韓蕓，梁偉玲，徐迎濤，吳君，李德芳，*

（1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺264003；2.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東煙臺264199）

廣藿香總黃酮提取工藝及抑菌活性研究

韓蕓1，梁偉玲2，徐迎濤2，吳君2，李德芳1，*

（1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺264003；2.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東煙臺264199）

優(yōu)化廣藿香總黃酮提取工藝并評價(jià)其抑菌活性。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇提取時(shí)間、溫度、液料比采用三因素三水平的RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化其工藝參數(shù)；通過對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌及枯草芽孢桿菌抑制作用評價(jià)廣藿香總黃酮抑菌作用。通過RMS模型預(yù)測，最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度85%，提取溫度86.5℃，提取時(shí)間90min，液料比51.2∶1（mL/g），提取1次，在此條件下廣藿香總黃酮提取率理論值為0.889mg/g。實(shí)際值為（0.878± 0.027）mg/g（n=3）；廣藿香總黃酮濃縮液對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌均具有明顯的抑制作用，與5%苯甲酸鈉溶液抑菌活性相當(dāng)。

廣藿香；總黃酮；提取工藝；抑菌

廣藿香為唇形科植物廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.的干燥地上部分，具有芳香化濁、和中止嘔、發(fā)表解暑等功效[1]；廣泛分布于中國、印度尼西亞、馬來西亞及巴西。廣藿香主要有效成分為揮發(fā)性成分，目前有關(guān)廣藿香揮發(fā)油成分方面的文獻(xiàn)報(bào)道較多，不同部位揮發(fā)油含量與種類均不同[2]，主要包括黃酮、烯烴、萜烯類及萜醇類化合物[3]，其中以廣藿香醇（百秋李醇）、廣藿香烯、廣藿香酮為其特征成分。而歷版《中國藥典》均以廣藿香醇為廣藿香藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，對廣藿香中黃酮類成分研究尚不夠重視。此外，目前廣藿香中總黃酮的提取工藝優(yōu)化還無報(bào)導(dǎo)。因此本文以廣藿香中總黃酮為研究對象，采用響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化其提取工藝并研究其抑菌活性。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

廣藿香藥材：廣東致信藥業(yè)（批號：20141012）；蘆?。褐袊称匪幤窓z定研究院（批號：100080-201409）；

聚酰胺：上海阿拉丁生化科技股份有限公司（80目～100目，使用前用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇預(yù)處理）；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH及乙醇等均為分析純（AR）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）：購自于廣東省微生物研究所。

1.2 試驗(yàn)儀器

層析柱（2.6 cm×30 cm）：江陰市新輝層析設(shè)備有限公司；UV-360紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；TDL-5低速臺式大容量離心機(jī)：上海安亭；FA2004N萬分之一分析天平：上海菁科儀器有限公司；XSE-105十萬分之一分析天平：梅特勒-托利多公司；YB-300A多功能粉碎機(jī)：運(yùn)邦中藥粉碎機(jī)廠。

2 方法及結(jié)果

2.1 廣藿香總黃酮含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4]

精密稱取蘆丁對照品10.28mg，置于20mL容量瓶中，以85%乙醇定容至刻度，即得0.514mg/mL對照品溶液。分別吸取0.2、0.4、0.8、1.2、2.0mL于10mL容量瓶中，以85%乙醇定容至刻度。取各濃度對照品溶液5mL于具塞試管中，分別加入0.6mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液，搖勻后靜置5min，再分別加入0.6mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置5min，再加入5mL 4%NaOH溶液，搖勻、靜置15min。以85%乙醇為空白校零，于509 nm處測量各濃度對照品的吸光度值（Abs），以蘆丁對照品溶液濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、Abs（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

2.1.2 廣藿香供試品溶液的制備

精密稱取廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，80℃下回流提取90min，趁熱過濾提取液，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，再用85%乙醇沖洗、溶解圓底燒瓶上殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至20mL容量瓶中并用85%乙醇定容，即得廣藿香供試品溶液。

2.1.3 精密度試驗(yàn)考察

精密稱定廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，按“2.1.2”中方法制備供廣藿香試品溶液、測定Abs，試驗(yàn)平行6次，結(jié)果Abs的RSD值為0.93%，表明方法精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)考察

精密稱定6份廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，按“2.1.2”中方法制備供廣藿香試品溶液、測定Abs，試驗(yàn)平均3次，測定廣藿香總黃酮含量為0.821mg/g，RSD值為0.88%。表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察

精密稱定廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，按“2.1.2”中方法制備供廣藿香試品溶液，分別于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h測定Abs，結(jié)果Abs的RSD值為1.04%，表明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 加樣回收率考察

精密稱定6份廣藿香粉末（過40目篩）1.0 g，加入0.514mg/mL對照品溶液1.6mL，按“2.1.2”中方法制備供廣藿香試品溶液，測定吸光度值，結(jié)果加樣回收率為99.3%，RSD值為1.16%，表明加樣回收率滿足試驗(yàn)需求。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對提取率的影響

分別以65%、75%、85%、90%及95%乙醇為提取溶劑，考察不同濃度的乙醇溶劑對總黃酮提取率的影響，其余條件同“2.1.2”項(xiàng)，測定Abs，計(jì)算廣藿香總黃酮提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對提取率的影響Fig.1 Effectof ethanolconcentration on extraction rate

結(jié)果表明乙醇濃度在85%左右時(shí)，總黃酮提取率最高，超過乙醇濃度85%后其提取率反而下降，因此選擇85%乙醇為提取溶劑。

2.2.2 提取時(shí)間對提取率的影響

精密稱取5份廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，分別回流提取50、60、70、80、90、100min，其余同“2.1.2”項(xiàng)下內(nèi)容，計(jì)算廣藿香總黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對提取率的影響Fig.2 Effectof extraction tim eon extraction rate

結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮提取率

也在增加，但超過80min，提取率增加不明顯，因此選擇80min為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 提取溫度對提取率的影響

精密稱取5份廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，分別于55、65、75、85、95℃下回流提取80min，其余同“2.1.2”項(xiàng)下內(nèi)容，計(jì)算廣藿香總黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 Effectofextraction tem peratureon extraction rate

結(jié)果表明，總黃酮提取率隨著提取時(shí)間的增加而增加，但超過85℃后，提取率不再增加，因此選擇85℃為最佳提取溫度。

2.2.4 液料比對提取率的影響

精密稱取5份廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，分別加入70、80、90、100、110mL 85%乙醇，85℃下回流提取80min，其余同“2.1.2”項(xiàng)下內(nèi)容，計(jì)算廣藿香總黃酮提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 液料比對提取率的影響Fig.4 Effectof liquid tomaterial ratio on extraction rate

結(jié)果表明，總黃酮提取率隨著液料比的增加而增加，最優(yōu)液料比為50∶1（mL/g）左右。

2.2.5 提取次數(shù)對提取率的影響

精密稱取3份廣藿香粉末（過40目篩）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，85℃下回流提取80min，分別提取1、2、3次，其余同“2.1.2”項(xiàng)下內(nèi)容，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 提取次數(shù)對提取率的影響Fig.5 Effectof extraction timeson extraction rate

結(jié)果表明提取次數(shù)對提取率無明顯影響，可能因?yàn)橐毫媳容^大，提取比較完全。從節(jié)約材料及能源角度出發(fā)，選擇提取1次。

2.3 RSM法優(yōu)化提取工藝

通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選出乙醇濃度為85%、提取時(shí)間80min、提取溫度85℃、液料比50∶1（mL/g），提取次數(shù)1次；將乙醇濃度固定為85%、提取次數(shù)為1次，分別設(shè)定80min、85℃及50∶1（mL/g）為提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）及液料比（X3）的中心點(diǎn)（0值），上下浮動，以總黃酮提取率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1～表2。

表1 Box-Behken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table1 Factorsand levelsof Box-Behken design

表2 總黃酮提取率的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table2 Resultsof total flavonoidsextraction rateby response surfacem ethod

對表2數(shù)據(jù)采用Design Expert8.0.5軟件進(jìn)行處理和分析，獲得總黃酮提取率（Y）對提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）及液料比（X3）的二次多元回歸方程：

該回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table3 Resu ltsof regression coefficientand significance test

表3顯示模型的P＜0.01，表明該回歸方差模型極其顯著，說明試驗(yàn)方法可靠。回歸系數(shù)R2=0.995＞0.9，表明該模型相關(guān)度好。其中X1、X2、X3、X1X2、X12及X32方差分析的P值均小于0.01，表明差異極其顯著。響應(yīng)面3D模型及等高線圖見圖6～圖8。

圖6 提取時(shí)間與提取溫度對提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surfaceand contourmap ofextraction timeand extraction tem peratureaffecton theextraction rate

圖7 提取時(shí)間與液料比對提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Responsesurfaceand contourmap ofextraction timeand liquid tom aterial ratio affecton theextraction rate

圖8 液料比與提取溫度對提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Responsesurfaceand contourmap ofextraction tem peratureand liquid tomaterial ratio affecton theextraction rate

根據(jù)試驗(yàn)所得模型，預(yù)測最優(yōu)工藝條件：乙醇濃度為85%，提取溫度86.5℃，提取時(shí)間90min，液料比51.2∶1（mL/g），提取1次，在此條件下廣藿香總黃酮提取率理論上可達(dá)到0.889mg/g。經(jīng)3次平行試驗(yàn)，提取率實(shí)際值為（0.878±0.027）mg/g（n=3），與理論值較為吻合，因此，采用RSM法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)可靠。

2.4 廣藿香總黃酮抑菌活性

2.4.1 聚酰胺純化總黃酮[4]

按2.3項(xiàng)下優(yōu)化條件提取總黃酮，提取液濃縮至適量，上聚酰胺層析柱，首先采用去離子水洗脫，至洗脫液無色后再用相當(dāng)于5倍柱體積的20%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇沖洗，棄洗脫液，再用50倍柱體70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗脫，收集該段洗脫液，濃縮至1 g/mL左右，即得純化的廣藿香總黃酮濃縮液。

2.4.2 菌懸液的制備

將菌種接種到相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基，細(xì)菌37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)3次。以無菌生理鹽水配制成菌體濃度為106cfu/mL～107cfu/mL的菌懸液，備用。

2.4.3 抑菌作用的測定[5]

培養(yǎng)皿（直徑15 cm），每培養(yǎng)皿加入培養(yǎng)基40mL，待凝固后，移取各細(xì)菌懸液0.6mL加入各平板上，涂布均勻，每皿平穩(wěn)、等距放置5個(gè)滅菌牛津杯，于其中滴加廣藿香總黃酮濃縮液，以5%苯甲酸鈉及滅菌生理鹽水作為陽性及陰性對照，每菌平行操作3次。移去牛津杯，量取各抑菌圈直徑，結(jié)果見表4。

表4 廣藿香總黃酮抑菌圈直徑Table4 Inhibitory circle diameter of total flavonoids from Pogostemon cablin mm

表4顯示，廣藿香總黃酮濃縮液對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌均具有明顯的抑制作用，抑菌順序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞鼠傷寒沙門氏菌＞大腸桿菌。各組與5%苯甲酸鈉溶液對比，均無顯著性差異。

3 小結(jié)與討論

目前工藝參數(shù)優(yōu)化的設(shè)計(jì)主要有正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)等；響應(yīng)面法通過多元二次回歸方程來擬合各試驗(yàn)參數(shù)與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，對回歸方程進(jìn)行二階偏導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)計(jì)算得到最優(yōu)工藝參數(shù)，相比于其他優(yōu)化方法，可以客觀表達(dá)出工藝參數(shù)之間的交互作用，并預(yù)測最優(yōu)參數(shù)組合[6]。本實(shí)驗(yàn)通過RSM優(yōu)化后參數(shù)提取總黃酮，其提取率明顯高于其他參數(shù)下的提取率。

黃酮類有效物質(zhì)的提取方法有微波輔助提取、超聲波輔助提取及熱回流提取等。微波、超聲波輔助提取雖然快捷、高效的優(yōu)勢，但易導(dǎo)致黃酮類成分結(jié)構(gòu)破壞、分解，不易控制提取時(shí)間，反而降低總黃酮提取率[7-8]。因此本文采用傳統(tǒng)的熱回流提取方法提取總黃酮。

RSM用于廣藿香總黃酮提取條件優(yōu)化方法可靠；此外，廣藿香總黃酮對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌具有良好的抑菌活性。

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Study on Extraction and Antibacterial Activities of Total Flavonoids from Pogostemon cablin（Blanco）Benth.

HANYun1，LIANGWei-ling2，XU Ying-tao2，WU Jun2，LIDe-fang1，*
（1.Binzhou MedicalUniversity，Yantai264003，Shandong，China；2.Shandong Collegeof Traditional ChineseMedicine，Yantai264199，Shandong，China）

To optimize the extraction process of total flavonoids from Pogostemon cablin and evaluate its antibacterialactivity，3 factorsand 3 levelsofRSM was designed to optimize the extraction time，temperature and ratioof liquid tomaterial，and the processparameterswereoptimized based on the single-factorexperiment.Inhibition effectof total flavonoids of Pogostemon cablin was evaluated by the effect on Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis.Predicted by themodel of RSM，the best extraction conditionswere ethanol concentration 85%，extraction temperature 86.5℃，extraction time 90min，ratio of liquid tomaterial51.2∶1（mL/g）.Under these conditions，the theoretical valuesofextraction ratewas 0.889mg/g and the actualvaluewas（0.878±0.027）mg/g（n=3）.Total flavonoids from Pogostemon cablin had obvious inhibitory effecton Salmonella typhimurium，Staphylococcusaureus，Bacillus subtilis and Escherichia coli，and theantibacterialactivitywasequivalent to5%ofsodium benzoatesolution.

Pogostemon cablin（Blanco）Benth.；total flavonoids；extraction process；antibacterialactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.016

2016-03-24

山東省高等學(xué)校優(yōu)勢學(xué)科人才團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃（The Dominant Disciplines'Talent Team Development Scheme of Higher Education of Shandong Province）

韓蕓（1982—），女（漢），講師，博士生，研究方向：中藥復(fù)發(fā)藥理研究。

*通信作者