張桂枝，靳雙星

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 畜牧工程系,鄭州 450046)

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復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對(duì)AA肉雞紅細(xì)胞免疫功能影響

張桂枝，靳雙星

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 畜牧工程系,鄭州 450046)

為考察復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對(duì)肉雞紅細(xì)胞免疫功能的影響，選取160只健康A(chǔ)A肉雞，隨機(jī)分成4組，A組為空白對(duì)照組，B組為免疫對(duì)照組，C組為復(fù)方中藥制劑組，D組為復(fù)方中藥混菌發(fā)酵劑組，B、C、D 3組 均在7日齡2倍量點(diǎn)眼滴鼻接種新城疫Lasota株Ⅳ活疫苗。分別在14、21、28和35日齡時(shí)采集血樣，測(cè)定紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率。結(jié)果表明：復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑在不同日齡均能提高紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率，與空白對(duì)照組、疫苗對(duì)照組和復(fù)方中藥制劑組相比存在顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。說(shuō)明復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑能顯著提高紅細(xì)胞的免疫功能，并能克服因接種疫苗引起紅細(xì)胞免疫功能短暫下降的不良反應(yīng)。

復(fù)方中藥；發(fā)酵；紅細(xì)胞；肉雞；免疫

有研究表明[ 1-4]許多中草藥可增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫吸附能力，提高機(jī)體免疫調(diào)控的功能。本課題組成員根據(jù)中獸醫(yī)理論及養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)實(shí)際需要科學(xué)組方，研制出復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑。前期研究表明復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)疫苗免疫效果，增加免疫細(xì)胞數(shù)量和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，為進(jìn)一步闡明其免疫增強(qiáng)作用機(jī)制，本試驗(yàn)通過(guò)在飼料中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑，探討其對(duì)AA肉雞紅細(xì)胞免疫功能的影響，旨在為臨床應(yīng)用及生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

復(fù)方中藥制劑：由連翹、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、白術(shù)、枳實(shí)、山楂、甘草8味中藥組成。分別于50～60 ℃下烘干2～3 h，粉碎，100%過(guò)80目篩，備用。復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑：取上述復(fù)方中藥制劑調(diào)整物料質(zhì)量含水量為50%，pH為6.0左右，使V(枯草芽孢桿菌)∶V(產(chǎn)朊假絲酵母)∶V(嗜酸乳桿菌)=1∶1∶1，混勻后，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%接種量接入物料中，攪拌均勻后裝入不透氣的塑料袋中，壓實(shí)，封口，置于31 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)72 h，烘干，即得。

1.2 儀器和試劑

離心機(jī)、恒溫水浴箱、顯微鏡、計(jì)數(shù)器等。酵母菌試劑、Hank’s液、家兔血清、瑞氏-姬姆薩染液等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

1日齡健康A(chǔ)A肉雞，隔離飼養(yǎng)至7日齡，分籠飼養(yǎng)。選取160只體質(zhì)量相近健康的AA肉雞(雌雄各半)，隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。A組作為空白對(duì)照組，不進(jìn)行新城疫活疫苗免疫；B組為免疫對(duì)照組，C組為復(fù)方中藥制劑組，D組為復(fù)方中藥混菌發(fā)酵劑組，B、C、D 3組均在7日齡2倍量點(diǎn)眼滴鼻接種新城疫Lasota株Ⅳ活疫苗，C、D組接種疫苗的同時(shí)分別在飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的復(fù)方中藥制劑和復(fù)方中藥混菌發(fā)酵劑，連續(xù)用藥7 d。分別在14、21、28和35日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取 2只雞，每組8只雞，采集心臟血液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%肝素抗凝，待檢 。

1.4 紅細(xì)胞C3b受體(RBC-C3bR)花環(huán)率檢測(cè)

1.4.1 C3b致敏酵母懸液制備 將酵母試劑用Hank’s液(pH 7.2)洗1次(1 000 r/min離心10 min)，配成含酵母細(xì)胞1.0×108mL-1的懸液，加等量新鮮家兔血清，混勻，37 ℃水浴20 min。然后再以Hank’s液洗2次，恢復(fù)原劑量，即為C3b致敏酵母細(xì)胞懸液。

1.4.2 紅細(xì)胞懸液制備 分別將上述各時(shí)間采集的肝素抗凝血2 000 r/min離心10 min，吸出上清液 ( 血漿 )，用Hank’s液洗3次(每次以2 000 r/min離心5 min)，最后將紅細(xì)胞用Hank’s液稀釋成細(xì)胞數(shù)為1.25×107mL-1的懸液。1.4.3 檢測(cè)方法 取C3b致敏酵母菌懸濁液和紅細(xì)胞懸液各50 μL，混勻，于37 ℃水浴40 min后取出，輕輕搖起，加體積分?jǐn)?shù)為0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min，用適量Hank’s液稀釋，涂片，干燥，甲醇固定，用瑞氏-姬姆薩染液染色，高倍鏡檢查。以1個(gè)紅細(xì)胞粘附2個(gè)或2個(gè)以上酵母細(xì)胞為1個(gè)花環(huán)，計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，計(jì)算出花環(huán)率：RBC-C3bR花環(huán)率= RBC-C3bR花環(huán)數(shù)/200 × 100% 。

1.5 紅細(xì)胞免疫復(fù)合物(RBC-IC)花環(huán)率檢測(cè)

除酵母細(xì)胞不致敏外，其余同RBC-C3bR花環(huán)率檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 12.0中 One-Way ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析數(shù)據(jù)，并進(jìn)行Duncan’s多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對(duì)肉雞RBC-C3bR花環(huán)率的影響

由表1可知，免疫后第7天，C、D組高于空白對(duì)照A組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；B組顯著低于A組(P<0.05)；C、D組極顯著高于B組(P<0.01)。免疫后第14天，B組高于A組，但差異不顯著(P>0.05)；C、D組極顯著高于A、B組(P<0.01)，D組顯著高于C組(P<0.05)。免疫后第21天，B組顯著高于A組(P<0.05)，C、D組極顯著高于A、B組(P<0.01)。D組顯著高于C組(P<0.05)。免疫后第28天，B、C、D組極顯著高于A組(P<0.01)，C、D組顯著高于B組(P<0.05)，C、D組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

表1 不同處理RBC-C3bR花環(huán)率的動(dòng)態(tài)變化

注: 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下表同。
Note: Different lowercase and capital letters after values within columns mean different at 0.05 and 0.01 significant level,respectively. The same as below.

2.2 復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對(duì)肉雞RBC-IC花環(huán)率的影響

由表2可知，免疫后第7天，C、D組顯著高于A組(P<0.05)，極顯著高于B組(P<0.01)；A組顯著高于B組(P<0.05)。免疫后第14天和免疫后第21天，C、D組均極顯著高于A、B組(P<0.01)，A組與B組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，免疫后14天，D組顯著高于C組(P<0.05)。免疫后第28天，C、D組極顯著高于A組(P<0.01)，顯著高于B組(P<0.05)，B組顯著性高于A組(P<0.05)，但C、D 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 不同處理RBC-IC花環(huán)率的動(dòng)態(tài)變化

3 討 論

發(fā)酵是中藥材傳統(tǒng)炮制方法之一?，F(xiàn)代發(fā)酵研究表明[5-7]，微生物具有氧化、酯化、甲基化、羥基化、還原化等多種能力，中草藥經(jīng)發(fā)酵后，其有效成分能被充分釋放，使其具有更強(qiáng)的生物活性，并含有大量的活性酶，飼喂后能被機(jī)體組織細(xì)胞迅速吸收，達(dá)到調(diào)節(jié)免疫，增強(qiáng)抗病力的功能，更好地發(fā)揮中草藥的藥效作用。同時(shí)，還可以將某些成分分解轉(zhuǎn)化成新的成分，這些新成分成為增強(qiáng)藥理作用或出現(xiàn)新藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，可以利用其進(jìn)行發(fā)酵制藥，從而降低用藥成本，提高功效。

眾多研究表明[8-10]，紅細(xì)胞作為機(jī)體天然免疫的重要組成部分，不僅能夠運(yùn)送氧氣和二氧化碳，而且具有識(shí)別、儲(chǔ)存和提呈抗原、清除循環(huán)免疫復(fù)合物、促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬、增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性等作用。紅細(xì)胞在體內(nèi)廣泛參與非特異性和特異性免疫反應(yīng)[11]。紅細(xì)胞的粘附活性可作為評(píng)價(jià)紅細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，免疫黏附功能是通過(guò)C3b受體實(shí)現(xiàn)的，并發(fā)現(xiàn)血液C3b受體總數(shù)的95%以上都在紅細(xì)胞上[12]。紅細(xì)胞的這些免疫功能主要是通過(guò)免疫黏附來(lái)實(shí)現(xiàn)，郭峰等[13]在紅細(xì)胞免疫的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究方面取得了許多突破性進(jìn)展，建立了一系列紅細(xì)胞免疫功能的監(jiān)測(cè)方法。RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率高低可作為紅細(xì)胞免疫粘附功能的重要指標(biāo)[14]。

許多中藥復(fù)方制劑和多糖可顯著提高紅細(xì)胞免疫水平[15-16]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼料中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑，在不同日齡均能不同程度提高RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率，與空白對(duì)照組、免疫對(duì)照組和復(fù)方中藥制劑組相比存在顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)，這可能與復(fù)方中藥混菌發(fā)酵過(guò)程中其有效活性成分能被充分釋放，產(chǎn)生大量的生物活性酶和新成分有關(guān)。這與喬海博等[8]、韓春楊等[14]結(jié)果相一致。

健康雞經(jīng)新城疫活疫苗免疫后，RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率與對(duì)空白照組相比短暫性降低，說(shuō)明用新城疫活疫苗免疫會(huì)引起機(jī)體紅細(xì)胞免疫功能短暫性下降，這可能是新城疫活疫苗毒株進(jìn)入機(jī)體后破壞血液中紅細(xì)胞膜上的C3b受體所致。紅細(xì)胞C3b受體分子是相對(duì)分子質(zhì)量約為200 000的糖蛋白，極易受到各種抗原的危害。

以上結(jié)果表明，說(shuō)明復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑能顯著提高紅細(xì)胞的免疫功能，并能克服因接種疫苗引起紅細(xì)胞免疫功能短暫下降的不良反應(yīng)。

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(責(zé)任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Effect of Mixed Culture Fermentation of Compound Chinese Herbal Medicine Mixtures on the Immune Function of Erythrocyte in AA Broilers

ZHANG Guizhi and JIN Shuangxing

(Animal Science Department,Henan Univeisity of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)

In order to study the effects of the mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures on the immune function of erythrocyte in broilers.160 healthy chicken broilers at the age of 7 day old were selected,randomly divided into 4 groups:normal control group(A),infected control group(B),compound Chinese herbal medicine mixtures group(C) and mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures(D).B,D and C groups were inoculated with 2 times ND Lasota Ⅳ vaccine by means of eye and intranasal at the age of 7 days,and blood specimen was collected at the 14th,21st,28 th and 35th days respectively to detect the broilers’ rosette formation rates of RBC-C3bR and RBC-IC. The results showed that the mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures could increase the broilers’ rosette formation rates of RBC-C3bR and RBC-IC at different ages.The rates were significantly higher than the normal control group,infected control group and compound Chinese herbal medicine mixtures group(P<0.05 orP<0.01). The experiment indicated that the mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures can improve the immune function of erythrocyte in broilers and overcome the erythrocyte immune function of falling short due to the vaccination by-effects.

Compound Chinese herbal medicine;Fermentation; Erythrocyte; Broiler; Immune

ZHANG Guizhi,female,associate professor.Research area:prevention and control of the disease in livestock and poultry.E-mail:zhangguizhi666@126.com

JIN Shuangxing,male,professor.Research area:prevention and control of the disease in livestock and poultry.E-mail:jinshuangxing@126.com

2015-06-18

2015-09-02

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(142102110044)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(HUAHE2015003)。

張桂枝，女，副教授，研究方向?yàn)樾笄菀卟》揽?。E-mail: zhangguizhi666@126.com

靳雙星，男，教授，研究方向?yàn)樾笄菀卟》揽亍-mail: jinshuangxing@126.com

日期：2016-10-20

S853.72

A

1004-1389(2016)10-1454-04

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1653.010.html

Received 2015-06-18 Returned 2015-09-02

Foundation item Science and Technology Planning Project of Henan Province(No.142102110044);Innovative Research Team of Henan Univeisity of Animal Husbandry and Economy(No.HUAHE2015003).