韓笑笑，趙建，王震宇，隋海君，徐立娜,*

1. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室，青島 266071

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不同老化時間的TiO2納米顆粒對玉米生長的影響

韓笑笑1,2，趙建1,2，王震宇1,2，隋海君1,2，徐立娜1,2,*

1. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室，青島 266071

為探討老化時間對TiO2納米顆粒(nanoparticles, NPs)生物有效性的影響，研究了不同老化時間的TiO2NPs(0～120 d)對玉米幼苗生長的影響、在玉米體內(nèi)的吸收及其在植株不同部位的存在位點等。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的TiO2NPs(1 000 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1)加入到土壤中，對玉米幼苗干鮮重沒有明顯的影響，但老化時間小于60 d時，對玉米幼苗株高有一定的抑制效應(yīng)，老化60 d之后，隨著老化時間的繼續(xù)延長，毒性逐漸降低，最后趨于穩(wěn)定。老化60 d時，TiO2NPs處理的玉米幼苗根冠增大，玉米幼苗體內(nèi)產(chǎn)生H2O2的累積。在TiO2老化土壤中生長的玉米幼苗根系和地上部均有Ti的累積，1 000 mg·kg-1的TiO2NPs在玉米幼苗根部的生物累積系數(shù)達(dá)到35.4%，在地上部為13.6%，在玉米植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運系數(shù)為0.38；通過TEM觀察，TiO2NPs可以進(jìn)入到玉米幼苗體內(nèi)，并存在于根細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和葉綠體膜上，在葉片細(xì)胞的液泡和細(xì)胞核中也發(fā)現(xiàn)有TiO2NPs的存在。上述研究結(jié)果為客觀評價TiO2NPs的生態(tài)風(fēng)險提供了有用信息。

TiO2NPs；玉米幼苗；生長效應(yīng)；吸收轉(zhuǎn)運

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料已廣泛地應(yīng)用于電子、生物醫(yī)藥、催化和材料等各個領(lǐng)域[1]。在這些納米產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用過程中，所產(chǎn)生的納米顆粒(nanoparticles, NPs)能夠通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境中，其潛在的環(huán)境風(fēng)險和對人類健康的負(fù)面影響引起了廣泛的關(guān)注，相關(guān)研究已成為國際上的熱點[2]。

目前已有大量研究表明，NPs對無脊椎動物[3]、細(xì)菌[4]、藻類[5]和魚類[6]等均能產(chǎn)生毒性效應(yīng)。植物是生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，在生態(tài)系統(tǒng)中有著重要的作用。金盛楊等[7]及Zhao等[8]的研究結(jié)果均表明金屬氧化物NPs能夠抑制高等植物的生長。NPs有可能進(jìn)入植物體中并進(jìn)行遷移轉(zhuǎn)運，最終通過食物鏈的蓄積和放大作用，對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生危害。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CuO NPs能夠進(jìn)入玉米植株根系中，并隨著木質(zhì)部從地下部向地上部運輸。然而，關(guān)于NPs對植物的毒性研究多是在水環(huán)境條件下進(jìn)行的。NPs也會通過多種途徑進(jìn)入到土壤環(huán)境中，由于土壤環(huán)境的復(fù)雜性，NPs進(jìn)入土壤后會在其中產(chǎn)生一系列的復(fù)雜反應(yīng)，其中老化時間的長短與NPs的生物有效性的高低密切相關(guān)[10]。

二氧化鈦納米顆粒(TiO2NPs)作為一種重要的金屬氧化物NPs，在日化用品、抗菌材料、涂料陶瓷污水處理等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。開展TiO2NPs對高等植物的毒性研究對認(rèn)識TiO2NPs的生態(tài)安全及食品安全具有重要意義。本實驗以玉米作為受試植物，研究了不同土壤老化時間下，TiO2NPs對玉米幼苗生長效應(yīng)的影響，探討了TiO2NPs在玉米幼苗體內(nèi)的吸收分布與遷移規(guī)律，并通過光學(xué)顯微鏡(LM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察了玉米幼苗根部的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化以及TiO2NPs在玉米幼苗體內(nèi)的存在位點，以期為TiO2NPs的安全評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS 7500，美國)，透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100，JEOL，日本)，光學(xué)顯微鏡(LM，Leica-DM 2500，德國)，微波消解儀(CEM-MARS 6，美國)。

試劑：活性氧檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；實驗用乙醇、濃硝酸、濃鹽酸、戊二醛均為化學(xué)純，購自中國國藥有限公司。

1.2 實驗材料

TiO2納米顆粒(nanoparticles, NPs)和TiO2大顆粒(bulk particles, BPs)購買于美國Sigma公司，TiO2NPs平均粒徑小于50 nm，BPs的平均粒徑為0.2～0.4 μm，純度均大于99.9%。

玉米種子購買于青島市種子站的渝單8號，挑選顆粒飽滿、大小均一的玉米種子用于實驗。

實驗所用土壤是城陽紅島的自然土壤，其基本理化性質(zhì)如表1所示。

1.3 實驗設(shè)計

稱取一定量TiO2NPs和TiO2BPs，分別將它們均勻地灑入過2 mm篩的土壤中，充分?jǐn)嚢?，使TiO2NPs的最終濃度分別是1 000 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1，TiO2BPs的最終濃度為2 000 mg·kg-1，隨后分裝于花盆(直徑13 cm，高約為14 cm)中進(jìn)行老化，待用。

土壤老化時間設(shè)置為0 d、30 d、60 d、90 d和120 d，在不同的老化時間下將玉米種子分別播種于1 000 mg·kg-1、2 000 mg·kg-1的TiO2NPs和2 000 mg·kg-1TiO2BPs處理的花盆中。玉米生長的光照與黑暗比為12 h:12 h，晝夜溫度為20～25 ℃和15～20 ℃，濕度保持在60%～70%，光照強(qiáng)度為16 500 lux。

表1 土壤理化性質(zhì)

1.4 實驗方法

1.4.1 納米材料的表征

分別稱取0.2 mg TiO2NPs和TiO2BPs，將其分別分散在20 mL乙醇溶液中，保持低溫水浴超聲震蕩30 min，用潔凈的鎳網(wǎng)蘸取少量分散好的TiO2NPs和TiO2BPs懸浮液，待自然風(fēng)干后，用透射電子顯微鏡觀察TiO2NPs和TiO2BPs的形態(tài)和粒徑。

1.4.2 玉米幼苗生長的測定

玉米種子在老化的土壤中發(fā)芽長出真葉后，待幼苗生長至第5天、第10天和第15天時，分別測定玉米幼苗株高。

玉米幼苗生長至15 d，取出完整的玉米幼苗，將根系洗凈，稱量幼苗根系和地上部的鮮重和干重。將玉米幼苗根部近根尖部分切割長度約為1 cm小段，用光學(xué)顯微鏡觀察根部形態(tài)的變化。

1.4.3 玉米幼苗中H2O2含量的測定

由不同老化時間下玉米幼苗株高、地上部和根部干鮮重的變化確定TiO2NPs對玉米幼苗毒性最大的濃度和老化時間，在此濃度和老化時間下，取玉米幼苗的新鮮葉片和干凈根系，勻漿、離心取上清液。按照H2O2的試劑盒說明操作，在405 nm處，用酶標(biāo)儀測定吸光度計算反應(yīng)產(chǎn)物。

1.4.4 玉米幼苗中Ti含量的測定及分布

在不同的老化時間、不同濃度的TiO2NPs和TiO2BPs處理下，玉米幼苗生長至15 d時，取出完整玉米幼苗植株，清洗干凈后烘干至恒重。稱取0.2 g的玉米幼苗地上部和根系分別置于消解管中，每個消解管中加入6 mL濃硝酸溶液和2 mL濃鹽酸溶液，用微波消解儀進(jìn)行消解，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定消解樣品中Ti的含量。

1.4.5 TEM觀察

玉米幼苗生長至15 d，在葉片近邊緣部分切割面積為5 mm×5 mm的小塊，根部近根尖部分切割長度約為0.5 mm的小塊，將切割的小塊放入磷酸緩沖液(PBS)中清洗3遍之后，在戊二醛溶液中固定過夜，PBS清洗3遍后，用鋨酸固定1 h，再經(jīng)清洗、逐步脫水后，用樹脂進(jìn)行包埋，切片后用TEM觀察。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)Lee等[11]的方法，NPs的生物可利用性可以用NPs在生物體內(nèi)的生物累積系數(shù)及轉(zhuǎn)運系數(shù)表示，計算方法如下：

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，用ANOVA(analysis of variance，LSD檢驗法)進(jìn)行顯著性差異分析(P < 0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TiO2NPs的表征

TiO2NPs和TiO2BPs懸浮液的表征結(jié)果如圖1所示。TiO2NPs在TEM觀察下的顆粒大小和形狀，由圖可見，TiO2NPs大部分接近圓形或橢圓形，粒徑在20～30 nm左右；在TEM觀察下TiO2BPs的顆粒大小和形狀，約在0.2～0.4 μm之間，呈大塊團(tuán)聚狀。

圖1 透射電鏡觀察TiO2 NPs和TiO2 BPsFig. 1 TEM observation of TiO2 NPs and TiO2 BPs

2.2 不同老化時間的TiO2NPs對玉米幼苗生長的影響

2.2.1 不同老化時間的TiO2NPs對玉米幼苗株高的影響

不同老化時間下，TiO2NPs對玉米幼苗株高的影響如圖2所示。相同濃度的TiO2NPs加入土壤中后，老化60 d內(nèi)的土壤對株高生長有明顯的抑制效應(yīng)，且TiO2NPs處理對玉米幼苗的株高的抑制效應(yīng)強(qiáng)于TiO2BPs對玉米幼苗株高的影響；土壤老化60 d后，對株高生長的抑制效應(yīng)逐漸減弱，在老化120 d的土壤中，玉米幼苗能夠正常生長。

2.2.2 不同老化時間的TiO2NPs對玉米幼苗干鮮重的影響

圖3是不同老化時間的TiO2NPs對玉米幼苗干鮮重的影響。由圖可以看出，玉米幼苗分別在TiO2NPs和TiO2BPs老化的土壤中生長15 d后，地上部和根系的干鮮重與對照相比沒有明顯的變化，且不同的老化時間對玉米幼苗生長也沒有明顯的抑制效應(yīng)。

2.2.3 玉米幼苗根冠形態(tài)的觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察的TiO2NPs和TiO2BPs老化60 d時對玉米幼苗根部形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響如圖4所

示。相比于對照處理的根冠，TiO2NPs(1 000 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1)處理的玉米幼苗的根冠增大，且1 000 mg·kg-1的TiO2NPs處理的根冠比2 000 mg·kg-1的TiO2NPs處理的根冠大，TiO2BPs處理的玉米幼苗根冠沒有明顯增大。

圖2 不同老化時間的TiO2 NPs對玉米幼苗(15 d)株高的影響Fig. 2 Height of maize seedlings (15 d) on different aging time of TiO2 NPs in soil

圖3 不同老化時間的TiO2 NPs對玉米幼苗干鮮重的影響Fig. 3 The fresh and dry weight of maize seedlings at different aging time of TiO2 NPs in soil

圖4 光鏡觀察TiO2 NPs、TiO2 BPs對玉米幼苗根部形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 LM observation of maize seedling roots with different treatments

圖5 老化60 d時玉米幼苗中H2O2含量Fig. 5 H2O2 content in maize seedling at aging 60 d

2.2.4 TiO2NPs對玉米幼苗體內(nèi)H2O2含量的影響

根據(jù)不同老化時間的TiO2NPs對玉米幼苗株高的影響可知，在老化60 d時，TiO2NPs可以抑制玉米幼苗的生長，因此選用60 d時的玉米幼苗測定其體內(nèi)的H2O2含量。圖5是老化時間60 d時，TiO2NPs處理的玉米幼苗葉片和根中的H2O2含量。1 000 mg·kg-1的TiO2NPs可以顯著增加玉米幼苗葉片和根中的H2O2含量，但對照和TiO2BPs產(chǎn)生的H2O2含量沒有顯著差異。

2.3 TiO2NPs在玉米幼苗體內(nèi)的吸收分布與遷移

不同老化時間下玉米幼苗中Ti含量的分布如圖6所示，未添加TiO2NPs的土壤處理，玉米幼苗地上部和根系中均未檢測到Ti含量的累積，而TiO2NPs和TiO2BPs處理的玉米幼苗地上部和根部中Ti的含量明顯增加，其中老化60 d時，Ti在玉米幼苗中的含量最多，1 000 mg·kg-1TiO2NPs處理的玉米幼苗地上部Ti的含量達(dá)到136.7 mg·kg-1，根系中Ti的含量達(dá)到353.9 mg·kg-1，且TiO2NPs處理的玉米幼苗比TiO2BPs處理的玉米幼苗中Ti的含量多。

通過計算TiO2NPs在玉米幼苗體內(nèi)的生物累積系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)可知，TiO2NPs在玉米幼苗根部的生物累積系數(shù)是35.4%，在玉米幼苗地上部的生物累積系數(shù)是13.6%，TiO2NPs在玉米幼苗體內(nèi)的轉(zhuǎn)運系數(shù)是0.38。

圖6 不同老化時間的玉米幼苗中Ti含量的分布Fig. 6 Ti content in maize seedlings at different aging time

圖7 透射電鏡觀察TiO2 NPs在玉米根細(xì)胞和葉細(xì)胞中的存在位點Fig. 7 The location of TiO2 NPs in leaf cells and root cells of maize observed by TEM

2.4 TEM觀察TiO2NPs在玉米幼苗體內(nèi)的分布位點

用透射電鏡觀察TiO2NPs在玉米幼苗的根和葉細(xì)胞中的存在位點(圖7)，圖7-A所示為一個對照處理的玉米幼苗葉細(xì)胞，在1 000 mg·kg-1TiO2NPs處理的玉米幼苗發(fā)現(xiàn)有黑色顆粒物存在于葉細(xì)胞的液泡中(圖7-C)和細(xì)胞核中(7-E)，圖7-B所示為一個對照處理的玉米幼苗根細(xì)胞，在1 000 mg·kg-1TiO2NPs處理的幼苗根細(xì)胞的細(xì)胞核(圖7-D)和葉綠體膜上(圖7-F)也發(fā)現(xiàn)了有黑色的顆粒，且葉片和根系細(xì)胞中的黑色顆粒物在形態(tài)和粒徑大小上也都符合TiO2NPs的顆粒特性。

3 討論(Discussion)

隨著納米材料的廣泛應(yīng)用，越來越多的NPs進(jìn)入土壤環(huán)境中，而土壤環(huán)境中NPs對農(nóng)作物產(chǎn)生的效應(yīng)直接涉及到人體健康[8]。本研究中，不同濃度的TiO2NPs加入到土壤中，雖然對玉米幼苗干鮮重沒有明顯的影響，但老化60 d時，對玉米幼苗株高有一定的抑制效應(yīng)，隨著老化時間的延長，毒性降低，最后趨于穩(wěn)定。這可能是由于TiO2NPs加入土壤中后，尚未與土壤各組分結(jié)合，TiO2NPs在土壤中的移動性高，因此被玉米幼苗的可利用性高，隨著時間的延長，TiO2NPs在土壤中與土壤組分結(jié)合加劇，它們在土壤中的移動性也隨之降低，生物可利用性降低，對玉米幼苗造成的傷害減少[12]。另外，根冠可以對植物的根部起保護(hù)作用，當(dāng)TiO2NPs作用于玉米幼苗的根部時根冠增大，以降低TiO2NPs對玉米幼苗的根部的毒害脅迫，增加植物的抗性[13]。研究中發(fā)現(xiàn)1 000 mg·kg-1的TiO2NPs的生物效應(yīng)大于2 000 mg·kg-1的TiO2NPs，這可能是由于2 000 mg·kg-1的TiO2NPs和TiO2BPs濃度過大，易于團(tuán)聚，在土壤中的移動性小于1 000 mg·kg-1的TiO2NPs，導(dǎo)致其生物可利用性低，從而毒性降低。

氧化脅迫是納米材料生物毒性研究中普遍認(rèn)可的機(jī)制，是造成植物生長受抑制的原因之一。王震宇等[14]研究表明，TiO2NPs能使玉米幼苗產(chǎn)生膜脂過氧化，從而抑制植物生長。H2O2是重要的活性氧之一，脅迫刺激可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和積累，繼而調(diào)控植物的生長發(fā)育、逆境應(yīng)答等諸多生理過程。然而，活性氧具有兩面性，濃度較低時，可以作為信號分子調(diào)節(jié)植物的生理活動，濃度增高時會成為毒副產(chǎn)物，對植物產(chǎn)生危害[15]。徐立娜等[16]研究發(fā)現(xiàn)CuO NPs暴露下，擬南芥幼苗生長受到抑制，根系和地上部均產(chǎn)生H2O2的積累。本研究圖5中，1 000 mg·kg-1的TiO2NPs老化60 d時玉米幼苗產(chǎn)生的H2O2的量與對照相比有明顯增加，說明TiO2NPs能夠引起玉米幼苗的氧化響應(yīng)，從而影響植物生長。

NPs在植物體內(nèi)的遷移轉(zhuǎn)運對食物鏈傳遞和食品安全存在潛在的危害。很多研究已經(jīng)表明，NPs能夠進(jìn)入到植物體內(nèi)，并發(fā)生遷移轉(zhuǎn)運。Du等[17]發(fā)現(xiàn)TiO2NPs能夠進(jìn)入到小麥的根細(xì)胞中，Lin等[18]用TEM在黑麥草根的內(nèi)皮層和維管束中觀察到ZnO NPs的存在。本研究在玉米根系和地上部中均檢測到了高濃度的Ti的積累，同時也觀察到TiO2晶體顆粒主要存在于玉米根細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和葉綠體膜/葉細(xì)胞的液泡和細(xì)胞核中。進(jìn)一步的研究需要通過X射線能譜分析(EDS)等手段進(jìn)一步探討TiO2NPs進(jìn)入細(xì)胞的方式及遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。。

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◆

Effect of TiO2Engineered Nanoparticles at Different Aging Times on the Growth ofZeamaysL. in Soil

Han Xiaoxiao1,2, Zhao Jian1,2, Wang Zhenyu1,2, Sui Haijun1, Xu Lina1,2,*

1. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China

Received 29 November 2015 accepted 25 February 2016

To investigate the effect of aging time on the biological effectiveness of TiO2nanoparticles (NPs) in soil, the growth of maize seedlings, and the uptake and location of TiO2NPs in maize seedlings in the TiO2NPs treatment (1 000 mg·kg-1and 2 000 mg·kg-1) with different aging times were studied. The results suggested that TiO2NPs at all the tested aging times (0～120 d) had no negative effects on the dry or fresh weight of maize seedlings in soil. For the height of maize seedling, significant decrease was observed when the aging time of TiO2NPs was less than 60 days. The inhibition on the height of maize seedling was decreased after aging over 60 d. After exposure to 60 d aged TiO2NPs in soil, the root cap of maize seedling was increased and H2O2was accumulated. Ti was detected in the roots and shoots of maize after TiO2NPs exposure, indicating that TiO2NPs could be taken up in maize seedlings, and then be transported from root to shoot. After exposure to 1 000 mg·kg-1TiO2for 60 d, the bioaccumulation coefficient in maize seedling root was 35.4% and 13.6% in shoot. The transfer coefficient in maize seedlings was 0.38. As observed by TEM, TiO2NPs could exist in chloroplast membrane and nucleus of root cells, and vacuoles and nucleus of leaf cells.

TiO2nanoparticles; maize seedlings; growth effect; transfer

10.7524/AJE.1673-5897.20151129002

國家自然科學(xué)基金(41073067；41120134004)

韓笑笑(1991-)，女，研究方向為污染物的環(huán)境地球化學(xué)，E-mail: x_smile901@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xln1984@126.com

2015-11-29 錄用日期：2016-02-25

1673-5897(2016)2-642-08

X171.5

A

簡介：徐立娜(1984—)，女，環(huán)境科學(xué)博士，博士后，主要研究方向為污染物的環(huán)境地球化學(xué)。

韓笑笑, 趙建, 王震宇, 等. 不同老化時間的TiO2納米顆粒對玉米生長的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(2): 642-649

Han X X, Zhao J, Wang Z Y, et al. Effect of TiO2engineered nanoparticles at different aging times on the growth of Zea mays L. in soil [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 642-649 (in Chinese)