王炳花， 張瑞梅， 成 松， 席向宇*

(1徐州醫(yī)科大學(xué)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，徐州 221004； 2徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科； *通訊作者，E-mail：xxy1891@163.com)

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CD209基因Rs4804803位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性關(guān)系

王炳花1， 張瑞梅2， 成 松2， 席向宇2*

(1徐州醫(yī)科大學(xué)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，徐州 221004；2徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科；*通訊作者，E-mail：xxy1891@163.com)

目的 探討CD209基因的Rs4804803位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性關(guān)系。 方法 采用病例對(duì)照研究的方法，選取58例肺結(jié)核病例和62例健康對(duì)照，用ABI prism 310測(cè)序儀對(duì)CD209基因的Rs4804803位點(diǎn)進(jìn)行DNA測(cè)序，并用GeneMapper4.1進(jìn)行SNP分型分析，比較CD209基因Rs4804803位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布情況。 結(jié)果 Rs4804803位點(diǎn)的基因型AA、AG、GG頻率在肺結(jié)核組分別為86.21%，13.79%和0，對(duì)照組分別為83.87%，12.90%和3.23%，肺結(jié)核組和對(duì)照組之間的基因型頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 CD209基因的Rs4804803位點(diǎn)的多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性無(wú)關(guān)。

CD209基因； 多態(tài)性； 肺結(jié)核

結(jié)核病(tuberculosis)是由結(jié)核分支桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種復(fù)雜性疾病，其影響因素有很多，除環(huán)境因素之外，遺傳因素與結(jié)核病的易感性之間也存在非常重要的關(guān)聯(lián)性。目前已知的結(jié)核病的易感基因有人類(lèi)自然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1基因(NRAMP1)、 維生素 D 受體(VDR) 基因、 甘露糖結(jié)合凝集素基因(MBL)、人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)基因、 γ-干擾素 (NF- γ) 受體基因、樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子(DC-SIGN或CD209)、白細(xì)胞介素(IL)基因等[1，2]。而CD209基因與結(jié)核的易感性關(guān)系研究爭(zhēng)議頗多，本研究主要目的是分析CD209基因中的Rs4804803位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群肺結(jié)核易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

58例病例來(lái)自徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科，經(jīng)痰培養(yǎng)陽(yáng)性確診的肺結(jié)核病人，排除嚴(yán)重的肝、腎、心腦血管疾病以及其他呼吸系統(tǒng)疾??；62例健康對(duì)照為本院醫(yī)護(hù)人員，年齡性別與病例組均衡可比，均為漢族人群。

1.2 全血DNA提取及樣本質(zhì)控

抽取研究對(duì)象靜脈血3 ml，離心后取白細(xì)胞提取DNA，操作步驟參照試劑盒要求進(jìn)行。然后取1 μl DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢查以及NanoDrop進(jìn)行濃度檢測(cè)，然后根據(jù)估計(jì)的濃度將樣本稀釋到工作濃度5-10 ng/μl。

1.3 基因分型分析

1.3.1 PCR 反應(yīng) 在NCBI中搜索Rs4804803位點(diǎn)的序列，用primer primier5.0設(shè)計(jì)Rs4804803位點(diǎn)引物序列，上游引物：5′-GGGGTTGACAGGGAGAAG-3′，下游引物：5′-CAGTGCCTCCTCAGTTTCC-3′。

PCR程序：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.2 測(cè)序及分型 采用ABI prism 310測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序，過(guò)程參照ABI PRISM Protocol。SNP分型用GeneMapper4.1(Applied biosystems)進(jìn)行分析(由上海璣牧生物科技有限公司檢測(cè))。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值變量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，分類(lèi)變量資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本信息

本次研究共收集研究對(duì)象120例，肺結(jié)核病例58例，健康對(duì)照62例。病例組和對(duì)照組在年齡和性別方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

表1 研究對(duì)象的年齡和性別比較

Table 1 Comparison of age and sex between two groups

組別n年齡(歲)男/女病例組5845.04±22.1943/15對(duì)照組6239.05±13.8545/17t/χ21.610.04P 0.110.85

2.2 兩組基因型及等位基因分布情況

經(jīng)PCR擴(kuò)增和SNP分型分析可知，病例組共有兩種基因型，其基因型AA、AG頻率分別為86.21%和13.79%，而對(duì)照組則有3種基因型，其基因型AA、AG、GG頻率分別為83.87%，12.90%，3.23%。兩組基因型及等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2)。

2.3 PCR測(cè)序結(jié)果

DNA測(cè)序結(jié)果顯示Rs4804803位點(diǎn)主要有3種不同基因型AA、AG和GG，由于測(cè)序時(shí)用的是下游引物，所以測(cè)序結(jié)果顯示的等位基因恰好是反向互補(bǔ)序列(見(jiàn)圖1-3)。

表2 肺結(jié)核病例和對(duì)照之間Rs4804803位點(diǎn)基因型與等位基因分布 例(%)

Table 2 Distribution of the genotype and allele frequencies of the Rs4804803 in PTB and controls cases(%)

基因型病例組對(duì)照組χ2POR(95%CI)基因型0.360.55AA50(86.21)52(83.87)1.00 AG+GG8(13.79)10(16.13)0.73(0.26-2.06)等位基因0.610.44A108(93.10)112(90.32)0.69(0.27-1.76)G8(6.90)12(9.68)

圖1 肺結(jié)核病例和對(duì)照的Rs4804803位點(diǎn)的AA基因型序列Figure 1 AA genotype sequence of Rs4804803 in PTB and controls

圖2 肺結(jié)核病例和對(duì)照的Rs4804803位點(diǎn)的AG基因型序列Figure 2 AG genotype sequence of Rs4804803 in PTB and controls

3 討論

CD209基因的編碼蛋白為C凝集素，它是人類(lèi)免疫細(xì)胞識(shí)別結(jié)核分支桿菌的重要受體蛋白，可以作為細(xì)胞表面黏附分子識(shí)別進(jìn)入人體的結(jié)核分支桿菌。該基因啟動(dòng)子區(qū)的Rs4804803位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)核的易感性之間的關(guān)系沒(méi)有定論，Barreiro等[3]對(duì)南非人群的一項(xiàng)隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，336G基因型為肺結(jié)核的保護(hù)因素，同時(shí)也提到非洲人群G基因的突變率要高于亞洲、歐洲和美洲人群。Vannberg等[4]在大樣本病例對(duì)照研究中也發(fā)現(xiàn)，336G是非洲人群結(jié)核保護(hù)因素。但是國(guó)內(nèi)的莊斌等[5]卻發(fā)現(xiàn)CD209基因-336位點(diǎn)GG基因型可能是中國(guó)漢族人群的肺結(jié)核易感基因型。Naderi等[6]對(duì)伊朗人群研究發(fā)現(xiàn)，CD209基因Rs4804803位點(diǎn)多態(tài)性可以增加患肺結(jié)核的危險(xiǎn)性。一項(xiàng)對(duì)巴西人群的病例對(duì)照研究[7]同樣發(fā)現(xiàn)，-336A/G SNPs與肺結(jié)核有一定的相關(guān)性，等位基因G為肺結(jié)核的保護(hù)因素。Yi等[8]通過(guò)meta分析，發(fā)現(xiàn)-336A/G多態(tài)性可以增加亞洲人群患結(jié)核的危險(xiǎn)性，但是在整個(gè)遺傳模型中與結(jié)核病的發(fā)病無(wú)關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)漢族人群中，Rs4804803位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)核的發(fā)病無(wú)關(guān)，這與Zheng等[9]在中國(guó)漢族人群中的研究結(jié)論一致。除Rs4804803位點(diǎn)外，CD209基因與結(jié)核有關(guān)的其他位點(diǎn)研究比較多的是Rs735239(-871A/G)，除此之外，Kobayashi等[10]發(fā)現(xiàn)CD209基因的Rs735240位點(diǎn)與印尼人群結(jié)核發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核組只有2種基因型，而健康對(duì)照組有3種基因型，雖然總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但主要原因可能與樣本含量太少有關(guān)，由于經(jīng)費(fèi)問(wèn)題，所以本研究只選取了一個(gè)SNP位點(diǎn)，樣本例數(shù)也偏少，所以需要增大樣本含量，在大人群中驗(yàn)證該基因與肺結(jié)核易感性的確切關(guān)系。

圖3 肺結(jié)核病例和對(duì)照的Rs4804803位點(diǎn)的GG基因型序列Figure 3 GG genotype sequence of Rs4804803 in PTB and controls

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Association between CD209 Rs4804803 gene polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis

WANG Binghua1,ZHANG Ruimei2,CHENG Song2, XI Xiangyu2*

(1DepartmentofEpidemiologyandHygieneStatistics,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China;2DepartmentofTuberculosis,XuzhouInfectiousDiseaseHospital;*Correspondingauthor,E-mail：xxy1891@163.com)

ObjectiveTo evaluate the association between CD209 Rs4804803 gene polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis(PTB) in Han population of China.MethodsThis case-control study was performed on 58 PTB patients and 62 healthy individuals. CD209 gene Rs4804803 DNA sequence was detected by the ABI prism 310 sequenator, and SNP gene type was analyzed using GeneMapper4.1 technology.ResultsThe genotype frequency of Rs4804803 in PTB was 86.21% for AA, 13.79% for AG, 0 for GG, while the frequency of Rs4804803 in controls was 83.87% for AA,12.90 for AG,3.23% for GG.There was no significant difference in the genotype frequency of Rs4804803 between PTB and controls(P>0.05).ConclusionThe results suggest that CD209 Rs4804803 gene polymorphism may not be associated with PTB.

CD209 gene； polymorphism； pulmonary tuberculosis

徐州市科技局社會(huì)發(fā)展基金資助項(xiàng)目(KC14SH054)

王炳花，女，1981-08生，碩士，講師，E-mail:beyond0830@163.com

2016-08-29

R521

A

1007-6611(2016)11-0998-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.009