強(qiáng)MDSC的免疫調(diào)節(jié)活性有望成為MTB感染性疾病新的治療手段。但是，MDSC在PTB發(fā)病過程中的作用仍不完全清楚。因此，深入了解MDSC在PTB中的作用，為診斷和治療PTB提供新的思路。

作者貢獻(xiàn)：張濤進(jìn)行課題設(shè)計(jì)、評估、質(zhì)量控制及審校，并對文章負(fù)責(zé)；葛成群進(jìn)行課題實(shí)施、評估、資料收集整理、成文。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Level Changes of Myeloid-derived Suppressor Cell and Its Effect on the Proliferation of T Lymphocytes among Patients with Pulmonary Tuberculosis

ZHANGTao,GECheng-qun.

DepartmentofInternalMedicineTuberculosis,LinyiPeople′sHospital,Linyi276034,China

Correspondingauthor：ZHANGTao，DepartmentofInternalMedicineTuberculosis,LinyiPeople′sHospital,Linyi276034,China；E-mail：iamzhangtao1977@163.com

Tuberculosis,pulmonary；Mycobacterium tuberculosis；MDSC；Arginine；Nitric oxide

276034山東省臨沂市人民醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科

張濤，276034山東省臨沂市人民醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科；E-mail：iamzhangtao1977@163.com

R 521

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.35.014

2016-03-10；

2016-10-09)