吳帥，王錕，由菊，楊潔

（1.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東煙臺(tái)264000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；3.煙臺(tái)市質(zhì)量認(rèn)證咨詢中心，山東煙臺(tái)264000；4.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東青島266000）

高效液相色譜法測(cè)定白蘭地中的多酚類物質(zhì)

吳帥1，2，王錕3，由菊3，楊潔4

（1.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東煙臺(tái)264000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；3.煙臺(tái)市質(zhì)量認(rèn)證咨詢中心，山東煙臺(tái)264000；4.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東青島266000）

將白蘭地經(jīng)0.45μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣，選用InertsilODS3C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以添加1%甲酸的乙腈、甲醇和水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，對(duì)多酚物質(zhì)進(jìn)行分離。選取二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性及定量分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限能夠滿足定量要求。利用上述方法對(duì)30個(gè)白蘭地樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所有樣品中均檢出沒食子酸、鞣花酸和糠醛；大部分樣品中檢出香草酸、丁香酸、香草醛、丁香醛、芥子醛和松柏醛；選取的樣品中未檢出原兒茶酸、芥子酸、阿魏酸和肉桂酸。

高效液相色譜；白蘭地；多酚

白蘭地是一種蒸餾酒，以水果為原料，經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾、貯藏、陳釀而成。以葡萄為原料的蒸餾酒叫葡萄白蘭地[1]。通常講的白蘭地，都是指葡萄白蘭地。白蘭地色澤金黃晶亮，具有幽雅細(xì)膩的葡萄果香和濃郁的陳釀橡木香，口味甘冽，在世界范圍內(nèi)廣受消費(fèi)者歡迎。多酚類物質(zhì)是一類具有大而復(fù)雜結(jié)構(gòu)的化合物，從本質(zhì)上講酚是芳香環(huán)上聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)羥基的化合物，含有酚官能團(tuán)。多酚類物質(zhì)是葡萄中重要的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)所釀葡萄酒的特征和品質(zhì)非常重要。同時(shí)，多酚類物質(zhì)也是白蘭地的重要特征成分，對(duì)酒的感官起著重要作用，是評(píng)價(jià)白蘭地品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[2]。因此，準(zhǔn)確地定量分析白蘭地中多酚化合物的種類和含量，對(duì)控制白蘭地的品質(zhì)具有重要意義。目前，酒中多酚類物質(zhì)的分析方法主要有高效液相色譜二極管陣列法[3]、高效液相色譜電化學(xué)分析法[4]、毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)法[5]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]等。本文采用反相高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定白蘭地中的多酚類物質(zhì)。采用該檢測(cè)方法，能

夠簡(jiǎn)便快速地對(duì)白蘭地中的多酚化合物進(jìn)行定性及定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

白蘭地：來源于生產(chǎn)企業(yè)或當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 主要設(shè)備和試劑

1.2.1 主要設(shè)備

WATERS2695液相色譜儀（配有2996二極管陣列檢測(cè)器）：美國(guó)waters公司。

1.2.2 主要試劑

甲醇和乙腈為色譜純；甲酸為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、原兒茶酸、丁香醛：購(gòu)自美國(guó)Fluka公司；糠醛、松柏醛、芥子醛、阿魏酸、芥子酸：購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；鞣花酸：購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司；香草醛：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取沒食子酸、糠醛、原兒茶酸、香草酸、丁香酸、香草醛、丁香醛、阿魏酸、芥子酸、松柏醛、芥子醛、鞣花酸、肉桂酸各50mg（精確至0.000 1 g），用甲醇溶解并定容，配成1 000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于4℃下避光保存，備用。用50%（體積比）甲醇水溶液配制質(zhì)量濃度均為0.2、1、2、5、10、50、100mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：InertsilODS3（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：1%甲酸-甲醇溶液（A），1%甲酸-乙腈溶液（B），1%甲酸-水溶液（C），梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradientelution p rocedure

流量：1.0mL/min。進(jìn)樣量：5μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm，320 nm。

1.4.2 樣品前處理

白蘭地樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，在儀器工作條件下進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

根據(jù)待分離物的特點(diǎn)，選擇C18色譜柱為試驗(yàn)用色譜柱。分別考察了waters symmetry C18（4.6mm× 150mm，5μm）、依利特Sinochrom ODS-BP（4.6mm× 200mm，5μm）、迪馬InertsilODS-3（4.6mm×250mm，5μm）對(duì)待測(cè)物的分離效果。結(jié)果顯示，選擇150mm或200mm色譜柱時(shí)，分離效果較差。為了更好地對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離，試驗(yàn)選擇250mm色譜柱，利用長(zhǎng)柱吸附強(qiáng)的特點(diǎn)，使保留相近的化合物得以分開。

2.2 流動(dòng)相的選擇

本文考察了乙腈、甲醇和水作為流動(dòng)相的洗脫效果。單獨(dú)采用乙腈或甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，分析物分離度較差，且峰形拖尾嚴(yán)重。這可能是由于酚羥基易產(chǎn)生電離，在固定相表面有雙重的保留機(jī)制。為了改善這種現(xiàn)象，在流動(dòng)相中添加1%（體積比）甲酸，峰形得到有效改善。此外，為了使分析物得到有效分離，同時(shí)采用乙腈和甲醇作為有機(jī)相進(jìn)行洗脫。通過試驗(yàn)可知，分別在乙腈、甲醇和水中添加1%的甲酸時(shí)，酚酸、酚醛物質(zhì)能夠達(dá)到顯著的分離效果且峰形對(duì)稱。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用等度洗脫，阿魏酸和芥子酸、松柏醛和芥子醛等多種組分在短時(shí)間內(nèi)難以較好地分離，故采用梯度洗脫方式，洗脫程序如1.4.1所述。

2.3 最佳吸收波長(zhǎng)的選擇

在色譜條件下對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，各化合物保留時(shí)間和測(cè)定波長(zhǎng)見表2。

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和檢測(cè)波長(zhǎng)Table2 The retention tim eand detection wavelength of the standards

通過比較13種標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖可知，對(duì)羥基苯甲酸衍生物在260 nm～280 nm有較大吸收，而酚醛類在320 nm附近處有較大吸收。為了提高待測(cè)物的響應(yīng)信號(hào)，本試驗(yàn)同時(shí)選擇275 nm和320 nm兩個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行定量，不同波長(zhǎng)下的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1 多酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 The chrom atogram of polyphenols

2.4 方法的線性關(guān)系和檢出限

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍為0.2、1、2、5、10、50、100mg/L，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。以定量波長(zhǎng)下的色譜峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X做線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)及檢出限見表3。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table3 Linear regression equation，correlation coefficientand detection lim it

續(xù)表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Continue table3 Linear regression equation，correlation coefficientand detection lim it

由表可知，在給定的色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性范圍較寬，相關(guān)系數(shù)較高，檢出限低，適用于分析白蘭地中的多酚化合物。

2.5 回收試驗(yàn)

在已知含量的白蘭地樣品中加標(biāo)，按照儀器條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表4。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table4 The resultsof recovery（n=6）

由表可知，回收率在88.3%～108.3%之間，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.8%以內(nèi)。

2.6 樣品分析

分別對(duì)XO、VSOP、VO、VS等不同類型的30種白蘭地樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 白蘭地多酚物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果分析Table5 Detection resultof polyphenols in brandy

從表可以看出，所有樣品中均檢出沒食子酸、鞣花酸和糠醛；大部分樣品中檢出香草酸、丁香酸、香草醛、丁香醛、芥子醛和松柏醛；選取的30個(gè)樣品中未檢出原兒茶酸、芥子酸、阿魏酸和肉桂酸。圖2為某白蘭地樣品（XO）的色譜圖，該樣品檢出9種多酚物質(zhì)。白蘭地需要在橡木桶中經(jīng)過多年的儲(chǔ)存陳釀才能達(dá)到成熟，在此期間，木桶中的多酚物質(zhì)不斷被吸收，多酚物質(zhì)的含量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)[7]，酒質(zhì)也趨于完善。試驗(yàn)中檢出的沒食子酸、鞣花酸、香草醛、丁香醛和糠醛等均與橡木桶自身組分密切相關(guān)。

圖2 白蘭地樣品色譜圖Fig.2 The Chrom atogram of Brandy

3 結(jié)論

本文建立了白蘭地中多酚類物質(zhì)的高效液相色譜分析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用樣品微膜過濾后直接進(jìn)樣的方式，可以節(jié)省前處理時(shí)間。該方法選用合適的流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)，能夠有效地降低干擾，合理地將待測(cè)物分離，適用于生產(chǎn)中白蘭地品質(zhì)的監(jiān)控。

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Determ ination of Polyphenols in Brandy by High Performance Liquid Chromatography

WUShuai1，2，WANGKun3，YOU Ju3，YANG Jie4
（1.YantaiTesting Center for Food and Drug，Yantai264000，Shandong，China；2.Collegeof Food Science and Engineering，Shandong AgriculturalUniversity，Tai'an 271018，Shandong，China；3.YantaiQuality Certification Consulting Center，Yantai264000，Shandong，China；4.Qingdao Institute for Food and Drug Control，Qingdao266000，Shandong，China）

Thebrandyafter0.45μmmembrane filterwasdetermined using inertsilODS3C18 column（4.6mm× 250mm，5μm）.The polyphenol compoundswere isolated using themobile phase adding 1%formic acid in acetonitrile，methanol and water with gradient elution mode.The results showed that in a certain range，the standard material presented a good linear relationship and the detection limitwas suitable for the quantitative requirements.Thirty brandy sampleswere determined by the abovemethod.The resultsshowed thatall samples were detected outgallic acid，ellagic acid and furfural.Themajority of the sampleswere detected out vanillic acid，syringic acid，vanillin，syringaldehyde，sinapaldehyde and coniferaldehyde.The compoundsof protocatechuic acid，sinapic acid，ferulic acid and cinnamic acidwerenotdetected in thebrandy samples.

high performance liquid chromatography（HPLC）；brandy；polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.037

2015-09-18

吳帥（1979—），女（漢），高級(jí)工程師，博士研究生，研究方向：發(fā)酵工程、食品檢測(cè)。