衛(wèi) 昊 許 棟 姚東風(fēng) 胡 宇 劉繼平

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

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苦杏仁苷對(duì)變應(yīng)性哮喘小鼠氣道炎癥的影響

衛(wèi) 昊 許 棟 姚東風(fēng) 胡 宇 劉繼平

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

目的: 探討苦杏仁苷對(duì)變應(yīng)性哮喘小鼠氣道炎癥的影響。方法：雌性BALB/c小鼠50只，隨機(jī)分為5組：分別為空白對(duì)照組、模型制造組、給藥高劑量組(20mg/kg)、給藥低劑量組(10mg/kg)和地塞米松磷酸鈉陽(yáng)性對(duì)照組(2mg/kg)。除了對(duì)照組以外，于第1、8天將每組的動(dòng)物，以每只腹腔和皮下都給藥0.1ml的致敏液，第15～28天各組(除了對(duì)照組)注射2.5%的OVA霧化激發(fā)，并且根據(jù)小鼠的體重注射相對(duì)應(yīng)劑量的藥物。在經(jīng)過(guò)一周的治療時(shí)間以后，取肺泡灌洗液(BALF)做一個(gè)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)BALF中炎癥因子(IL-4，INF-γ)，采取氣道進(jìn)行病例分析。結(jié)果：苦杏仁苷10mg/kg組及20mg/kg組肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)均比模型組顯著降低,嗜酸性粒細(xì)胞降低尤其顯著，病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，苦杏仁各劑量組氣管黏膜下層嗜酸性細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)都有減輕趨勢(shì)，且能夠顯著減少肺泡灌洗液中IL-4的含量，提高INF-γ的含量。結(jié)論：10mg/kg和20mg/kg的苦杏仁苷均可對(duì)患病小鼠變應(yīng)性氣道炎癥產(chǎn)生明顯的抑制作用。

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，主要受環(huán)境因素和免疫因素等引起，目前被定性為多基因遺傳性疾病，該病是由多種細(xì)胞(如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)及細(xì)胞組分參與，其中最常見(jiàn)的變應(yīng)性哮喘通常是由吸入和食入變應(yīng)原而誘發(fā)的，其發(fā)病的關(guān)鍵因素是患者的特應(yīng)性素質(zhì)和由其所導(dǎo)致的氣道對(duì)變應(yīng)原的敏感性和反應(yīng)性增高，而且會(huì)使氣道縮窄及氣道炎癥[1]。而免疫失衡是目前哮喘機(jī)制研究的熱點(diǎn)，其中Th1/Th2失衡是重要的機(jī)制。Th1細(xì)胞主要釋放INF-γ，能抵抗過(guò)敏反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要釋放IL-4，能促進(jìn)過(guò)敏反應(yīng)?？嘈尤蕿樗N薇科植物杏(Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.)、西伯利亞杏(Prunus sibirica L.)、東北杏[Prunus mandshurica (Maxim.) Koehne]或杏 Prunus armeniaca L.的干燥成熟種子[2]?？嘈尤噬芬约案鞣N炮制品有效成分苦杏仁苷在體內(nèi)分解的氫氰酸能抑制呼吸中樞而起到鎮(zhèn)咳，平喘作用，使呼吸加深，咳嗽減輕，痰易咳出。本文主要通過(guò)小鼠模型探討苦杏仁苷對(duì)具有病變的小鼠變應(yīng)性氣道炎癥的影響。

1 材 料

1.1 試 藥 苦杏仁苷(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：A1194)地塞米松磷酸鈉(天津藥液股份有限責(zé)任公司，批號(hào):102604)。雞蛋清白蛋白(上海生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào):110909)；氫氧化鋁凝膠(揚(yáng)州市星斗藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào):100805)；嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)液(北京建成生物工程研究院，批號(hào):20131214)；IL-4及INF-γ ELISA試劑盒(北京凱基生物有限責(zé)任公司,批號(hào)：20121024)。

1.2 動(dòng) 物 SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠50只，6～8周齡，體重18～22g。西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào):0011740。飼養(yǎng)環(huán)境: 陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房溫度維持在 18℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3d。

1.3 儀 器 S-888F型超聲波霧化器(中外合資南京道芬電子有限責(zé)任公司)；FAH04N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LDZS-2自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

2 方 法

2.1 患病小鼠模型的建立及給藥方式 將50只正常小鼠隨機(jī)分為5組：分別為模型組、試藥高劑量組(10mg/kg) 組、試藥低劑量組(20mg/kg)組、空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只小鼠。除對(duì)照組外，每組動(dòng)物于第1、8天，每只皮下給藥0.1ml致敏液，并腹腔注射0.1 ml致敏液(0.2 ml致敏液含OVA 0.1 mg，氫氧化鋁0.02 mg)，第15～28天 2.5%OVA溶液霧化激發(fā)，霧化20 min。把相同劑量放入生理鹽水代替致敏液給藥于對(duì)照組，并采用生理鹽水霧化。13～29d霧化，灌胃給藥時(shí)間于每次霧化前30 min。

2.2 肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞學(xué)研究 在手術(shù)臺(tái)上放置已處理的動(dòng)物，將胸腔打開，用細(xì)繩把左支氣管肺門部結(jié)扎；將氣管小心分離開來(lái)，在不破壞周圍組織的情況下,在氣管環(huán)狀軟骨下方剪一V型切口，將針頭前端磨平的2.5ml注射器插入，并且固定，1.5 ml生理鹽水以每次0.5ml分3次灌洗。取一滴液體滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池當(dāng)中，待其靜置以后在顯微鏡下讀取白細(xì)胞的總數(shù)。1 000 r/min室溫下離心15 min，將上清液傾出，取沉淀涂片固定，染液染色，在鏡下讀取300個(gè)白細(xì)胞，計(jì)算各種白細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算各類白細(xì)胞所占白細(xì)胞百分比。綜合白細(xì)胞的總數(shù)和各類白細(xì)胞的百分比最終換算得到BALF中各類白細(xì)胞數(shù)。

2.3 氣道病理學(xué)檢查 取小鼠氣道組織，一般制備病理切片，進(jìn)行病理檢測(cè)采用HE染色，鞏固液選用4%中性甲醛溶液，

2.4 ELISA法 測(cè)定肺部洗液(BALF)中 IL-4及INF-γ含量 取小鼠測(cè)定肺部洗液適量，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)定IL-4及INF-γ含量。

3 結(jié) 果

3.1 苦杏仁苷對(duì)患病小鼠支氣管炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 與對(duì)照組相比較，模型組各種致病細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(P<0.01)，中性粒細(xì)胞有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(P<0.05)；而與模型組比較，與陽(yáng)性對(duì)照組相比、苦杏仁苷組給藥后白細(xì)胞總數(shù)顯著減少(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組中的淋巴細(xì)胞有顯著性差異(P<0.01)，苦杏仁苷組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組中的中性粒細(xì)胞，較模型組顯著減少(P<0.01)，其他各給藥組給藥后較模型組相比較無(wú)明顯差異；單核細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性對(duì)照組較模型組顯著減少(P<0.01)；嗜酸性粒細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照組，苦杏仁苷給藥后顯著降低(P<0.01)，苦杏仁苷組有所降低(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 苦杏仁苷對(duì)支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)以及各炎癥細(xì)胞的影響

3.2 氣道病理學(xué)檢測(cè) 可見(jiàn)對(duì)照組黏膜上皮完好，未見(jiàn)顯著的脫落、壞死，固有層及黏膜下層中沒(méi)有看見(jiàn)充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)細(xì)胞，外膜可見(jiàn)完整的透明軟骨支架。模型組可見(jiàn)氣管黏膜下層中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括嗜酸性細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少量漿細(xì)胞。與模型組相比較，各個(gè)給藥組的病變都有減輕趨勢(shì)，尤其地塞米松磷酸鈉陽(yáng)性對(duì)照組、苦杏仁苷組減輕趨勢(shì)均略優(yōu)于對(duì)照組以及模型組,結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3 苦杏仁苷對(duì)哮喘小鼠BALF 中B細(xì)胞生長(zhǎng)因子及INF-γ含量的影響 與對(duì)照組相比較，模型組BALF 中B細(xì)胞生長(zhǎng)因子含量顯著上升(P<0.05)，INF-γ含量顯著下降(P<0.05)；苦杏仁苷組及地塞米松磷酸鈉組BALF 中B細(xì)胞生長(zhǎng)因子含量顯著下降(P<0.05)，INF-γ含量顯著上升(P<0.05)，說(shuō)明苦杏仁苷能調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫失衡。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 BALF 中IL-4及INF-γ含量(n=10)

A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：地塞米松組；D：苦杏仁苷(10mg/kg)；E：苦杏仁苷(20mg/kg)

4 討 論

哮喘是由多種炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)共同參與的慢性非特異性炎癥疾病，慢性炎癥導(dǎo)致氣道的高反應(yīng)性，是哮喘患者臨床遷延難愈，反復(fù)發(fā)作的重要原因[3]。其關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞是嗜酸性粒細(xì)胞和Th細(xì)胞[4]。炎癥細(xì)胞(尤其是嗜酸性粒細(xì)胞)在氣道的局部聚集、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放等是形成和維持氣道炎癥并進(jìn)而引起組織損傷和氣道功能障礙的主要原因。哮喘發(fā)病的重要原因是由于體內(nèi)的Th1/Th2比例失衡[5]。IL-4 是重要的Th2 型細(xì)胞因子，在黏液分泌，細(xì)胞及浸潤(rùn)等過(guò)程起著重要的作用；INF-γ為Th1型細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，主要作用是抑制IgE 的合成和Th2型細(xì)胞因子的分化[6-7]。Th2型細(xì)胞效應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)Th1型細(xì)胞效應(yīng)減弱，尤其是IL-4/IFN-γ的比例與哮喘的進(jìn)展密切相關(guān)，因而人們常以此比例來(lái)間接反映Th1/Th2的比例。因此，改變Th1和Th2細(xì)胞的免疫失衡狀態(tài)，使免疫反應(yīng)由Th2 型向Th1 型逆轉(zhuǎn)，在治療支氣管哮喘患者中起著重要意義。 臨床上采用治療哮喘的藥物主要是β2受體激動(dòng)劑、抗膽堿藥、茶堿類等。這些藥物都是針對(duì)單一靶點(diǎn)進(jìn)行治療，所以亟待尋找更有效的藥物。哮喘屬中醫(yī)學(xué)的“哮病”范疇，中醫(yī)藥是尋找有效藥物的寶庫(kù)，而且中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多作用的特點(diǎn)。很多中藥已經(jīng)報(bào)道具有抗哮喘的作用，杏仁是有效的止咳藥物，苦杏仁苷是其中主要成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦杏仁的抗哮喘作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究。

本研究發(fā)現(xiàn)高劑量苦杏仁苷可依賴性地升高INF-γ水平，減少患病小鼠BALF 中IL-4水平，降低IL-4/INF-γ的比值，由這個(gè)數(shù)據(jù)可得到苦杏仁苷可調(diào)節(jié)Th1/Th2比例的平衡，從而達(dá)到抑制炎性介質(zhì)的發(fā)出和聚集、減輕哮喘氣道炎癥的目的。近幾年來(lái)，中草藥用于治療各種疾病已是越來(lái)越常見(jiàn)且有很大的療效，苦杏仁常常被稱作維生素B17，已成為中醫(yī)上常用的祛痰止咳劑，常用來(lái)輔助治療癌癥。但是誤服過(guò)量的苦杏仁可導(dǎo)致機(jī)體中毒，利用純天然藥物治療各種疑難雜癥已成為新型治療疾病的一種趨勢(shì)。

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(收稿2016-08-10；修回2016-08-29)

哮喘 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 大鼠 @苦杏仁苷

R256.12

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.055