王忠夏 張廣 曹胤 江春平

·論著·

芬戈莫德通過鞘氨醇-1-磷酸信號通路抑制肝癌細胞遷移的實驗研究

王忠夏 張廣 曹胤 江春平

目的 探討鞘氨醇-1-磷酸（S1P）信號通路及其抑制劑芬戈莫德（FTY720）在體外實驗中對不同侵襲潛能人肝細胞癌（HCC）細胞遷移能力的作用。方法 通過Real-time PCR和免疫印跡的方法比較低侵襲潛能HCC細胞MHCC-97L和高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H中S1P信號通路關鍵分子及下游促遷移信號通路的表達與活性水平。使用外源性S1P刺激MHCC-97L細胞，并使用siRNA干擾MHCC-97H細胞中S1P受體1（S1PR1）的表達，通過劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測HCC細胞遷移能力的變化。最后使用FTY720處理MHCC-97H細胞，觀察S1P及其下游信號通路表達及活性的變化，并研究FTY720對MHCC-97H細胞遷移能力的影響。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。結果高侵襲潛能MHCC-97H細胞中，S1PR1、鞘氨醇激酶1（SphK1）及鞘氨醇激酶2（SphK2）的相對表達量分別為5.94±0.78、1.64±0.30及1.48±0.28，高于低侵襲潛能MHCC-97L細胞的1.00±0.06、1.00±0.06及1.00±0.09，差異具有統(tǒng)計學意義（t = -10.96，-3.575，-2.841；P均< 0.05）。MHCC-97H細胞中S1PR1、SphK1及SphK2的蛋白表達水平及活性以及S1PR1下游與細胞遷移能力密切相關的Src、粘著斑激酶（FAK）和Janus激酶2（JAK2）/信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）信號通路活性明顯高于MHCC-97L細胞。外源性S1P可促進MHCC-97L細胞的劃痕愈合能力。MHCC-97L的Transwell細胞遷移實驗顯示：S1P刺激組遷移過膜細胞數(shù)為（178.33±10.01）個/視野，顯著多于空白對照組的（88.00±8.54）個/視野，差異具有統(tǒng)計學意義（F = 116.60，P < 0.01）。相反的，使用siRNA干擾MHCC-97H細胞中S1PR1表達后，細胞的劃痕愈合能力受到明顯抑制，Transwell實驗顯示：陰性對照組遷移過膜細胞數(shù)為（209.33± 4.51）個/視野，而S1PR1特異性siRNA轉染組遷移過膜細胞數(shù)為（98.67±9.02）個/視野，顯著少于陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（t =19.01，P < 0.01）。FTY720作為S1P通路抑制劑，同樣抑制了MHCC-97H細胞的劃痕愈合能力，Transwell實驗同樣顯示：FTY720處理組遷移過膜細胞數(shù)為（58.67±6.03）個/視野，顯著少于對照組的（203.33±10.41）個/視野，差異具有統(tǒng)計學意義（t = 20.833，P < 0.01）。FTY720的作用機制可能在于通過下調SphK1和S1PR1，抑制下游促遷移信號通路的活性，并進一步抑制HCC細胞的遷移。結論 S1P信號通路參與了HCC細胞的遷移，而FTY720作為一種具有抗HCC活性的免疫抑制劑，可能通過下調S1P及其下游信號轉導，抑制HCC細胞的遷移能力。

癌，肝細胞； 鞘氨醇； 芬戈莫德； 細胞運動

肝癌是全球范圍內位列腫瘤相關性死因第二位的惡性腫瘤，據(jù)世界癌癥統(tǒng)計顯示，全球約50﹪的肝癌發(fā)生在我國，居世界首位。目前肝癌是我國發(fā)病率排名第四、死亡率排名第三的惡性腫瘤，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌總數(shù)的70﹪~ 90﹪[1-2]。肝移植可同時切除HCC病灶并替換病變肝臟，因此成為了HCC治療最有效的手段之一[3]。腫瘤的復發(fā)和轉移是影響HCC肝移植術后患者預后的主要因素之一，即使在嚴格選擇的患者中，移植術后復發(fā)轉移率仍可達15﹪~20﹪[4]。在影響復發(fā)轉移的諸多因素中，免疫抑制劑的使用起到了重要的作用?？鼓[瘤免疫抑制劑雷帕霉素的使用已被證實有助于降低移植后HCC復發(fā)轉移的風險[5]。因此，繼續(xù)尋找和評價具有抗HCC作用的免疫抑制劑可能有助于進一步改善HCC肝移植的療效。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）作為內源性脂質代謝產(chǎn)物，參與了免疫調節(jié)、腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移等多種重要的生物學過程[6]。在腫瘤細胞中，S1P的生成催化酶鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）及鞘氨醇激酶2（sphingosine kinase 2，SphK2）常呈磷酸化的活化狀態(tài)，較正常細胞產(chǎn)生更多的S1P。S1P與其最重要的受體之一：S1P受體1（S1P receptor 1，S1PR1）結合后，可進一步活化下游信號轉導級聯(lián)反應，使Src、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）及信號轉導子和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化并激活，通過促進肌動蛋白重構、偽足形成、增加基質金屬蛋白酶分泌等方式促進腫瘤細胞的遷移能力，參與腫瘤的侵襲轉移等惡性生物學行為[6-9]。芬戈莫德（fi ngolimod，F(xiàn)TY720）是一種作用機制獨特的新型免疫抑制劑，

它并不直接抑制淋巴細胞的激活和增生，而是通過調控S1P信號通路，使外周淋巴細胞歸巢進入淋巴組織，并抑制激活的淋巴細胞活性，從而起到免疫抑制作用。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720具有較強的抗腫瘤作用[10]。因此，F(xiàn)TY720作為一種潛在的抗腫瘤免疫抑制劑，可能對于降低HCC肝移植術后復發(fā)轉移風險具有積極的意義。由于細胞遷移是腫瘤復發(fā)轉移中的重要生物學過程，本研究使用不同侵襲潛能的HCC細胞系，探討了S1P信號通路及FTY720的干預對于HCC細胞遷移能力的影響。

材料與方法

一、主要材料與試劑

1.細胞系：低侵襲潛能人HCC細胞系MHCC-97L、高侵襲潛能人HCC細胞系MHCC-97H由復旦大學肝癌研究所惠贈，以含10﹪胎牛血清及100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.實驗試劑：FTY720購自美國Selleck公司；S1P購自美國Cayman公司。Trizol RNA提取試劑購自美國Life Technologies公司；RNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green Real-timePCR試劑盒購自日本TOYOBO公司；Real-timePCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。小干擾RNA（siRNA）由上海吉瑪基因技術有限公司合成，Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑購于美國Life Technologies公司。S1P受體1（S1P receptor 1，S1PR1）一抗購自美國Santa Cruz公司；SphK1、磷酸化SphK1（p-SphK1）、SphK2、磷酸化SphK2（p-SphK2）一抗購自美國ECM Biosciences公司；Src及磷酸化Src（p-Src）、FAK及磷酸化FAK（p-FAK）、JAK2及磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3及磷酸化STAT3（p-STAT3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記二抗均購自美國Cell Signaling公司；RIPA細胞裂解液購自南通碧云天生物技術公司。Transwell細胞培養(yǎng)小室購自美國Corning公司。

二、實驗方法

1.Real-time PCR檢測人HCC細胞系S1P信號通路關鍵分子的表達水平：分別培養(yǎng)低侵襲潛能及高侵襲潛能人HCC細胞系MHCC-97L、MHCC-97H，收集細胞后使用Trizol試劑提取細胞總RNA，并通過逆轉錄反應制備細胞cDNA，通過SYBR Green法使用Life Technologies公司Viia-7 Realtime PCR儀檢測兩種人HCC細胞系中S1P信號通路關鍵分子的表達水平，以上操作均按照相應試劑盒說明書進行。

2.免疫印跡法檢測HCC細胞內S1P信號通路關鍵分子的表達及活化情況：取各組處理后細胞加入RIPA裂解液，于4℃下孵育20 min，隨后于4℃下12 000 × g離心20 min，取上清液，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后95℃變性5 min。制備十二烷基磺酸鈉-丙烯酰胺凝膠，每孔上樣總蛋白20 μg進行電泳分離，隨后使用半干式轉印槽將凝膠中蛋白轉印至聚偏二氟乙烯（poly vinylidene fl uoride，PVDF）膜上，以5﹪脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗，4℃下緩慢搖動過夜，TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h后，TBS-T洗膜3次，每次10 min。使用化學發(fā)光法在天能5200化學發(fā)光系統(tǒng)中顯影。

3.siRNA轉染：針對S1PR1 mRNA序列設計siRNA，siRNA序列為：5'-CUGCUCAAGACCGUA AUUATT-3'。以不針對任何已知基因的亂序siRNA作為陰性對照。在超凈工作臺中按Lipofectamine RNAiMAX試劑盒說明書進行操作。在一離心管中加入適當體積的Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，再加入適量S1PR1 siRNA或陰性對照siRNA后混勻。取另一離心管，加入與上一步相同體積的Opti-MEM，按說明書所示劑量加入Lipofectamine RNAiMAX脂質體轉染試劑并混勻。將兩離心管中液體混合并混勻，靜置5 min后加入細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行進一步實驗。

4.外源性S1P刺激HCC細胞：S1P以含0.5﹪去脂肪酸牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的無菌PBS溶解為母液備用，進行外源性S1P刺激實驗時加入上述S1P溶液至培養(yǎng)基，使其終濃度為200 nmol/L，并使用不含S1P的BSA溶液作為陰性對照。

5.細胞劃痕愈合實驗檢測HCC細胞遷移能力：將HCC細胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細胞完全貼壁并生長至100﹪融合。在生物安全柜中以無菌移液器吸頭在細胞上劃痕，保持各組劃痕寬度一致，吸去培養(yǎng)基，以無菌PBS洗3次，去除脫落的細胞后加入無血清培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下拍照留存。按實驗所需方法處理細胞，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，

觀察劃痕相同位置愈合情況，并拍照留存。

6.Transwell實驗檢測HCC細胞遷移能力：取8 μm孔徑的Transwell小室放置在24孔板中，以人纖維粘連蛋白（Fibronectin）包被小室下側面。消化細胞并計數(shù)，以無血清培養(yǎng)基重懸5×103個細胞接種于Transwell小室上室，下室加入含10﹪胎牛血清的完全培養(yǎng)基。進行實驗所需處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用棉簽擦凈Transwell小室上室內細胞，甲醇固定小室下側面細胞，以0.2﹪結晶紫染色后，顯微鏡下計數(shù)遷移后細胞，并拍照留存。

三、統(tǒng)計學分析方法

使用PASW Statistics 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，S1PR1、SPHK1、SPHK2相對表達量及Transwell實驗遷移過膜細胞數(shù)以± s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），并采用Dunnett法與空白對照組進行兩兩比較，P < 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同侵襲潛能人HCC細胞S1P信號通路分子表達與活性水平的比較

Real-time PCR結果顯示，低侵襲潛能MHCC-97L細胞中，S1P信號通路的重要受體S1PR1相對表達量為1.00±0.06，而在高侵襲潛能的MHCC-97H細胞中，S1PR1相對表達量為5.94±0.78，差異具有統(tǒng)計學意義（t = -10.96，P < 0.01）。同樣的，在MHCC-97L細胞中，催化S1P生成的關鍵酶SPHK1和SPHK2相對表達量為1.00±0.06和1.00±0.09，而在MHCC-97H中，SPHK1和SPHK2的相對表達量分別為1.64±0.30和1.48±0.28，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（t = -3.575，-2.841；P = 0.023，0.047）。因此，相比于低侵襲潛能HCC細胞MHCC-97L，高侵襲潛能HCC細胞中，S1PR1、SPHK1、SPHK2均呈高表達狀態(tài)（圖1）。

圖1 Real-time PCR法檢測低侵襲潛能HCC細胞MHCC-97L及高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H中S1P信號通路關鍵分子的表達

同樣，免疫印跡實驗顯示，高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H中S1PR1、SphK1及SphK2的蛋白表達水平顯著高于低侵襲潛能MHCC-97L細胞。并且SphK1和SphK2在MHCC-97H細胞中呈磷酸化形式，提示酶的活性處于活化狀態(tài)（圖2）。進一步的，MHCC-97H細胞中，受S1PR1調控且與細胞遷移能力密切相關的Src、FAK和JAK2/STAT3信號通路蛋白磷酸化水平明顯高于MHCC-97L細胞，提示在高侵襲潛能HCC細胞中上述通路處于激活狀態(tài)（圖3）。

二、調控S1P信號通路可影響HCC細胞的遷移能力

使用外源性S1P刺激低侵襲潛能MHCC-97L細胞后，使用劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力顯示：相比于空白對照及陰性對照組，200 nmol/L濃度的S1P顯著促進了HCC細胞的劃痕愈合能力（圖4）。同樣的，使用Transwell法檢測細胞遷移能力顯示：200 nmol/L濃度的外源性S1P明顯促進了HCC細胞的遷移能力（圖5），對遷移過膜細胞數(shù)量進行統(tǒng)計顯示（圖6），空白對照組、陰性對照組及S1P刺激組間遷移過膜細胞數(shù)存在顯著差異（F = 116.60，P <

0.01）。陰性對照組和S1P刺激組分別與空白對照組進行兩兩比較顯示：空白對照組遷移過膜細胞數(shù)為（88.00±8.54）個/視野，陰性對照組遷移過膜細胞數(shù)為（90.33±5.51）個/視野，兩組間沒有顯著

差異（P = 0.92）；而S1P刺激組遷移過膜細胞數(shù)為（178.33±10.01）個/視野，與空白對照組相比存在顯著差異（P < 0.01）。

圖2 免疫印跡法檢測低侵襲潛能HCC細胞MHCC-97L及高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H中S1P信號通路關鍵分子在蛋白水平的差異

圖3 免疫印跡法檢測低侵襲潛能HCC細胞MHCC-97L及高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H中受 S1PR1 調控的下游信號通路激活水平

圖4 倒置顯微鏡觀察S1P促進低侵襲潛能HCC細胞MHCC-97L的劃痕愈合能力 （×40）

圖5 倒置顯微鏡觀察S1P促進低侵襲潛能HCC細胞MHCC-97L的遷移能力 （結晶紫染色×200）

圖6 S1P刺激MHCC-97L細胞后Transwell遷移過膜細胞數(shù)

圖7 免疫印跡法檢測siRNA 轉染高侵襲潛能 MHCC-97H細胞后 S1PR1 的表達

相反的，使用siRNA的方法轉染MHCC-97H細胞后，免疫印跡的結果提示S1PR1特異性siRNA顯著抑制了S1PR1的表達，而與空白對照相比，陰性對照siRNA對S1PR1的表達無明顯影響（圖7）。

使用S1PR1特異性siRNA干擾高侵襲潛能MHCC-97H細胞后，使用劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力顯示：相比于亂序siRNA轉染陰性對照組，S1PR1特異性siRNA顯著抑制了HCC細胞的劃痕愈合能力（圖8）。而使用Transwell法檢測細胞遷移能力顯示：S1PR1干擾明顯降低了HCC細胞的遷移能力（圖9），對遷移過膜細胞數(shù)量進行統(tǒng)計顯示（圖10），陰性對照組遷移過膜細胞數(shù)為（209.33± 4.51）個/視野，而S1PR1特異性siRNA轉染組遷移過膜細胞數(shù)為（98.67±9.02）個/視野，顯著少于陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（t = 19.01，P < 0.01）。

三、FTY720通過抑制S1P信號通路抑制HCC細胞遷移能力

使用S1P信號通路抑制劑FTY720處理高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H，劃痕愈合實驗的結果顯示：5 μmol/L濃度的FTY720顯著抑制了高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H的劃痕愈合能力（圖11）。而使用Transwell法檢測細胞遷移能力也顯示：FTY720處理明顯降低了HCC細胞的遷移能力（圖12），對遷移過膜細胞數(shù)量進行統(tǒng)計顯示（圖13），對照組遷移過膜細胞數(shù)為（203.33± 10.41）個/視野，而FTY720處理組遷移過膜細胞數(shù)為（58.67±6.03）個/視野，顯著少于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（t = 20.833，P < 0.01）。

使用0、1，2.5，5，7.5，10 μmol/L濃度的FTY720處理MHCC-97H細胞24 h后，通過免疫印跡方法檢測S1P信號通路關鍵分子的表達量及活化情況。結果顯示，F(xiàn)TY720可劑量依賴性的下調SphK1及S1PR1，并進一步對于S1PR1調控的促遷移信號通路Src、FAK及JAK2/STAT3的磷酸化具有抑制

作用，這可能是其抑制HCC細胞遷移的潛在機制（圖14）。

圖8 倒置顯微鏡觀察干擾S1PR1抑制高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H的劃痕愈合能力 （×40）

圖9 倒置顯微鏡觀察干擾S1PR1抑制高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H的遷移能力 （結晶紫染色×200）

圖10 S1PR1特異性siRNA轉染MHCC-97H細胞后Transwell實驗遷移過膜細胞數(shù)

討 論

免疫抑制劑的使用是肝移植術后必要的治療手段，但也與移植術后HCC的復發(fā)密切相關[11]。雷帕霉素是目前臨床唯一可用的抗腫瘤免疫抑制

劑，對于預防肝移植術后HCC復發(fā)具有有益的作用[12]。因此，尋找和評價兼具抗腫瘤作用的免疫抑制劑對于改善HCC肝移植的預后具有積極的意義。芬戈莫德（FTY720）是一種作用機制獨特的免疫抑制劑，通過抑制S1P信號通路，促進循環(huán)淋巴細胞歸巢淋巴組織并抑制激活的淋巴細胞活性，發(fā)揮免疫抑制作用[13]。S1P信號通路不僅參與機體免疫調節(jié)，也調控了惡性腫瘤的諸多重要生物學行為。細胞內SphK1和SphK2催化產(chǎn)生S1P，而S1P進一

步與其受體結合，啟動下游信號轉導。作為S1P受體之一，S1PR1通過激活下游的Src[8-9]、FAK[7,14]和JAK2/STAT3[14-15]等信號通路，促進細胞遷移，從而參與惡性腫瘤的復發(fā)和轉移過程。

圖11 倒置顯微鏡觀察FTY720抑制高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H的劃痕愈合能力 （×40）

圖12 倒置顯微鏡觀察FTY720抑制高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H的遷移能力 （結晶紫染色×200）

圖13 FTY720處理MHCC-97H細胞后Transwell實驗遷移過膜細胞數(shù)

圖14 FTY720 抑制高侵襲潛能HCC細胞MHCC-97H促遷移信號通路的活性

本研究的結果顯示，相比于低侵襲潛能的同源細胞系MHCC-97L，高侵襲潛能的MHCC-97H細胞中，SphK1/2和S1PR1在mRNA和蛋白水平呈顯著高表達狀態(tài)，且作為催化S1P形成的關鍵酶，SphK1/2處于活化狀態(tài)。更為重要的是，受S1PR1調控且與促進腫瘤遷移密切相關的Src、FAK和JAK2/STAT3信號通路在高侵襲潛能HCC細胞中呈激活狀態(tài)，提示S1P及其下游信號通路可能與HCC細胞的遷移能力密切相關。本研究使用相同基因背景的不同侵襲能力HCC細胞，初步建立了S1P及其促遷移信號通路活化情況與HCC細胞遷移能力的相關性，上述結果還需在不同侵襲轉移狀態(tài)HCC臨床樣本中進一步研究加以驗證。

進一步的，使用S1P刺激低侵襲潛能的MHCC-97L細胞可顯著增強其遷移能力，而相應的在高侵襲潛能的MHCC-97H細胞中干擾S1PR1的表達抑制了高侵襲細胞的遷移能力。提示S1P通過S1PR1調控下游信號通路，促進HCC細胞的遷移，進而可能參與其臨床復發(fā)和轉移。FTY720作為S1P信號轉導的抑制劑，其抗腫瘤藥理作用可能包括通過下調SphK1和S1PR1的活性和表達水平，從而抑制S1P相關信號轉導，顯著抑制下游Src、FAK及JAK2/STAT3通路的活性，并進一步通過下調上述通路對于肌動蛋白重構、細胞偽足形成及基質金屬蛋白酶分泌等的調控[8-9,14-16]，對HCC細胞的遷移能力產(chǎn)生抑制。

本文的結果和已有的證據(jù)證明，F(xiàn)TY720可直接抑制SphK1在蛋白水平的表達，或通過下調其酶活性，使得S1P產(chǎn)生減少。另外，F(xiàn)TY720作為S1P類似物，還可以降低受體S1PR1的表達。因此，F(xiàn)TY720可從S1P生成酶和受體兩個水平同時抑制S1P信號轉導[13,16-18]。本研究還提示，高侵襲潛能HCC細胞中SphK1不僅表達量高于低侵襲潛能HCC細胞，且處于磷酸化的活化形式。由于FTY720可下調SphK1的蛋白表達總量，因而無論SphK1的磷酸化活性如何，F(xiàn)TY720均可通過抑制SphK1產(chǎn)生S1P的作用，下調S1P相關信號轉導，但FTY720是否通過影響SphK1的磷酸化影響其酶活性也是值得研究的話題。與SphK1不同，SphK2主要位于細胞核，目前對于其功能了解尚不清楚。SphK2可能通過產(chǎn)生S1P，在細胞核內參與調控組蛋白的乙?；M而影響基因表達[19]。FTY720對于SphK2是否存在直接的藥理作用也不完全明確，本研究結果提示SphK2的表達及活性同樣可能與HCC細胞的遷移能力相關，因此SphK2是否直接參與HCC細胞遷移及FTY720對SphK2的表達和酶活性是否存在調節(jié)作用同樣值得進一步探討。

綜上所述，本研究的結果表明，S1P及其下游信號通路參與了HCC細胞的遷移。而FTY720作為S1P信號抑制劑，對HCC細胞遷移具有顯著的抑制作用。FTY720兼具抗腫瘤和免疫抑制的活性[16]，因此可能對于改善HCC肝移植術后的臨床預后具有一定的意義，值得進一步通過動物實驗和臨床研究深入探討其臨床價值。

1 Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

2 Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

3 El-Serag HB. Hepatocellular carcinoma[J]. N Engl J Med, 2011, 365(12):1118-1127.

4 Gu XQ, Zheng WP, Teng DH, et al. Impact of non-oncological factors on tumor recurrence after liver transplantation in hepatocellular carcinoma patients[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(9):2749-2759.

5 Welker MW, Bechstein WO, Zeuzem S, et al. Recurrent hepatocellular carcinoma after liver transplantation - an emerging clinical challenge[J]. Transpl Int, 2013, 26(2):109-118.

6 Kunkel GT, Maceyka M, Milstien S, et al. Targeting the sphingosine-1-phosphate axis in cancer, infl ammation and beyond[J]. Nat Rev Drug Discov, 2013, 12(9):688-702.

7 Gao P, Smith CD. Ablation of sphingosine kinase-2 inhibits tumor cell proliferation and migration[J]. Mol Cancer Res, 2011, 9(11):1509-1519.

8 Guo YX, Ma YJ, Han L, et al. Role of sphingosine 1-phosphate in human pancreatic cancer cells proliferation and migration[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(11):20349-20354.

9 Huang YL, Lin HS, Chen SU, et al. Tyrosine sulphation of sphingosine 1-phosphate 1 (S1P1) is required for S1P-mediated cell migration in primary cultures of human umbilical vein endothelial cells[J]. J Biochem, 2009, 146(6):815-820.

10 White C, Alshaker H, Cooper C, et al. The emerging role of FTY720 (Fingolimod) in cancer treatment[J]. Oncotarget, 2016.

11 Cescon M, Bertuzzo VR, Ercolani G, et al. Liver transplantation for hepatocellular carcinoma: role of infl ammatory and immunological state on recurrence and prognosis[J]. World Journal of Gastroenterology, 2013, 19(48):9174-9182.

12 Duvoux C, Toso C. mTOR inhibitor therapy: does it prevent HCC recurrence after liver transplantation?[J]. Transplant Rev (Orlando), 2015, 29(3):168-174.

13 Patmanathan SN, Yap LF, Murray PG, et al. The antineoplastic properties of FTY720: evidence for the repurposing of fi ngolimod[J]. J Cell Mol Med, 2015, 19(10):2329-2340.

14 Quint P, Ruan M, Pederson L, et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) receptors 1 and 2 coordinately induce mesenchymal cell migration through S1P activation of complementary kinase pathways[J]. J Biol Chem, 2013, 288(8):5398-5406.

15 Sekine Y, Suzuki K, Remaley AT. HDL and sphingosine-1-phosphate activate stat3 in prostate cancer DU145 cells via ERK1/2 and S1P receptors, and promote cell migration and invasion[J]. Prostate, 2011, 71(7):690-699.

16 Zhang L, Wang HD, Ji XJ, et al. FTY720 for cancer therapy (Review)[J]. Oncol Rep, 2013, 30(6):2571-2578.

17 Pchejetski D, Bohler T, Brizuela L, et al. FTY720 (fingolimod) sensitizes prostate cancer cells to radiotherapy by inhibition of sphingosine kinase-1[J]. Cancer Res, 2010, 70(21):8651-8661.

18 Tonelli F, Lim KG, Loveridge C, et al. FTY720 and (S)-FTY720 vinylphosphonate inhibit sphingosine kinase 1 and promote its proteasomal degradation in human pulmonary artery smooth muscle, breast cancer and androgen-independent prostate cancer cells[J]. Cell Signal, 2010, 22(10):1536-1542.

19 Hait NC, Allegood J, Maceyka M, et al. Regulation of histone acetylation in the nucleus by sphingosine-1-phosphate[J]. Science, 2009, 325(5945):1254-1257.

Immunosuppressant fingolimod inhibits the migration of hepatocellular carcinoma cells throughsphingosine-1-phosphate signaling pathway

Wang Zhongxia, Zhang Guang, Cao Yin, JiangChunping. Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China

Objective To investigate the effects of fingolimod (FTY720), an inhibitor

Carcinoma，hepatocellular； Sphingosine； Fingolimod； Cell movement

2016-05-23）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.002

國家自然基金項目（81572393，81602093）；南京市醫(yī)學科技發(fā)展重點項目（ZKX15020）；江蘇省自然科學基金青年基金項目（BK20160118）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（021414380215、021414380242、021414380258）

210008 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院肝膽外科

江春平，Email: chunpingjiang@163.com

of sphingosine-1-phosphate (S1P) signaling pathway, on the migration of hepatocellular carcinoma (HCC) cells with different invasive ability in vitro. Method The expression of S1P signaling pathway molecules was compared using Real-time PCR and immunoblotting in highly invasive HCC cell line MHCC-97H and less invasive HCC cell line MHCC-97L. Exogenous S1P was used to stimulate MHCC-97L cells and siRNA transfection was used to interfere the expression of S1P receptor 1 (S1PR1) in MHCC-97H cells. The ability of migration was observed using wound healing assay and transwell assay. Finally, MHCC-97H cells were treated with FTY720. After treatment, the expression of S1P signaling pathway molecules were determined by immunoblotting. Data among multiple groups were compared by one-way ANOVA and data between two independent groups were compared by t-test. Result Relative expression of S1PR1, sphingosine kinase 1 (SphK1) and sphingosine kinase 2 (SphK2) were significantly higher in MHCC-97H HCC cells as compared with MHCC-97L cells (5.94±0.78 versus 1.00±0.06, 1.64±0.30 versus 1.00±0.06 and 1.48 ±0.28 versus 1.00±0.09, t = -10.96, -3.575, -2.841；P < 0.05). The protein levels of S1PR1, SphK1, SphK2 in MHCC-97H cells were also higher than those in MHCC-97L cells. Accordingly, the expression of S1PR1 downstream molecules Src, focal adhesion kinase (FAK) and Janus kinase 2(JAK2)/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) were also upregulated in MHCC-97H cells. Exogenous S1P promoted wound healing of MHCC-97L cells. As indicated by Transwell assay, migrated cell number in the S1P group was 178.33±10.01 per field, which was significantly more than that in the control group (88.00±8.54 per field, F = 116.60，P < 0.01). In contrast, interfering the expression of S1PR1 in MHCC-97H cells by siRNA inhibited wound healing and, as indicated by Transwell assay, migrated cells in S1PR1 siRNA group was 98.67±9.02 per field, which was significantly less than that in the negative control group (209.33±4.51 per field, t =19.01, P < 0.01). As an inhibitor of S1P pathway, FTY720 also inhibited wound healing ability of MHCC-97H cells. Similarly, in Transwell assay, migrated cell number in FTY720 group was significantly smaller than that in the control group (58.67±6.03 per field versus 203.33±10.41 per field, t = 20.833，P < 0.01). FTY720 inhibited S1P-mediated signaling transduction by down-regulating SphK1 and S1PR1, which inhibited the migration of HCC cells. Conclusion S1P signaling pathway participates in the migration of HCC cells. As an immunosuppressant with anti-HCC activity, FTY720 inhibits the migration of HCC cells through S1P signal pathway.

王忠夏,張廣,曹胤,等. 芬戈莫德通過鞘氨醇-1-磷酸信號通路抑制肝癌細胞遷移的實驗研究[J/CD].中華細胞與干細胞雜志:電子版, 2016, 6(5):270-279.