杜娟，龐俊曉，游靜

中國科學院廣州地球化學研究所 有機地球化學國家重點實驗室，廣州 510640

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廣東清遠電子垃圾處理地沉積物對伸展搖蚊的慢性毒性效應

杜娟，龐俊曉，游靜

中國科學院廣州地球化學研究所 有機地球化學國家重點實驗室，廣州 510640

電子垃圾拆解引起的環(huán)境污染和生態(tài)風險已成為全球關注的熱點問題，不適當?shù)碾娮永鸾膺^程造成處理區(qū)水體沉積物受到多類有機化合物和重金屬污染，直接威脅生活在沉積物中的底棲動物。在典型電子垃圾處理地廣東清遠采集沉積物，測定樣品中以烴類為主的色譜難分離混合物(unresolved complex mixture，UCM)的含量，開展伸展搖蚊全生命周期慢性毒性測試。結(jié)果表明，清遠沉積物中的UCM濃度(0.08±0.01)%接近于這類污染物對伸展搖蚊的慢性半致死性效應濃度(0.073±0.022)%。同時發(fā)現(xiàn)清遠沉積物對以搖蚊為代表的底棲無脊椎動物具有顯著慢性毒性效應，且可通過測定UCM含量初步估算。這為開展以電子垃圾處理地沉積物為代表的，受到以麻醉作用為主要致毒機制的混合物污染的沉積物的毒性評價提供了一種有效方法。

電子垃圾；色譜難分離混合物；沉積物；伸展搖蚊；慢性毒性

據(jù)統(tǒng)計，全世界每年超過4千萬噸廢舊電子產(chǎn)品被廢棄處理，其中約有70%電子垃圾在中國處理，目前在廣東、浙江兩省已形成了多個較大規(guī)模的電子垃圾處理地，如廣東汕頭貴嶼、清遠龍?zhí)潦呛驼憬_州[1-4]。不適當?shù)碾娮永幚矸绞?，對當?shù)貧狻⑼?、水等環(huán)境介質(zhì)造成了嚴重污染。例如，清遠龍?zhí)岭娮永鸾鈪^(qū)每年處理電子垃圾近百萬噸，主要采用手工拆解、焚燒、填埋等粗放式的處理方式。這種處置方式導致多類污染物被釋放到處理地及其周邊地區(qū)環(huán)境中[5]。電子垃圾拆解造成的區(qū)域環(huán)境污染問題已引起廣泛關注，目前主要集中在電子垃圾拆解區(qū)持久性有機污染物和重金屬在不同環(huán)境介質(zhì)中濃度水平、遷移分布、生物積累和人體暴露[6-13]。

釋放到環(huán)境中的疏水性污染物易于在沉積物中蓄積，前期研究在電子垃圾處理地附近水體沉積物中頻繁檢測到相對高濃度的重金屬和多種有機污染物，如多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯和溴代阻燃劑等[6-7,11,13]。這些沉積物中的污染物，一方面可在生物體中富集，并沿食物鏈傳遞，另一方面，也直接影響生活在其中的底棲生物。以底棲無脊椎動物為模式生物的沉積物毒性測試常被用作沉積物風險評價的一項重要指標[14]。Mehler等[15]運用伸展搖蚊幼蟲開展10 d急性毒性測試，以此評價了珠三角城市水體沉積物毒性，他們發(fā)現(xiàn)71%城市河道沉積物對搖蚊幼蟲具有急性致死性毒性，而其中農(nóng)藥殘留是急性毒性的主要貢獻者。與此相反，雖然在清遠龍?zhí)岭娮永幚淼睾拥啦杉某练e物中檢測到較高濃度的重金屬、多環(huán)芳烴和多溴聯(lián)苯醚等污染物，但是這些沉積物對搖蚊幼蟲無明顯急性毒性效應，因此在該研究中被選做參考沉積物[15]。進一步的研究中，Pang等[16]發(fā)現(xiàn)電子垃圾處理地采集的沉積物對底棲動物雖然未表現(xiàn)急性毒性，但在底棲環(huán)節(jié)動物夾雜帶絲蚓產(chǎn)生的生物擾動作用下，沉積物中釋放出的多環(huán)芳烴等污染物卻可導致在沉積物中暴露了28 d的鉤蝦的生存率顯著降低。這說明在這些沉積物中長時間暴露對底棲生物存在潛在危害，因此針對該區(qū)域沉積物中污染物種類繁多，但對底棲動物急性毒性相對較弱的情況，有必要發(fā)展針對表現(xiàn)麻醉作用機制的混合污染物的慢性毒性測試方法，更有效地評價典型電子垃圾處理地的沉積物毒性效應。

色譜難分離混合物(UCM)主要成分為石油烴，其中又以烷烴、環(huán)烷烴等飽和烴類為主。低沸點的飽和烴類，濃低度時能引起動物的麻醉和昏迷，高濃度時能造成細胞的損傷死亡，而高沸點的飽和烴類則能使生物的營養(yǎng)與輸導系統(tǒng)產(chǎn)生紊亂，整體而言UCM是表現(xiàn)麻醉作用機制的烴類混合污染物[17]。本研究以UCM代表急性毒性較弱的混合污染物，以伸展搖蚊為模式生物，優(yōu)化全生命周期沉積物毒性測試方法，并在清遠龍?zhí)梁拥啦杉练e物，開展搖蚊全生命周期毒性測試，以確定所優(yōu)化的慢性毒性測試方法用于評價典型電子垃圾處理地沉積物毒性的適用性。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 沉積物樣品的采集與加標

清遠沉積物樣品取自廣東省清遠市龍?zhí)伶?zhèn)，靠近電子垃圾拆解地的一條小溪(N23°33′28.42''和E113°01′58.04'')。慢性毒性實驗的對照組沉積物采自于廣東省從化市流溪河水庫(N23°41'58.14"和E113°42'30.06")，前期研究結(jié)果表明該沉積物對模式動物不產(chǎn)生慢性毒性[18-19]。在選定河道，用不銹鋼鏟采集表層5 cm內(nèi)沉積物，過35目不銹鋼篩去除碎石和枝條后，再經(jīng)4 h攪拌使其充分混合均勻后，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

礦物油中含有與UCM相似的較高比例的烷烴、環(huán)烷烴等飽和烴類，在美國環(huán)保局建立毒性評價鑒定程序時被作為UCM的替代物使用[20]，因此本實驗用礦物油作為UCM的替代物。礦物油購自荷蘭赫爾市Acros Organics公司。清遠沉積物攪勻后直接用于開展搖蚊慢性毒性實驗。從化沉積物除了作為空白對照之外，另取部分加入不同量的礦物油用作UCM加標沉積物，共設置3個濃度梯度(理論加標濃度分別為0.06%、0.1% 和0.5% g 礦物油·g-1沉積物干重，下同)，UCM加標沉積物老化1個月后進行實驗。

1.2 生物測試

1.2.1 受試生物

搖蚊幼蟲，又稱為紅蟲，是許多經(jīng)濟魚類的餌料生物，其生物量約占底棲生物總量的70%～80%，幾乎遍及世界所有的淡水環(huán)境，在水生食物鏈中占據(jù)重要環(huán)節(jié)[21]。因此，搖蚊幼蟲作為重要指示動物，在水體污染和生物監(jiān)測中廣泛運用[14,21-24]。如圖1所示，搖蚊是一種完全變態(tài)發(fā)育的昆蟲，其個體發(fā)育過程包括卵、幼蟲、蛹和成蟲4個階段，而健康的搖蚊卵串整體長約10～25 mm，寬度大約5～10 mm，呈“C”型，裹有透明膠狀物質(zhì)。

圖1 搖蚊全生命周期的4個階段Fig. 1 Four stages during a whole life cycle of Chironomid midge

1.2.2 沉積物中伸展搖蚊毒性實驗

本研究采用伸展搖蚊(Chironomus dilutus)，其隸屬昆蟲綱(Insecta)、雙翅目(Diptera)、搖蚊科(Chironomidae)。慢性毒性實驗所用的伸展搖蚊在本實驗室長期馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件的各項指標均符合美國環(huán)保局標準方法[14]。沉積物全生命周期慢性毒性測試按照Du等[18]描述的方法進行。簡言之，測試用燒杯中放入60 g濕沉積物，添加250 mL中等硬水作為上覆水。實驗開始，加入20只剛孵化的伸展搖蚊幼蟲(< 24 h)，在流動換水系統(tǒng)中進行毒性測試?；緶y試條件包括：水溫保持在(23±1) ℃，光照：黑暗時間比為16:8，1 d更換2次上覆水，每次100 mL，并每日監(jiān)測溫度(實測值為(23.3±0.2) ℃)、pH(實測值為(7.39±0.14))、溶解氧濃度(實測值為(5.8±1.4) mg·L-1)和電導率(實測值為(342±16) μs·cm-1)等水質(zhì)參數(shù)，每隔2天測定一次上覆水中氨氮含量(實測值為(0.35±0.17) mg·L-1)。搖蚊每天投喂1次磨碎的魚食(主要成分為魚肉、蝦肉、豆粕、維生素、礦物質(zhì)和酵母等)，每次1 mL，但考慮到其不同生命期的生理差異及對食物需求量和敏感性的差異等因素，食物濃度在實驗過程中按照下面濃度變化：(1)實驗開始后2 d內(nèi)不喂食；(2)(3～7) d，0.6 g·L-1；(3)(8～12) d，3 g·L-1；(4)第13 天至實驗結(jié)束，6 g·L-1。

毒性測試以A、B、C 3組同時進行，每組3個平行樣。A組的搖蚊在沉積物中暴露20 d后(羽化前)，篩出計算其存活率，并通過測定搖蚊幼蟲的去灰分干重(ash-free dry weight，AFDW)來表征生長情況[25]。B組沉積物用于研究搖蚊幼蟲全生命周期的慢性毒性效應，即沉積物暴露對搖蚊羽化和繁殖情況的影響。具體操作如下：搖蚊幼蟲自毒理實驗開展的第23 天起開始羽化，自此，一直到實驗結(jié)束，每天記錄不同階段搖蚊的羽化時間、羽化數(shù)量、成蟲死亡時間、死亡數(shù)量、卵串數(shù)量及卵數(shù)，并計算累積羽化率、羽化速率、性別比例和產(chǎn)卵率等非致死毒性效應參數(shù)。當B組沉積物中搖蚊幼蟲全部羽化完畢后，再等待7 d之后結(jié)束全生命周期毒性測試。C組沉積物用于向B組沉積物中補充雄性搖蚊成蟲。表1總結(jié)了實驗過程中所測定的致死性和半致死性效應。

根據(jù)美國環(huán)保局標準方法[14]的要求，慢性毒性實驗中的上覆水水質(zhì)參數(shù)需滿足：溶解氧濃度不低于2.5 mg·L-1，pH值不低于7.8，溫度23 ℃左右，氨氮含量小于1 mg·L-1。此外，各毒性效應終點參數(shù)的數(shù)值需滿足以下條件時才能保證實驗數(shù)據(jù)有效可靠：對照空白樣中搖蚊平均存活率在第20 天時不低于70%，實驗結(jié)束時不低于65%；搖蚊羽化率不低于50%；平均每串卵所含總卵數(shù)應不小于800，且孵化率不低于80%。

表1 伸展搖蚊全生命周期毒性測試中所選致死性和亞致死性效應的毒性終點

1.3 沉積物中UCM含量分析

為測定沉積物中UCM含量，冷凍干燥的沉積物用丙酮和正己烷混合溶劑萃取，再用中性硅膠-氧化鋁柱層析法凈化，而凈化后的沉積物萃取物中UCM含量通過正構烷烴n-C10～C38總濃度來表示。其濃度用島津QP2010 Plus系列氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進行分析，采用電子轟擊離子源(EI)模式，全掃描(Scan)方式。GC-MS條件：初始爐溫80 ℃，保留1 min后，先以8 ℃·min-1升至250 ℃，然后再以20 ℃·min-1升至300 ℃保留38 min。載氣為氦氣，流量1.3 mL·min-1，不分流進樣；進樣量為1 μL。毛細管柱：DB-5 MS (60 m長 × 0.25 mm內(nèi)徑 × 0.25 μm涂層厚度)。離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度260 ℃。通過檢索NIST質(zhì)譜庫和標準物質(zhì)色譜峰保留時間對比進行定性分析，并采用外標峰面積和多點校正曲線法定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

毒性測試數(shù)據(jù)(半數(shù)效應濃度)用Probit分析進行處理，而數(shù)據(jù)差異性分析使用方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比較，顯著水平設置在α = 0.05，當P < 0.05時認為數(shù)據(jù)存在顯著性差異。所有的數(shù)據(jù)處理均采用SPSS13.0 軟件進行。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

伸展搖蚊具有筑巢習性，幼蟲發(fā)育至1齡末期時開始在沉積物中筑巢，并且一般不更換巢穴，隨著幼蟲體長的增加巢也越來越長，幼蟲以各種藻類、細菌及含有機物的泥土、動植物遺骸、排泄物為食[26-27]。隨著在污染沉積物中暴露時間的延長，搖蚊幼蟲由于進食沉積物顆粒量增多和體表接觸沉積物時間增長，受毒害污染物的抑制和脅迫隨之增強。本實驗中發(fā)現(xiàn)暴露在UCM加標的沉積物和電子垃圾處理地采集的野外沉積物中的搖蚊均表現(xiàn)出慢性毒性效應。

2.1 UCM加標沉積物對伸展搖蚊的慢性毒性效應

空白從化沉積物中未檢出UCM，而加標沉積物中UCM的實測濃度分別為(0.06±0.03)%、(0.11±0.04)%和(0.34±0.17)%。如圖2和3所示，沉積物中不同濃度下的UCM對伸展搖蚊的存活、生長和羽化均產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。

圖2 在色譜難分離混合物(UCM)加標沉積物中長期暴露后伸展搖蚊的存活率與生長情況(以去灰分干重AFDW表示) 注：不同字母(a, b和a’, b’, c’)分別表示搖蚊在不同濃度下暴露20 d和59 d后的顯著性差異(P < 0. 05)。Fig. 2 Percent survival and ash free dry weight (AFDW/(mg·replicate-1)) of Chironomus dilutus after chronic exposure to sediments spiked with unresolved complex mixture (UCM)Note: Significant differences (P < 0. 05) among the treatments after 20 d and 59 d exposure were indicated by different letters (a, b and a’, b’, c’), respectively.

圖3 在色譜難分離混合物(UCM)加標沉積物中長期暴露后伸展搖蚊羽化率與時間的關系 注：不同字母(a, b和c)表示不同暴露組的顯著性差異(P < 0. 05)。Fig. 3 Cumulative emergences of Chironomus dilutus versus exposure time after chronic exposure to sediments spiked with unresolved complex mixture (UCM) Note: Significant differences (P < 0.05) among the treatments were indicated by different letters (a, b, c).

在空白對照沉積物中，搖蚊幼蟲存活率在第20天和第59天毒理實驗結(jié)束時分別為(80.0±4.1)%和(71.3±2.5)%，均滿足實驗要求[14]。隨著沉積物中UCM濃度增加，搖蚊幼蟲的存活率呈現(xiàn)明顯下降趨勢，在最高UCM濃度(0.34%)加標的沉積物中，搖蚊幼蟲全部死亡，而UCM濃度為(0.11±0.04)%沉積物中搖蚊存活率從第20天的(62.5±6.5)%降至第59天的(38.8±2.5)%。Probit分析獲得在20 d和59 d沉積物中UCM的半致死性濃度(LC50)分別為(0.100±0.075)%和(0.073±0.022)%。Sibley等[28]也曾觀察到隨暴露時間的延長，搖蚊存活率呈現(xiàn)下降趨勢，他們認為2個時間點死亡率的差異是由于部分搖蚊幼蟲在第20天至其成蛹前死亡[29]。同樣，隨著沉積物中UCM濃度增加，搖蚊幼蟲的AFDW明顯下降。暴露20 d后UCM對搖蚊成長所產(chǎn)生的5%和50%的毒性效應濃度(EC5和EC50)分別為(0.028±0.001)%和(0.010±0.075)%。因為沉積物中UCM濃度升高時，搖蚊幼蟲需花費更多的能量來應對逐漸加強的毒性脅迫，所以分配到生長發(fā)育的能量相應減少，AFDW降低[30]。

當搖蚊幼蟲生長受抑制時，對其羽化情況也會產(chǎn)生影響。圖3顯示UCM顯著降低了搖蚊羽化率，并延緩羽化速度。沉積物中UCM對搖蚊羽化率的EC5和EC50分別為(0.008±0.000)%和(0.045±0.025)%。此外，UCM暴露對羽化后的搖蚊成蟲的性別比和雌蚊產(chǎn)卵率都產(chǎn)生了影響。與對照組相比，暴露在UCM污染的沉積物中的雌性和雄性搖蚊的比例降低，且雌蚊產(chǎn)卵率也顯著降低。以搖蚊平均產(chǎn)卵總數(shù)表征UCM的繁殖毒性效應，對應的EC5和EC50分別為(0.007±0.004)%和(0.039±0.020)%。整體而言，沉積物中UCM對伸展搖蚊有慢性毒性效應，對其存活率、生長情況、羽化率、產(chǎn)卵率和孵化率等產(chǎn)生不同程度的抑制作用。

2.2 清遠沉積物對伸展搖蚊的慢性毒性效應

由于不適當?shù)碾娮永鸾膺^程，早期研究在清遠龍?zhí)脸练e物樣品中頻繁檢出多類重金屬及持久性有機污染物[6-7,11,13,15-16]。除此之外，本實驗還分析了清遠沉積物中的UCM含量(0.08±0.01)%，該結(jié)果接近于全生命周期暴露實驗結(jié)束時(第59天)UCM對搖蚊的LC50值(0.073 ±0.022)%。

與UCM污染的沉積物一樣，電子垃圾處理地沉積物對搖蚊表現(xiàn)出慢性毒性效應，圖4顯示了清遠沉積物的慢性暴露對搖蚊的存活與生長情況的影響。從圖4中可見，空白對照組中，第20天和59 天毒性實驗結(jié)束時搖蚊幼蟲存活率分別為(80.0±4.1)%和(71.3±2.5)%，而暴露在清遠電子垃圾拆解地附近河道采集的沉積物中搖蚊的存活率分別為(65.0±4.1)%和(41.0±5.7)%(分別在第20天和第59天測定)。另外，圖4也顯示了濃度為0.11%的UCM加標沉積物中搖蚊存活率，在第20天和第59天分別為(62.5±6.5)%和(38.8±2.5)%。

圖4 在不同沉積物(從化對照組沉積物、0.11%UCM加標沉積物和清遠沉積物)中長期暴露后伸展搖蚊的存活率與生長情況(以去灰分干重AFDW表示) 注：不同字母(a, b和a’, b’)分別表示搖蚊在不同濃度下暴露20 d和59 d后的顯著性差異(P < 0. 05)。Fig. 4 Percent survival and ash free dry weight (AFDW/(mg·replicate-1)) of Chironomus dilutus after chronic exposure to different sediments (Conghua control, 0.11% UCM-spiked and Qingyuan sediments) Note: Significant differences (P < 0. 05) among the treatments after 20 d and 59 d exposure were indicated by different letters (a, b and a’, b’), respectively.

此外，與空白對照組相比，清遠沉積物中暴露的搖蚊幼蟲生長情況也明顯受到了抑制，暴露20 d后搖蚊幼蟲的平均AFDW顯著低于對照組(降低了約40%)，該結(jié)果卻和0.11% 的UCM加標沉積物中搖蚊的生長情況相當。當搖蚊幼蟲生長受到抑制時，其羽化和繁殖等也均會受到影響[31]。由此可見，雖然清遠沉積物在10 d急性毒性測試中未對搖蚊幼蟲產(chǎn)生毒性效應，但是在該沉積物中長時間暴露的搖蚊的生存、生長、羽化和繁殖卻都受到了抑制。

2.3 以UCM為混合污染物代表的電子垃圾處理地沉積物慢性毒性評價

如圖4所示，盡管UCM含量為(0.08±0.01)%的清遠電子垃圾處理地沉積物中還同時存在其他多種類型的污染物，其對伸展搖蚊的致死和生長的影響與(0.11±0.01)%的UCM加標沉積物相當(20 d, P = 0.88; 59 d, P = 0.74)。除此之外，其他毒性終點也表現(xiàn)出相似性，如累積羽化率(清遠沉積物(13.8±7.5)%，加標沉積物(35±13.5)%)、性別比(清遠沉積物0.78 ± 0.38，加標沉積物0.80 ± 0.58)。這說明通過簡單測定電子垃圾處理地沉積物中UCM含量，可初步評估沉積物的慢性毒性效應?？赡茉蚴潜M管電子垃圾處理所釋放的污染物種類繁多，但是大多數(shù)都是以麻醉作用為主要致毒機制，在這些區(qū)域的沉積物中如農(nóng)殘等具有特殊作用機制的污染物含量較低。在這種情況下，電子垃圾相關混合污染物對底棲無脊椎動物的慢性毒性可用同樣以麻醉作用為主要致毒機制的UCM進行初步估算。

綜上所述，本實驗以伸展搖蚊為模式生物，利用UCM加標沉積物建立了一套有效的搖蚊全生命周期慢性毒性測試方法，并以此評價了清遠龍?zhí)敛杉牡湫碗娮永幚韰^(qū)沉積物的慢性毒性。結(jié)果顯示盡管電子垃圾處理地沉積物對底棲無脊椎動物未表現(xiàn)急性毒性，但是在長時間暴露后，卻會對伸展搖蚊的存活、生長、羽化和繁殖等產(chǎn)生不同程度的抑制作用。對于主要組成以麻醉致毒機理為主的復合污染型沉積物，如電子垃圾處理地采集的沉積物樣品，測定其中UCM含量可為沉積物對底棲動物的慢性毒性提供簡單有效的初步評估，為受電子垃圾污染的水體沉積物中混存污染物風險評價提供一定手段。

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Chronic Toxicity of Sediment Collected from an E-waste Recycling Site in Qingyuan, Guangdong toChironomusdilutus

Du Juan, Pang Junxiao, You Jing*

State Key Laboratory of Organic Geochemistry, Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China

Received 3 December 2015 accepted 23 December 2015

Environmental pollution and ecological risk caused by e-waste recycling have become a great concern. Improper e-waste recycling activities may cause sediment contamination by organic pollutants and heavy metals, posing a potential threat to benthic organisms. Sediment samples which were collected from Qingyuan, a representative e-waste recycling site, were analyzed for unresolved complex mixture (UCM) and evaluated for the toxicity using a life-cycle toxicity testing with a benthic invertebrate, Chironomus dilutus. The concentration of UCM in Qingyuan sediment was (0.08±0.01)% (g oil·g-1dry sediment) and it was close to the chronic median lethal concentration of UCM to C. dilutus (0.073±0.022)%. In addition, the sediments from Qingyuan e-waste recycling site exhibited significant chronic toxicity to C. dilutus, and the toxicity could be estimated by measuring UCM contents in sediment. This study provided a valuable method for assessing chronic toxicity of sediments which were contaminated by a mixture of chemicals with narcotic mode of action, such as sediments in e-waste recycling sites.

E-waste; unresolved complex mixture; sediment; Chironomus dilutus; chronic toxicity

10.7524/AJE.1673-5897.20151129008

國家自然科學基金(41222024, 41273120)

杜娟(1984-)，女，博士，研究方向為生態(tài)風險評價，E-mail: zixia0716@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: youjing@gig.ac.cn

2015-12-03 錄用日期：2015-12-23

1673-5897(2016)2-209-07

X171.5

A

簡介：游靜(1974-)，女，博士，研究員，主要研究方向為沉積物生態(tài)風險評價，發(fā)表學術論文80余篇。

杜娟, 龐俊曉, 游靜. 廣東清遠電子垃圾處理地沉積物對伸展搖蚊的慢性毒性效應[J]. 生態(tài)毒理學報，2016, 11(2): 209-215

Du J, Pang J X, You J. Chronic toxicity of sediment collected from an e-waste recycling site in Qingyuan, Guangdong to Chironomus dilutus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 209-215 (in Chinese)