胡慧艷，賈 青,2?，孫鳳莉，趙思思，錫建中，李曉敏

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000；3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000）

河北太行雞含黃素單氧化酶3基因型頻率分布研究

胡慧艷1，賈 青1,2?，孫鳳莉3，趙思思1，錫建中1，李曉敏1

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000；3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000）

本試驗(yàn)旨在研究含黃素單氧化酶3（Flavin-Containing Monooxygenase 3, FMO3）基因T329S 突變在河北太行雞群體中的分布。本研究根據(jù)GenBank 中公布的雞FMO3 基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR-RFLP 方法對517只河北太行雞FMO3 基因頻率及基因型頻率進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，該位點(diǎn)在河北太行雞群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；等位基因A、T 頻率分別為0.9023、0.0976；AA、AT、TT 基因型頻率分別為0.8201、0.1644、0.0155。結(jié)果表明，河北太行雞群體中魚腥味綜合癥易感基因型頻率不高，可以通過PCR-RFLP 的方法予以剔除。

河北太行雞；含黃素單氧化酶3基因；基因型頻率；PCR-RFLP

含黃素單氧化酶3基因（flavin- containingmonooxygenase3，F(xiàn)MO3）又名魚腥味基因，位于雞8號染色體。諸多研究表明，F(xiàn)MO3基因存在多態(tài)性，這種多態(tài)性不僅存在于人類也存在于動(dòng)物中。該基因第七外顯子上第694位堿基由A突變?yōu)門，從而引起329位氨基酸由蘇氨酸（T）突變?yōu)榻z氨酸（S），故將該位點(diǎn)定義為T329S。Vondel l[1]首次對魚腥味雞蛋進(jìn)行了報(bào)道，雞蛋魚腥味的產(chǎn)生與FM O 3基因上的一個(gè)非同義突變（Nonsynonymous mutation），即T329S位點(diǎn)密切相關(guān)，這個(gè)突變位點(diǎn)改變了該基因進(jìn)化上的一個(gè)高度保守五肽基序FATGY，造成三甲胺（Trimethylamine，TMA）氧化能力降低，引起三甲胺的沉積。

在蛋雞生產(chǎn)中，由于飼料來源廣泛，可能含有TM A或其前體物質(zhì)，帶有這種基因缺陷的蛋雞體內(nèi)的三甲胺不能正常代謝，從而導(dǎo)致了三甲胺在雞蛋中沉積而產(chǎn)生了魚腥味雞蛋[2]。研究報(bào)道，三甲胺主要存在于蛋黃中，攜帶魚腥味雞蛋蛋黃中TM A的含量為正常雞蛋蛋黃中含量的10倍[3]，魚腥味嚴(yán)重降低了雞蛋的品質(zhì)和口感。張龍超[4]、Chu等[5]、邱家維等[6]分別對我國不同地方雞種FM O 3基因T329S位點(diǎn)基因型分析表明部分地方雞品種有攜帶魚腥味的個(gè)體。對于飼養(yǎng)量眾多的河北太行雞未見其研究報(bào)道。本研究旨在檢測FM O 3基因T329S突變位點(diǎn)在太行雞群體中的分布，對于剔除攜帶魚腥味敏感基因的個(gè)體，為太行雞的改良和選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 本試驗(yàn)所選取的河北太行雞均為純種。血樣采集在翅下靜脈，約0.5 mL，采用ACD抗凝劑對血液進(jìn)行抗凝，共計(jì)422個(gè)樣品。肝臟組織樣品采集約0.5 g，放入1.5 mL Eppendorf管中，收集肝臟樣品95個(gè)。置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì) 據(jù)GenBank中雞FM O 3的基因序列（登錄號AJ 431390），獲得含T329S突變位點(diǎn)的序列信息。應(yīng)用Pri m er Prem i er 5引物設(shè)計(jì)軟件，針對T329S位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物由北京華大科技公司合成。所用引物序列為：

1.3 PPCCRR反應(yīng) 本試驗(yàn)均采用10 μL PCR反應(yīng)體系：dd H20 7.1 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，（2.5 mm）dN TPs 0.8 μL，（10 μM）上下游引物各0.2 μL，Taq DN A聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，（100 ng/μL）DN A模板0.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，退火溫度67℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含0.05%GV），電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR擴(kuò)增情況。

1.4 酶切反應(yīng)體系 采用PCR-RFLP方法檢測太行雞個(gè)體FM O 3基因的基因型，限制性內(nèi)切酶為Bsr I，該內(nèi)切酶所切序列為：5’-ACTGGN↓-3’，3’-TGAC↑CN-5’，其中箭頭所指位置為酶切位點(diǎn)。PCR-Bsr I酶切總體系為10 μL，酶切體系為：滅菌dd H2O 4 μL，10×Buffer 0.5 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，Brs I限制性內(nèi)切酶（10 U/μL）0.5 μL。酶切溫度為67℃，時(shí)間為2 h。PCR產(chǎn)物酶切完成后，經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)PCR-RFLP檢測結(jié)果，采用PO PGEN E軟件計(jì)算河北太行雞群體該基因位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率、觀測雜合度（H O）、期望雜合度（H e）、有效等位基因數(shù)（N e）及多態(tài)信息含量（PIC）；采用SPSS 19.0中的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行哈代-溫伯格（H ardy-W ei nberg）平衡性檢測。

圖1 基因組DNA凝膠檢測Fig.1 Electrophoresis products of Genome DNA

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DDNN AA提取 樣品基因組DN A提取均參照血液基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行?；蚪MDN A經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶單一、整齊、清晰，亮度較好，無降解現(xiàn)象，即基因組DN A的完整性好，見圖1。采用N ano Drop 2000超微量分光光度計(jì)對提取的基因組DN A進(jìn)行濃度和純度檢測，其比值（O D260/O D280）在1.8～2.0之間，可直接用于后續(xù)PCR、酶切等下游試驗(yàn)。

2.2 PPCC RR擴(kuò)增 取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含0.05%GV），電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR擴(kuò)增情況，如圖2所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期片段（369 bp）大小一致，為目的片段，且沒有特異性擴(kuò)增條帶，可直接用于PCR-RFLP分析。

圖2 FMO3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Products of FMO3 gene by PCR

2.3 PCR--RRFFLLPP分析 PCR產(chǎn)物酶切完成后，經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，F(xiàn)M O 3基因PCR產(chǎn)物酶切后的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖3所示，參考電泳圖譜，可以根據(jù)帶型對太行雞個(gè)體進(jìn)行基因型分型，若為226 bp、143 bp兩條帶，即判定為AA型；若為369 bp、226 bp、143 bp三條帶，即判定為AT型；若為369 bp一條帶，即判定為TT型。

圖3 FMO3基因突變位點(diǎn)的PCR-RFLP檢測結(jié)果Fig.3 Identification of polymorphism site by PCR-RFLP

2.4 基因型頻率及等位基因頻率 對采集的517只太行雞血液和肝臟樣品DN A進(jìn)行FM O 3基因T329S突變位點(diǎn)基因型頻率與基因頻率分析，結(jié)果如表1所示。

從表1可知，在河北太行雞群體中，AA基因型和AT基因型頻率顯著高于TT基因型，A等位基因頻率顯著高于T等位基因頻率。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卡方值為2.052（P＞0.05），說明所檢測河北太行雞群體在此位點(diǎn)處于H ardy-W ei nberg平衡狀態(tài)，見表2。

2.5 遺傳變異參數(shù) 雜合度、多態(tài)信息含量是度量群體遺傳變異的參數(shù)。該群體的觀測雜合度（H O）為0.1644，期望雜合度（H e）為0.1763、有效等位基因數(shù)（N e）為1.2140，多態(tài)信息含量（PIC）為0.1607，由此可知，該群體在該基因位點(diǎn)上均處于低度多態(tài)（PIC＜0.25），因而將攜帶魚腥味綜合征易感基因純合型（TT）和雜合型（AT）個(gè)體從群體中剔除相對較容易。

3 討論

表1 河北太行雞FMO3基因頻率及基因型頻率Table1 Frequencies of genotype and allele of FMO3 gene in Taihang chickens of Hebei

表2 FMO3基因T329S位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table2 Hardy-Weinberg equilibrium test for T329S site of FMO3 gene

我國地方禽類品種資源豐富，地方品種在肉蛋品質(zhì)及風(fēng)味上優(yōu)于高產(chǎn)商業(yè)品種。本研究中太行雞主產(chǎn)于河北境內(nèi)，經(jīng)人工選擇形成的河北省優(yōu)良地方品種，其蛋肉品質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)成分含量豐富，深受消費(fèi)者歡迎。但新鮮雞蛋中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一種類似臭魚的難聞味道，即所謂的“魚腥味綜合征”，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的感官感受。研究證實(shí)，F(xiàn)M O 3是體內(nèi)三甲胺（TM A）代謝的唯一有效酶[7]，F(xiàn)M O 3基因T329S突變位點(diǎn)引起FM O 3活性降低是導(dǎo)致產(chǎn)生腥味蛋的遺傳因素。

關(guān)于FM O 3基因T329S突變位點(diǎn)在不同品種雞群體中已有不少研究報(bào)道，因遺傳背景及選育程度不同，T329S突變位點(diǎn)在各個(gè)雞品種中的分布也不盡相同。張龍超[4]采用PCR-RFLP方法分析了我國地方雞種包括白萊航蛋雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和H褐殼蛋雞雞種FM O 3基因T329S突變位點(diǎn)的分布，該結(jié)果表明部分地方雞種有攜帶魚腥味的個(gè)體；劉偉等[8]研究的安徽地方雞種中魚腥味敏感基因型頻率均在0.05以下；邱家維等[6]、陳強(qiáng)等[9]、Chu等[10]報(bào)道的林甸雞、綠殼蛋雞、北京油雞群體中均存在魚腥味綜合征易感基因型個(gè)體，不利等位基因T的基因頻率分別為0.005～0.25，王曉亮等[11]對10個(gè)地方雞種的研究發(fā)現(xiàn)均存在魚腥味綜合征易感個(gè)體，但易感基因型頻率都不高，可以采用PCR-RFLP方法剔除。本試驗(yàn)中，所研究的太行雞群體中TT基因型頻率為0.0155，T等位基因的頻率為0.0976，由此可見，河北太行雞群體中魚腥味綜合征易感基因型頻率較小。因此，對河北省優(yōu)質(zhì)太行雞種FM O 3基因T329S突變位點(diǎn)進(jìn)行篩查，對攜帶該基因的雜合子及純合子予以剔除，從而從遺傳上保證太行雞群體中不再出現(xiàn)產(chǎn)魚腥味雞蛋的個(gè)體，最終建立無魚腥味基因的地方品種具有重要的意義。

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Genotype Frequencies of Flavin-Containing Monooxygenase 3 in Taihang Chickens of Hebei

Hu Hui yan1,Jia Qing1,2*,Sun Fengli3,Zhao Sisi1,Xi Jianzhong1,Li Xiaomin1
(1.College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Hebei Baoding 071000;2.National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Hebei Baoding 071000;3.Husbandry and Veterinary Research Institute of Hebei, Hebei Baoding 071000)

The objective of the study was to detect the distribution of Flavin-Containing Monooxygenase3(FMO3) T329S mutation in Taihang Chickens of Hebei. In the experiment, primers were designedaccording to FMO3 gene sequences in GenBank database. PCR-RFLP technique was used for detectingthe T329S polymorphism site of FMO3 gene in 517 Taihang Chickens. The result of c2testshowed that the polymorphic site of FMO3 gene was fit with Hardy-Weinberg equilibrium in TaihangChickens of Hebei (P>0.05), The allele frequencies of A, T were 0.9023, 0.0976; the frequenciesof AA, AT and TT genotype were 0.8201, 0.1644 and 0.0155, respectively. The research result hasshowed that the frequency of fishy taint genotype was generally low and the susceptible individualscould be easily detected by PCR-RFLP method in the Taihang Chicken of Hebei.

Taihang Chickens; Flavin-Containing Monooxygenase 3 gene; Genotype Frequencies; PCRRFLP

S831.2

B

1672-9692(2016)03-0008-05

2016-01-19

胡慧艷（1989-），女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。

賈青（1964-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（14236602D）。