鄧騰

（廣東加多寶飲料食品有限公司，廣東東莞523852）

植物飲料提取液中微生物的分離鑒定及耐熱性研究

鄧騰

（廣東加多寶飲料食品有限公司，廣東東莞523852）

以植物飲料提取液為研究對(duì)象，通過(guò)16SrDNA序列分析法和基于毛細(xì)管法測(cè)定微生物的D值和Z值的方法對(duì)分離出的耐熱性菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和耐熱性能研究。結(jié)果表明，本試驗(yàn)共分離出6株耐熱性菌株，包括嗜熱脂肪芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、人參土芽孢桿菌、脂環(huán)酸芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。其中，罐頭食品中典型耐熱性代表菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的耐熱性測(cè)試結(jié)果為：D121℃=1.4min，Z=10.05℃。

植物飲料；耐熱微生物；分子生物學(xué)鑒定；耐熱性能

近年來(lái)，隨著消費(fèi)者的生活水平及健康意識(shí)的提高，一類以植物或植物抽提物為原料經(jīng)加工或發(fā)酵制成的植物飲料制品越來(lái)越受到消費(fèi)者的熱捧[1-2]。目前，植物飲料的研究方向主要傾向于功能性及毒理學(xué)方面，有關(guān)控制腐敗變質(zhì)的研究較少。引起罐頭食品腐敗變質(zhì)的原因較多，包括原輔料的質(zhì)量和工藝操作等問(wèn)題。但對(duì)于低酸性罐頭食品而言，產(chǎn)品的密封缺陷及殺菌強(qiáng)度不足則是引起產(chǎn)品二次污染的主要原因[3-4]。植物飲料行業(yè)現(xiàn)已呈現(xiàn)多家規(guī)模化生產(chǎn)的龍頭品牌企業(yè)，但不同企業(yè)在原料及工藝方面還存在較大差別。植物飲料較易因微生物活動(dòng)作用而發(fā)生腐敗變質(zhì)，一定程度上限制了植物飲料行業(yè)的推廣和進(jìn)一步發(fā)展。因此，探究植物飲料提取液中腐敗微生物的種類及典型耐熱代表菌株的耐熱性能，對(duì)于進(jìn)一步的制定合理、經(jīng)濟(jì)的殺菌工藝和延長(zhǎng)植物飲料的保質(zhì)期都具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

植物飲料提取液采自廣東地區(qū)某企業(yè)植物飲料生產(chǎn)線。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

平酸菌增菌培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、促芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基[5-6]。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

SW-CJ-1C型潔凈工作臺(tái)：購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9612型電熱恒溫培養(yǎng)箱：購(gòu)自上海一恒

科技有限公司；HVE-50型電熱蒸汽自動(dòng)滅菌鍋：購(gòu)自日本HIRAYAMA公司；DYY-10C型電泳儀：購(gòu)自北京六一儀器廠；sigma 3k15離心機(jī)：購(gòu)自德國(guó)希格瑪離心機(jī)有限公司；CH1506恒溫油浴鍋：購(gòu)自蘇州江東精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

將采集到的樣品收集至滅菌管內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室放置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取液中微生物的分離和純化

將各樣品置于55℃下培養(yǎng)5 d后，在無(wú)菌條件下將樣品用無(wú)菌水依次作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等10倍梯度稀釋操作，分別接種至平酸菌增菌培養(yǎng)基中。細(xì)菌在55℃下培養(yǎng)2 d后進(jìn)行觀察，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并反復(fù)采用平板劃線的方法獲得純種。最終將純化后菌株置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 各菌株基因組DNA提取

將液體培養(yǎng)物離心后收集菌體。采用天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取物置于-20℃保存。

1.2.4 16S rDNA序列擴(kuò)增和測(cè)序

利用通用引物A27F和A1495R[7]對(duì)各菌株的16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，正引物為27F：5'-AGTTTGACMTGGCTCAG-3'，反向引物為1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。菌體擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；30個(gè)循環(huán)：94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1min；72℃末端延伸10min。然后將擴(kuò)增成功的產(chǎn)物直接送往上海生工純化和測(cè)序。

1.2.5 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從模式菌株數(shù)據(jù)庫(kù)LSPN中獲得一系列參比菌株的16SrDNA序列，利用ClusterW軟件完成序列的成對(duì)比對(duì)和多重序列比。再采用NJ（neighbor-joining method）法，利用MEGA 5.0軟件完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建工作，使用的模型為maximum composite likelihood model，自展分析設(shè)置為1 000次重復(fù)[8]。

1.2.6 嗜熱脂肪芽孢桿菌的耐熱性能測(cè)試

1.2.6.1 菌株的復(fù)壯

將分離并保存的嗜熱脂肪芽孢桿菌在平酸菌增菌平板上劃線后，置于55℃培養(yǎng)24 h。以上操作重復(fù)3次，以確保其活力和純度。

1.2.6.2 耐熱性試驗(yàn)

1）制備芽孢菌懸液

挑取復(fù)壯后的嗜熱脂肪芽孢桿菌單個(gè)菌落，劃線接種于促芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基斜面上，55℃培養(yǎng)10 d。當(dāng)革蘭氏染色鏡檢芽孢數(shù)達(dá)90%以上，用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌苔，將此原液在（90±1）℃熱水中加熱30min后，迅速浸入冷水中進(jìn)行冷卻，以殺死營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，制成含活菌數(shù)大于106個(gè)/mL芽孢菌懸液。以上步驟均在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下操作，制得的芽孢懸浮液原液置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆肹9]。

2）細(xì)菌減少試驗(yàn)

菌懸液經(jīng)離心去上清液后，以成品植物飲料為稀釋液與菌種充分混合后加入滅菌后毛細(xì)管中，經(jīng)熱封口后按一定的溫度和時(shí)間組合在油浴鍋內(nèi)進(jìn)行加熱處理。熱殺菌結(jié)束后，取出毛細(xì)管并迅速浸入冷水中冷卻。毛細(xì)管去油污后，浸入次氯酸鈉溶液中進(jìn)行外壁消毒處理。在無(wú)菌水中反復(fù)蕩洗后，將毛細(xì)管搗碎，并分別稀釋至通常認(rèn)為的最佳計(jì)數(shù)濃度[10]。按GB 4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》的方法進(jìn)行滅菌效果的檢驗(yàn)。

3）D值的計(jì)算

以熱處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，殘菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制受熱致死溫度曲線。采用線性回歸分析法確定D值。圖解作出的“最佳”直線可由y=m x+b來(lái)表示。其中：m為直線的斜率，D值是該斜率的負(fù)倒數(shù)[10]。

4）Z值的計(jì)算

采用線性回歸分析法，以熱處理溫度為橫坐標(biāo)，微生物在各熱處理溫度下的D值對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制仿熱力致死時(shí)間曲線。圖解作出的“最佳”直線可由y= m x+b來(lái)表示。其中：m為直線的斜率，Z值為該斜率的負(fù)倒數(shù)[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 各菌株DNA序列的提取

各菌株基因組DNA電泳圖見圖1。

圖1 各菌株基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresisof totalDNA of strains

由圖1可知，在采集到的提取液樣品中，共分離出來(lái)6株不同微生物。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，

各菌株提取的DNA均只有一條明顯清晰的條帶，說(shuō)明本試驗(yàn)提取的各菌株的基因組DNA的純度很高，沒(méi)有蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)和RNA的污染。

2.2 菌株16SrDNA序列的同源性比對(duì)分析

菌株JDB-2和JDB-3基于16SrDNA序列的樹狀圖見圖2。

圖2 菌株JDB-2和JDB-3基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.2 Phylogenetic treebased on the16S rDNA alignmentof strains JDB-2 and JDB-3

如圖2所示，菌株JDB-2和JDB-3同屬于芽孢桿菌屬。其中，菌株JDB-2與Bacilluspumilus系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，16S rDNA序列同源性達(dá)98%。菌株JDB-3與Bacillus cereus系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，16S rDNA序列同源性達(dá)99%。

菌株JDB-1和JDB-5基于16SrDNA序列的樹狀圖見圖3。

圖3 菌株JDB-1和JDB-5基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.3 Phylogenetic treebased on the16S rDNA alignmentof strains JDB-1 and JDB-5

如圖3所示，菌株JDB-1和JDB-5同屬于芽孢桿菌屬。其中，菌株JDB-1與Alicyclobacillussp.系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，16S rDNA序列同源性達(dá)99%。菌株JDB-5與Bacillus subtilis系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，16S rDNA序列同源性達(dá)99%。

菌株JDB-4和JDB-6基于16SrDNA序列的樹狀圖見圖4。

圖4 菌株JDB-4和JDB-6基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.4 Phylogenetic treebased on the16S rDNA alignmentof strains JDB-4 and JDB-6

如圖4所示，菌株JDB-4和JDB-6同屬于芽孢桿菌屬。其中，菌株JDB-4與Bacillusginsengihumi系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，16SrDNA序列同源性達(dá)97%。菌株JDB-6與Geobacillusstearothermophilus系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，16SrDNA序列同源性達(dá)95%。

2.3 嗜熱脂肪芽孢桿菌的耐熱性能測(cè)試

大量研究表明[11-12]，嗜熱脂肪芽孢桿菌是能夠引起低酸性罐頭食品（pH>4.6）產(chǎn)酸腐敗的主要代表微生物之一。該微生物所產(chǎn)芽孢一般無(wú)致病性、無(wú)熱原、無(wú)毒，且對(duì)壓力蒸汽的抵抗力較強(qiáng)，被歐洲藥典、美國(guó)藥典、日本藥典等作為熱力滅菌生物指示劑的標(biāo)準(zhǔn)菌株收錄[13]。因此，本研究主要是針對(duì)從植物飲料提取液中分離純化出的典型耐熱性代表菌株-嗜熱脂肪芽孢桿菌進(jìn)行耐熱性能測(cè)試。

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以油浴鍋為加熱設(shè)備，毛細(xì)管為提取液貯存容器，將添加嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的植物飲料在不同溫度-時(shí)間組合條件下進(jìn)行加熱處理后，再用PCA培養(yǎng)基在55℃的培養(yǎng)箱內(nèi)保溫培養(yǎng)48 h，其結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在提取液中的致死率曲線Fig.5 Thermaldeath rate curveof Bacillusstearothermophilus in herbal tea

D值是反映微生物在某一溫度下的耐熱性，D值越大，表明其耐熱性越強(qiáng)，也即死亡所需的時(shí)間越長(zhǎng)。D值與溫度之間的關(guān)系也成對(duì)數(shù)關(guān)系，即溫度升高，D值按對(duì)數(shù)級(jí)減少，且不受原始菌數(shù)的影響[14]。圖5表明，嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度-時(shí)間下的受熱致死曲線是典型的對(duì)數(shù)直線關(guān)系，其方程分別是y1=-0.227 2x+6.044 4（116℃）、y2=-0.714 3x+6.782 9

（121℃）、y3=-2.246 0x+6.934 2（126℃）。

圖6 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在植物飲料中的仿熱力致死率曲線Fig.6 Im itation thermaldeath rate curveof Bacillus stearothermophilus in herbal tea

以提取液中嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在各殺菌溫度下的D值對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以殺菌溫度為橫坐標(biāo)，繪圖可得出y=-0.099 5x+12.185 6的關(guān)系曲線（如圖6）。該曲線的斜率的負(fù)倒數(shù)，即為Z值。Z值表示在致死溫時(shí)曲線中，時(shí)間降低一個(gè)對(duì)數(shù)期所需升高的溫度[14]。

根據(jù)致死率曲線和仿熱力致死時(shí)間曲線的對(duì)數(shù)直線方程，計(jì)算出提取液中嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的耐熱特性參數(shù)如表1所示。

表1 植物飲料中嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的耐熱特性參數(shù)Table1 Thermal resistance parametersof Bacillus stearothermophilus in herbal tea

3 結(jié)論

在世界各國(guó)，耐熱性高的芽抱菌給食品工業(yè)帶來(lái)的威脅都時(shí)有發(fā)生。特別是在工業(yè)上稱作“平酸菌”的芽抱桿菌，它們一般以使食品酸敗變質(zhì)而不產(chǎn)生氣體，能耐受較高程度的熱處理為特征，給食品工業(yè)的生產(chǎn)和食品保藏帶來(lái)巨大麻煩[11]。本文一方面以植物飲料提取液為樣品，進(jìn)行平板劃線分離、純化，共得到6株耐熱性細(xì)菌。經(jīng)細(xì)菌16SrDNA鑒定結(jié)果表明，可導(dǎo)致植物飲料腐敗的耐熱微生物主要有嗜熱脂肪芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、人參土芽孢桿菌、脂環(huán)酸芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。另一方面又通過(guò)毛細(xì)管法對(duì)罐頭食品中耐熱性代表菌株嗜熱脂肪芽孢菌芽孢進(jìn)行了耐熱性能測(cè)定，測(cè)試結(jié)果為：D121℃= 1.4min，Z=10.05℃。此外，在植物飲料的實(shí)際殺菌操作中，僅知道殺菌微生物的D值是不夠的，還需進(jìn)一步的確定在一定溫度下，殺滅一定量微生物所需的時(shí)間，即安全殺菌值（F）。本研究工作的開展不僅對(duì)植物飲料行業(yè)殺菌工藝的制定提供了參考依據(jù)，同時(shí)為延長(zhǎng)植物飲料的保質(zhì)期，開發(fā)適合植物飲料防腐的措施奠定了基礎(chǔ)。

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Study on Isolation and Identification and Thermal Resistance of Thermophilic M icroorganism s in the Plant Beverage Extracts

DENGTeng
（Guangdong Jiaduobao Drink&Food Co.，Ltd.，Dongguan 523852，Guangdong，China）

For studying on diversity and thermal resistance，6 strains ofmicrobe isolated from the plantbeverage extractswere identified by 16S rDNA sequence analysis and weremeasured D value，Z value by capillary tube method.The result showed that these isolates identified to be Bacillus stearothermophilus，Bacillus pumilus，Bacillusanthracis，Bacillusginsengihumi，Alicyclobacillus sp.and Bacillus cereus，respectively.In addition，the results of thermal resistance of Bacillus stearothermophilus which was predominant thermoduric bacteria in canned food showed that the valuesofD121℃=1.4min and Z=10.05℃.

plantbeverage；thermophilicmicroorganisms；identificationofmolecularbiology；thermalresistance

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.038

2016-08-03

鄧騰（1965—），男（漢），工程師，研究方向：主要從事飲料新產(chǎn)品開發(fā)與工藝研究。