陳長應(yīng)

（江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校，江蘇徐州221116）

HPLC法測定黑綠豆中花青素的含量

陳長應(yīng)

（江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校，江蘇徐州221116）

為準確測定黑綠豆提取物中花青素的含量提供一種有效的測定方法。用HPLC法測定黑綠豆提取物中花青素的主要成分及其含量，色譜柱：250mm×4.6mm ZORBAXSB-C18，5μm；柱溫：室溫；流動相：甲醇+水，按甲醇∶水=5∶1（體積比）；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL，檢測波長：520 nm。黑綠豆中花青素的含量在1.50 g/mL～13.5 g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相對標準偏差為1.25%（N=6），平均回收率達98.4%。該方法簡便快速，結(jié)果重現(xiàn)性好，定量準確，準確度、精密度高，適用于黑綠豆提取物中花青素的高效液相色譜分析。

HPLC；黑綠豆；花青素

黑綠豆顧名思議就是黑色的綠豆，又叫屏南黑綠豆，屏南特產(chǎn)黑綠豆籽粒中人體所必需的8種氨基酸的含量在0.244%～2.000%。屏南黑綠豆中脂肪含量在1%以下，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)素，屏南黑綠豆中的黑色作物中含有多種微量元素，多種氨基酸、碘、硒、支鏈淀粉、可溶性色素等均為普通作物的幾倍。花青素為黑綠豆中的主要黃酮類物質(zhì)，這是一種廣泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，在自然狀態(tài)下常與各種單糖形成糖苷，稱為花色苷[1-2]。目前，國內(nèi)對黑綠豆提取物中花青素含量測定方面的研究報道極少，更鮮見到采用高效液相色譜法測定黑綠豆針中花青素含量的相關(guān)報道。筆者采用高效液相色譜法對黑綠豆提取物中花青素的含量的測定，該方法簡便準確，可用于測定黑綠豆中花青素含量，是一種有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A紫外-可見檢測器：日本島津公司；TP150超聲波清洗機：天鵬電子新技術(shù)（北京）有限公司；GM-0.33II真空泵（無油）、溶劑過濾器（1 000mL）：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；MEL-204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上

海）有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市正基儀器有限公司；DHG-9240烘干箱：上海一恒科學儀器有限公司；HL-28多功能食品粉碎機：上海海菱電器有限公司。

1.1.2 主要試劑

黑綠豆：市售；純品原花青素（純度98.3%）：河北天福園生物科技有限公司；甲醇、無水乙醇、濃鹽酸，均為分析純；純凈水：杭州娃哈哈集團。

1.2 方法

1.2.1 花青素提取溶劑的配制

用量筒準確量取1mL的濃鹽酸，沿著玻璃棒注入100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，搖勻，配成濃度為1%的鹽酸—甲醇溶液。

1.2.2 樣品前處理

稱取一定量的黑綠豆，用去離子水洗凈后，在烘箱內(nèi)低溫烘干，備用。稱取100 g烘干的黑綠豆，用多功能食品粉碎機粉碎，用80目的篩子過篩。準確稱取干粉0.5 g（精確至0.001 g），于250mL錐形瓶中，加入100mL 1%的鹽酸—甲醇提取液，搖勻，充分混勻，將浸泡液避光置于室溫下保存12 h，然后使用0.45μm濾紙過濾浸泡液后，將過濾液放置在4℃冰箱中保存，殘渣再使用100mL的提取液浸泡12 h，并重復(fù)上述操作，將2次的濾液移入棕色瓶中，備用[3-4]。

1.2.3 標準溶液配制

常溫下，精確稱取原花青素對照品0.01 g，于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液，定容于10mL，搖勻，得到1mg/mL原花青素對照品溶液。用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，濾液于10mL容量瓶中備用[5]。

1.2.4 樣品溶液的制備

準確量取樣品上清液10mL，置于50mL容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，搖勻，超聲處理20min，冷至室溫后用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，濾液于10mL容量瓶中，供高效液相色譜（HPLC）分析。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：250mm×4.6mm ZORBAXSB-C18，5μm；柱溫：室溫；流動相：甲醇+水，按甲醇∶水=5∶1（體積比）；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL，檢測波長：520nm。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線

精確吸取2、4、6、8、10、12 mL標準品儲備液（1 mg/mL），用甲醇溶液分別配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/mL幾種溶液。按儀器色譜條件測其峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程Y=74.124X+5.246，R2=0.999 4?；ㄇ嗨卦?.50μg/mL～13.5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，如圖1。

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 Anthocyanin standard curve

2.2 樣品含量測定

準確量取樣品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容至100mL，吸取樣品溶液10μL進入液相色譜儀，在1.2.5項色譜條件下，測定其峰面積，與標準系列比較，測定樣品中花青素的含量，含量為2.64μg/mL。色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 花青素標準色譜圖Fig.2 Anthocyanin standard chromatogram

圖3 樣品色譜圖Fig.3 Sam ple chromatogram s

由于采用不同比例的甲醇/水為流動相進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相中甲醇含量增加時，原花青素的保留時間縮短，峰形對稱性好，在此流動相中，甲醇含量增加，保留時間縮短，峰形更加對稱，靈敏度高，當甲醇

含量減少，保留時間延長，靈敏度降低，峰形出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

3 分析與討論

3.1 黑綠豆中花青素提取條件優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑的選擇

準確量取黑綠豆提取液1mL，共4份，分別置于100mL容量瓶中，再分別加入甲醇、95%乙醇、1%鹽酸甲醇溶液和1%鹽酸乙醇溶液各50mL，定容至100mL，超聲處理20min，冷至室溫后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取1mL過濾液，按照1.2.5項色譜條件下，測定其峰面積，根據(jù)峰面積，計算黑綠豆中花青素的提取率，最后確定1%的鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑。

3.1.2 提取溶液中鹽酸用量的選擇

準確量取黑綠豆提取液1mL，共5份，分別置于100mL容量瓶中，再分別加入甲醇50mL、0.5%鹽酸甲醇溶液（體積分數(shù)）50mL、1%鹽酸甲醇溶液（體積分數(shù)）50mL、1.5%鹽酸甲醇溶液（體積分數(shù)）50mL和2%鹽酸甲醇溶液（體積分數(shù)）50mL，定容至100mL，超聲處理20min，冷至室溫后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取1mL，按照1.2.5項色譜條件下，測定其峰面積，根據(jù)峰面積，計算黑綠豆中花青素的提取率[7]。在提取溶劑中加入一定濃度的鹽酸是為了防止提取過程中非?；幕ㄇ嗨亟到?，但花青素在中性條件下與金屬離子發(fā)生絡(luò)合沉淀，不利于提取，通過酸化處理才能斷裂花青素與蛋白質(zhì)、多糖及本身離子間的氫鍵和疏水鍵，及金屬離子絡(luò)合鍵，提高提取率，隨著酸濃度增加，提取率隨之降低[6-7]。最后確定提取溶液鹽酸濃度為1%。

3.1.3 黑綠豆中花青素提取時間的選擇

準確量取黑綠豆提取液1mL，共6份，分別置于6個100mL容量瓶中，再分別加入1%鹽酸甲醇50mL于6份樣品中，定容至100mL，密封狀態(tài)下，超聲處理，時間分別為5、10、15、20、25、30min，冷至室溫后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取1mL，然后按照1.2.5項色譜條件下，測定其峰面積。超聲處理時間過短，原花青素不能充分提取，若時間加長，加速了紫甘薯中原花青素的浸提，但是，隨著時間越長，糊化現(xiàn)象出現(xiàn)機率很高，使提取劑和廢渣難以通過抽濾分離，浸提量反而下降，這可能是隨著超聲處理時間的延長，使料液溫度增高，導(dǎo)致原花青素酚羥基結(jié)構(gòu)破壞，低聚原花青素被破壞，影響提取率[8-9]，因此，確定超聲處理時間最后確定為20min。

3.1.4 黑綠豆中花青素提取溫度的選擇

準確量取黑綠豆提取液1mL，共5份，分別置于100mL容量瓶中，再分別加入1%鹽酸甲醇50mL，定容至100mL，分別在20、30、40、50、60℃條件下超聲處理20min，冷卻后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取濾液1mL，然后按照1.2.5項色譜條件下，測定其峰面積，根據(jù)峰面積，計算黑綠豆中花青素的提取率。隨著反應(yīng)溫度的升高，提取率先增大然后略有降低，在50℃時達到最大值。隨溫度升高，分子運動速度加快，原花青素浸出速度加快，提取率增加，但原花青素為熱不穩(wěn)定物質(zhì)，高溫會使原花青素氧化破壞，穩(wěn)定性減弱，高溫下低聚原花青素被破壞，提取率下降[10-11]。最后確定提取溫度確定為50℃。

3.1.5 黑綠豆中花青素提取料液比的選擇

準確量取黑綠豆提取液1mL，共5份，分別置于100mL容量瓶中，分別加入1%鹽酸甲醇50mL，定容至100mL，分別選取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）條件下，超聲處理20 min，冷卻后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取濾液1mL，然后按照1.2.5項色譜條件下，測定其峰面積。根據(jù)峰面積，計算黑綠豆中花青素的提取率。試驗結(jié)果顯示，提取率先增大然后降低，當料液比為1∶20（g/mL）時，提取率最高，若再增大料液比，在過濾過程中，就會增大溶劑與過濾儀器的接觸面積，延長過濾時間，從而增加原花青素的過濾損耗，最后提取料液比確定為1∶20（g/mL）[12-13]。

3.2 精密度試驗

準確移取1.0mL同一樣品溶液6份，于6個10mL容量瓶中，分別用流動相稀釋至刻度，搖勻，超聲處理20min，冷卻后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，按1.2.5方法進行HPLC分析，計算相對標準偏差為1.25%（N=6），結(jié)果表明本方法精密度良好[14]。精密度試驗見表1，精密度標準誤差線見圖4。

表1 精密度試驗Table1 Precision experiment results

圖4 精密度標準誤差線Fig.4 The precision of standard error of the line

3.3 回收率試驗

精密量取已知準確含量的樣品溶液5mL 6份，于6個100mL容量瓶中，分別加入已知含量的花青素標準溶液，加流動相稀釋至刻度，搖勻，超聲處理20min，冷卻后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取濾液1mL，然后按照1.2.5項色譜條件下記錄色譜圖，測定其峰面積，計算回收率[15]?；厥章蔬_98.4%，RSD值為3.46%。加標回收試驗結(jié)果見表2，回收率標準誤差線見圖5。

表2 加標回收試驗結(jié)果Tab le2 The resultsof standard addition recovery

圖5 回收率標準誤差線Fig.5 Recovery rateof standard error of the line

3.4 重現(xiàn)性試驗

精確量取同一批次的樣品6份，每份5mL，分別置50mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，搖勻，超聲處理20min，冷卻后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取濾液1mL，然后按照1.2.5項色譜條件下記錄色譜圖，測定其峰面積，依次操作。得到結(jié)果：92.331 8、93.311 9、92.421 8、91.877 6、92.351 7、92.509 5，得均值92.467 4，RSD為0.184%，表明方法重現(xiàn)性良好[16]。峰面積標準誤差線見圖6。

圖6 峰面積標準誤差線Fig.6 Thepeak area of standard error of the line

3.5 穩(wěn)定性試驗

精確量取同一批次的樣品5mL，分別置50mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，搖勻，超聲處理20min，冷卻后，用0.45μm針筒式濾膜過濾器過濾，分別取濾液1mL，然后按照1.2.5項色譜條件下分別在0、6、12、24、36、72 h測定一次峰面積，結(jié)果其峰面積的RSD為1.02%，表明樣品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

4 結(jié)論

在提取溶劑為1%鹽酸甲醇溶液（體積分數(shù)）、超聲處理20min、提取溫度為50℃、提取料液比為1∶20（g/mL），在色譜柱為250mm×4.6mm ZORBAXSBC18，5μm；柱溫：室溫；流動相：甲醇+水，按甲醇∶水= 4∶1（體積比）；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL的條件下，對黑綠豆中花青素含量進行測定，測定結(jié)果表明：花青素線性范圍1.50μg/mL～13.5μg/mL，相對標準偏差為1.25%（N=6），加標平均回收率為98.4%，重現(xiàn)性較好，該方法簡便準確，可作為黑綠豆中花青素含量的測定方法。

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Determ ining the Content of Anthocyanins in Black M ung Bean by HPLC

CHENChang-ying
（Jiangsu Xuzhou High MedicalVocationalSchool，Xuzhou 221116，Jiangsu，China）

This article is to provide an effectivemethod which can accurately determine the anthocyanins content in black mung bean extract.Under high performance liquid chromatography（HPLC）method，themain composition of anthocyanins and its content in blackmung bean extractwas determined.Themain conditions used in themethodwere as follows：chromatographic column：250mm×4.6mm ZORBAXSB-C18，5μm；column temperature：room temperature；mobilephase：methanol+waterwith volume ratiobeingmethanol：water= 5∶1；flow rate：1.0mL/min；sample quantity：10μL，detection wavelength：520 nm.The Anthocyanins content in blackmung beanwasaround 1.5 g/mL-13.5 g/mL and ithad good linear relationship with the peak area，the relative standard deviationwas1.25%（N=6）and the average recovery ratewas98.4%.Thismethod issimple，efficient and quantitatively accurate with high reproducibility and precision，which makes it suitable for HPLCanalysisofanthocyaninsin blackmungbean extract.

HPLC；blackmungbean；anthocyanins

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.035

2016-02-19

陳長應(yīng)（1965—），男（漢），副教授，碩士，主要從事化學教學、分析工作。