陳圍， 楊承忠， 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401331)

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DOI:10.11984/j.issn.1000-7083.20150322

碘泡蟲屬粘孢子蟲分子進(jìn)化及其與宿主協(xié)同關(guān)系的研究

陳圍， 楊承忠*， 趙元莙*

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401331)

以18S rDNA為分子標(biāo)記，對(duì)碘泡蟲屬M(fèi)yxobolus粘孢子蟲的分子進(jìn)化規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果顯示：碘泡蟲屬各物種18S rDNA的AT含量(53.2%)高于GC含量(46.8%)，表現(xiàn)出一定的AT組成偏向性；各物種18S rDNA遺傳距離在0.00～0.35；腦碘泡蟲M.cerebralis保守區(qū)序列變異介于淡水物種和廣鹽性物種之間；碘泡蟲屬18S rDNA分子系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)生境相同先聚枝，形態(tài)相似后聚枝的規(guī)律，并表現(xiàn)出一定的宿主特異性和組織向性。此外，以線粒體COⅠ基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)碘泡蟲屬相應(yīng)宿主進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明：淡水物種與廣鹽性物種分別聚在不同的分類枝系中，與寄生于宿主體內(nèi)的碘泡蟲所呈現(xiàn)的支序樹有相同的進(jìn)化趨勢(shì)，并表現(xiàn)出一定的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系；海水起源的虹鱒Oncorhynchusmykiss在適應(yīng)淡水過(guò)程中被腦碘泡蟲寄生，兩者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演化，最終適應(yīng)淡水環(huán)境。

18S rDNA；碘泡蟲屬；宿主；COⅠ；協(xié)同進(jìn)化

粘孢子蟲Myxosporea是一類主要寄生于魚類的寄生蟲，迄今描述的種類已經(jīng)超過(guò)2 200種(Kentetal.，2001；Canning & Okamura，2003；Lom & Dyková，2006；Whipps & Zhao，2015)。碘泡科Myxobolidae Bütschli，1882是粘孢子蟲綱中最大的一科，碘泡蟲屬M(fèi)yxobolus又是碘泡科中最大的一屬，此屬被報(bào)道的物種已有800多種(Eirasetal.，2005；Lom & Dyková，2006；Zhaoetal.，2013)。該屬的大多數(shù)物種擁有極為相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且宿主親緣關(guān)系較近。以往僅依據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒別物種，很容易造成物種鑒定上的誤差和混亂。近年來(lái)分子系統(tǒng)學(xué)研究方法的引入對(duì)粘孢子蟲分類學(xué)的發(fā)展起到了極為重要的促進(jìn)作用。

現(xiàn)今，越來(lái)越多的學(xué)者將寄生蟲與宿主種系發(fā)生趨勢(shì)對(duì)照分析，構(gòu)建宿主-寄生蟲進(jìn)化模式，從協(xié)同進(jìn)化(coevolution)的角度來(lái)推測(cè)寄生蟲的進(jìn)化規(guī)律(Klimpeletal.，2007；Cavalleroetal.，2011；Cecilia & Graciela，2015)。協(xié)同進(jìn)化是宿主和寄生蟲進(jìn)化過(guò)程中共同存在的歷史相關(guān)關(guān)系。二者通過(guò)2種可能的機(jī)制相互作用，即共物種形成(宏進(jìn)化過(guò)程)和共適應(yīng)(微進(jìn)化過(guò)程)(Hoberg & Brooks，2008)。一些學(xué)者以DNA為分子標(biāo)記研究寄生蟲-宿主的種系發(fā)生(Nadler & Hudspeth，2000；Presaetal.，2002；Nadleretal.，2005；Klimpeletal.，2007；Cavalleroetal.，2011；D’Amelioetal.，2012；Cecilia & Graciela，2015)，認(rèn)為線粒體COⅠ基因構(gòu)建的宿主系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與寄生蟲ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定的協(xié)同進(jìn)化趨勢(shì)(Cecilia & Graciela，2015)。

目前，用于粘孢子蟲系統(tǒng)學(xué)研究的分子標(biāo)記有18S rDNA，ITS-1，ITS-2，HSP70，28S rDNA(Andreeetal.，1999；Whippsetal.，2004；Fiala，2006；Zhaoetal.，2008)。粘孢子蟲18S rDNA序列是至今為止GenBank中信息最為豐富的分子標(biāo)記，因此在粘孢子蟲種、屬級(jí)階元以及更高級(jí)階元研究領(lǐng)域仍廣泛應(yīng)用。以18S rDNA為分子標(biāo)記，學(xué)者們已對(duì)不同粘孢子蟲的起源和系統(tǒng)進(jìn)化問(wèn)題進(jìn)行了研究，解決了一些懸疑問(wèn)題(Kentetal.，2001；Fiala，2006；Nesnidaletal.，2013；Zhaoetal.，2013)。但是，以往學(xué)者們主要基于相關(guān)數(shù)據(jù)研究粘孢子蟲類群本身的分類和進(jìn)化，從粘孢子蟲與其宿主協(xié)同進(jìn)化的審視角度研究粘孢子蟲的分子進(jìn)化，則國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

基于上述研究現(xiàn)狀，本研究整理了GenBank中碘泡蟲屬57個(gè)物種18S rDNA和相應(yīng)宿主COⅠ基因序列，結(jié)合孢子形態(tài)特征、宿主、寄生部位、棲息地詳細(xì)探討了碘泡蟲屬物種間的分子進(jìn)化規(guī)律，以期為粘孢子蟲的分類學(xué)與發(fā)生學(xué)研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

在GenBank中獲得129個(gè)碘泡蟲屬不同物種的18S rDNA序列，除去較短序列，剩余57個(gè)物種，序列信息見(jiàn)表1；依據(jù)碘泡蟲的相關(guān)數(shù)據(jù)獲取寄生宿主COⅠ基因序列，序列信息見(jiàn)表2。

1.2 碘泡蟲屬物種18S rDNA序列分析

對(duì)57個(gè)碘泡蟲屬物種18S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，通過(guò)Clustal W程序按照缺省參數(shù)進(jìn)行。序列經(jīng)過(guò)比對(duì)和排列后，利用MEGA 4.0軟件(Tamuraetal.，2007)進(jìn)行分析，計(jì)算堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換數(shù)與顛換數(shù)的比值R(TS/TV)，使用K2P模型計(jì)算遺傳距離；利用BioEdit 7.0 (Hall，1999)計(jì)算序列保守區(qū)。

表1 碘泡蟲的18S rDNA GenBank登錄號(hào)

表2 碘泡蟲宿主的COⅠ基因GenBank登錄號(hào)

1.3 碘泡蟲屬物種18S rDNA和宿主COⅠ基因的分子系統(tǒng)發(fā)育分析

采用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)對(duì)碘泡蟲屬物種構(gòu)建18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，以軟孢子蟲Tetracapsuloidesbryosalmonae(KF731712)為外群；基于K2P模型對(duì)宿主物種COⅠ基因構(gòu)建鄰接(NJ)樹。用Modeltest 3.7 (Posada & Crandall，1998)計(jì)算獲得序列最佳進(jìn)化模型GTR+I+G。BI樹在MrBayes 3.1.2軟件(Ronquist & Huelsenbeck，2003)中構(gòu)建，位點(diǎn)變異設(shè)置為invgamma分布，同時(shí)建立4條馬爾科夫鏈，以隨機(jī)樹為起始樹，共運(yùn)行3 000 000代，每200代抽樣一次。在舍棄老化樣本后，根據(jù)剩余樣本構(gòu)建一致樹。ML樹在PAUP 4.0軟件中進(jìn)行，選擇100次重復(fù)抽樣進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn)。NJ樹在MEGA 4.0軟件(Tamuraetal.，2007)中進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 碘泡蟲屬物種18S rDNA序列特征

57個(gè)碘泡蟲屬物種的18S rDNA對(duì)位分析獲得比對(duì)位點(diǎn)共1 706個(gè)，變異位點(diǎn)(1 008)占59.1%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(857)占50.2%，自裔位點(diǎn)(149)占8.73%。平均堿基組成為A 26.3%，T 26.9%，C 19.1%，G 27.7%，AT含量(53.2%)高于GC含量(46.8%)，表現(xiàn)出一定的AT組成偏向性。18S rDNA的R值為1.148，轉(zhuǎn)換率稍大于顛換率。轉(zhuǎn)換數(shù)(16.9)最高發(fā)生在T-C之間，顛換數(shù)(6.16)最高發(fā)生在G-C之間。

基于K2P模型計(jì)算碘泡蟲屬物種種間遺傳距離矩陣顯示，57個(gè)物種種間遺傳距離在0.00～0.35(圖1)，其平均遺傳距離為0.16，淡水物種間遺傳距離集中于0.01～0.20，廣鹽性物種間遺傳距離集中于0.10～0.30，廣鹽性物種與淡水物種之間的遺傳距離集中于0.15～0.35，大部分物種彼此間的遺傳距離集中于0.10～0.15(26.4%)與0.20～0.25(34.0%)2個(gè)范圍(圖1)。

獲得31個(gè)保守區(qū)，相比于淡水物種，廣鹽性物種的序列差異較大(圖2)。其中，腦碘泡蟲M.cerebralis的堿基變異介于淡水物種與廣鹽性物種之間。相比于淡水物種，廣鹽性物種堿基變異非常集中且變異位點(diǎn)很大。

圖1 57個(gè)碘泡蟲屬物種基于18S rDNA的種間遺傳距離分布

2.2 碘泡蟲屬物種及其宿主的系統(tǒng)發(fā)育樹特征

所構(gòu)建的57個(gè)碘泡蟲屬物種18S rDNA的ML樹和BI樹均得到了較高的支持率，二者拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致(圖3)。廣鹽性物種位于支序樹的基部，與淡水物種分開且主要形成兩大枝系。淡水物種主要分為A枝與B枝，腦碘泡蟲獨(dú)立成一小枝，A枝與B枝為姐妹枝。A枝中物種主要寄生于鰓和腸壁，該枝中大部分物種的孢子殼面觀與極囊均似橢圓形，極囊前端突起很尖。其中巨囊碘泡蟲M.diversicapsularis、異型碘泡蟲M.dispar、鰓基碘泡蟲M.basilamellaris、貝殼碘泡蟲M.musseliusae的兩極囊表現(xiàn)為一大一小，產(chǎn)生碘泡蟲M.ticto和優(yōu)雅碘泡蟲M.elegans孢子殼面觀呈葵瓜子形，前端稍尖，極囊呈茄形。B枝中大多數(shù)物種寄生于鰓部，少部分物種寄生于肌肉，且大部分物種的孢子殼面觀呈水滴狀，前端稍尖，極囊細(xì)長(zhǎng)且寬度較小。塔形碘泡蟲M.pyramidis和肥滿碘泡蟲M.obesus孢子殼面觀近圓形，前者前端稍盾，后者前端突起稍尖；雜交鯪碘泡蟲M.mrigalhitae孢子殼面觀呈不規(guī)則瓜子形且極囊一大一??；內(nèi)膜碘泡蟲M.intimus和似野結(jié)碘泡蟲M.tambroides孢子殼面觀飽滿且呈橢圓形，前端突起稍尖。A+B枝中41個(gè)淡水物種對(duì)應(yīng)的寄生宿主中絕大多數(shù)隸屬于鯉科(體型較小)。廣鹽性水域的碘泡蟲物種位于C枝與D枝中，其寄生部位較廣泛，大多數(shù)物種孢子殼面觀似葵瓜子形，前端稍盾，極囊寬大，約占整個(gè)孢子體積的2/3，其中比薩塔碘泡蟲M.bizerti孢子殼面觀近圓形，楔形碘泡蟲(相似種)M.cf.cuneus和轉(zhuǎn)神經(jīng)碘泡蟲M.neurotropus殼面觀似瓜子形且寬度較小，神經(jīng)碘泡蟲M.neurobius孢子殼面觀近橢圓形。

圖2 57個(gè)碘泡蟲屬物種18S rDNA保守區(qū)域變異位點(diǎn)

Fig. 2 Variable sites in conserved regions of 18S rDNA in fifty-seven species ofMyxobolusspp.

小圓點(diǎn)代表相同位點(diǎn), 淡紫色、淡藍(lán)色和灰色背景分別表示淡水物種、廣鹽性物種和腦碘泡蟲; 數(shù)字編號(hào)代表與表1對(duì)應(yīng)的碘泡蟲物種。

Matched siteswere represented by dots, the background of lavender, calamine blue and gray showed the species in freshwater, euryhaline waters andMyxoboluscerebralis, respectively; numbers indicated the correspondingMyxobolusspp. in table 1.

基于宿主COⅠ基因構(gòu)建的NJ樹(圖4)顯示，廣鹽性物種首先從支序樹中分化出來(lái)，聚于樹的基部，淡水物種后分化并聚為一大枝，與碘泡蟲的分子系統(tǒng)樹所反映的進(jìn)化趨勢(shì)整體一致。差別在于虹鱒Oncorhynchusmykiss聚于廣鹽性物種枝系，與褐鱒Salmotrutta聚為一小枝，且淡水物種暗色沙塘鱧Odontobutisobscura也與廣鹽性物種聚為一枝。直紋石脂鯉Bryconorthotaenia與巴西紅點(diǎn)鮭Salminusbrasiliensis位于樹的基部(圖4)。

3 討論

3.1 碘泡蟲屬物種18S rDNA分子進(jìn)化趨勢(shì)

Stoeckle和Hebert(2008)認(rèn)為，基因序列之間的分歧程度與物種的形成過(guò)程密切相關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)57種碘泡蟲的序列分析發(fā)現(xiàn)碘泡蟲物種間的基因差異較明顯，變異位點(diǎn)占序列組的59.1%，而簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)占50.2%，顯示碘泡蟲各物種在相同的位點(diǎn)均可能發(fā)生過(guò)相同或不同程度的堿基替換?；贙2P模型計(jì)算的遺傳距離值中約90%的遺傳距離值在董江麗等(2011)報(bào)道的種間遺傳距離(0.083～0.242)范圍值之內(nèi)。遺傳距離值在0.00～0.05、0.25～0.35出現(xiàn)的頻率只有6.2%，這種正態(tài)分布型的遺傳距離分布與少數(shù)物種間親緣關(guān)系較近或較遠(yuǎn)有關(guān)。廣鹽性物種與其他物種的遺傳距離值相對(duì)較大，但淡水物種與廣鹽性物種之間在遺傳距離上并不存在絕對(duì)的界限。

保守區(qū)內(nèi)變異位點(diǎn)的不同顯示淡水物種和廣鹽性物種的序列出現(xiàn)不同程度的變異(圖2)。除腦碘泡蟲的變異介于淡水物種和廣鹽性物種間外，淡水物種與廣鹽性物種之間有較為明顯的堿基差異，表明碘泡蟲屬物種在這兩大生境中已產(chǎn)生了不同的適應(yīng)性。

圖4 基于K2P模型構(gòu)建的碘泡蟲宿主COⅠ支序樹

淡紫色和淡藍(lán)色背景分別表示的是淡水物種和廣鹽性物種。

The background of lavender and calamine blue showed the species in freshwater and euryhaline waters, respectively.

3.2 碘泡蟲-宿主的系統(tǒng)發(fā)生與協(xié)同進(jìn)化

本研究顯示碘泡蟲屬?gòu)V鹽性物種均先從支序樹中分化出來(lái)，且與淡水物種分布于不同枝系，這與以往的研究基本一致(Fiala，2006；索棟，趙元莙，2010)。ML/BI樹(圖3)中，碘泡蟲屬各物種表現(xiàn)為形態(tài)相似則聚枝的現(xiàn)象，即：孢子殼面觀呈橢圓形的物種聚為A枝，孢子殼面觀呈水滴狀的物種聚為B枝，孢子殼面觀似葵瓜子形的物種聚為C枝與D枝(圖3)，呈3種不同的進(jìn)化趨勢(shì)。巨囊碘泡蟲、異型碘泡蟲、鰓基碘泡蟲、貝殼碘泡蟲、雜交鯪碘泡蟲的孢子極囊一大一小，但孢子殼面觀與對(duì)應(yīng)的同一枝系的其他物種的形態(tài)一致；產(chǎn)生碘泡蟲、優(yōu)雅碘泡蟲、塔形碘泡蟲、肥滿碘泡蟲、內(nèi)膜碘泡蟲和似野結(jié)碘泡蟲的孢子形態(tài)雖然與同一枝系的其他物種不太一致，但仍然聚為一枝，這可能與環(huán)境差異引起的近緣種的趨異進(jìn)化有關(guān)。以往的工作已經(jīng)顯示碘泡蟲屬粘孢子蟲具有一定的寄生特性與組織向性(Zhaoetal.，2008)。雖然上述物種在支序樹上出現(xiàn)一定程度不一致的現(xiàn)象，但均來(lái)自于淡水，大生境一致，聚為一大枝。

關(guān)于虹鱒的起源曾存在較大爭(zhēng)議(劉澧津，1996)。新近的研究表明，虹鱒是一種發(fā)源于北太平洋的鮭科魚類，現(xiàn)今已在全世界淡水中廣泛養(yǎng)殖，歷史上虹鱒應(yīng)屬于海水魚類(Olsenetal.，2015)。本研究中宿主魚類的系統(tǒng)發(fā)育分析也印證了這一點(diǎn)(圖4)。同時(shí)，寄生于虹鱒上的轉(zhuǎn)神經(jīng)碘泡蟲在碘泡蟲屬18S rDNA構(gòu)建的支序樹中聚于廣鹽性枝系(圖3)，這進(jìn)一步證實(shí)了虹鱒起源于海水。但是，同是寄生于虹鱒的腦碘泡蟲卻聚在淡水枝系中。有研究表明，在宿主和寄生蟲的協(xié)同關(guān)系中，宿主對(duì)寄生蟲基因的影響是不容忽視的，且環(huán)境的改變對(duì)宿主-寄生蟲系統(tǒng)的多樣化和持久性是相當(dāng)重要的(Brooks，1981；Brooks & McLennan，1993；Mattiucci，2006；Hoberg & Brooks，2008；Kuuselaetal.，2009；Okamuraetal.，2015)。由此，結(jié)合前述的保守區(qū)變異分析所顯示的腦碘泡蟲堿基變異界于淡水物種和廣鹽性物種之間的事實(shí)支持：海水起源的虹鱒在適應(yīng)淡水過(guò)程中被腦碘泡蟲寄生，兩者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演化最終適應(yīng)淡水環(huán)境。

本研究結(jié)果顯示，淡水生活的暗色沙塘鱧聚于廣鹽性枝系(圖4)，而其上寄生的丸本碘泡蟲卻聚在淡水枝系(圖3)。雖然有研究表明，鱸形目Perciformes魚類絕大多數(shù)起源于海水(Cardenasetal.，2005；Giovannottietal.，2007)，但對(duì)于暗色沙塘鱧的起源問(wèn)題卻未見(jiàn)報(bào)道。因此，暗色沙塘鱧及其寄生蟲丸本碘泡蟲在進(jìn)化上的協(xié)同關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上，碘泡蟲屬物種與其宿主在進(jìn)化中存在協(xié)同關(guān)系，這種關(guān)系主要體現(xiàn)在寄生蟲和宿主基因組發(fā)生的適應(yīng)性變化，且與寄生的時(shí)間起點(diǎn)、環(huán)境、寄生蟲-宿主的進(jìn)化模式具有相關(guān)性。粘孢子蟲與宿主在長(zhǎng)期的相互適應(yīng)或雙向的容納和共存過(guò)程中，已經(jīng)形成了特殊的關(guān)系，如宿主特異性和組織向性則是這種關(guān)系的具體表現(xiàn)，而這種關(guān)系即為協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，這在粘孢子蟲綱動(dòng)物類群中應(yīng)是普遍存在的。

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Molecular Evolution ofMyxobolus(Myxosporea) and Coevolution with their Hosts

CHEN Wei, YANG Chengzhong*, ZHAO Yuanjun*

(Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

18S rDNA as a molecular marker was used to explore the rule of molecular evolution inMyxobolusmyxosporeans. The results indicated that, among each species inMyxobolus, the AT contents (53.2%) of 18S rDNA were higher than GC contents (46.8%), and therefore showed a somewhat AT bias; the genetic distances of 18S rDNA among each species was ranged from 0.00 to 0.35; within the conserved regions of 18S rDNA, the variation level inM.cerebraliswas between that of freshwater and euryhaline species; phylogenetic trees based on 18S rDNA showed that species with the same habitats tend to cluster together firstly, and then the sublines could be clustered according to the morphological similarity of spores. Moreover, the clustering tendency indicated some degree of host and tissue specificity. Phylogenetic analyses on the hosts ofMyxobolusbased on COⅠ gene showed that the freshwater and euryhaline species were grouped into different lineages, revealing the same evolution trend ofMyxobolus, and presenting the coevolution relationships of hosts-parasites;M.cerebralismight be the myxosporean who parasited on marine origined fishOncorhynchusmykissin the process of adapting to the freshwater environment.

18S rDNA;Myxobolus; host; COⅠ; coevolution

2015-10-16 接受日期：2016-01-08 基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31471980； No.31501845)； 重慶市科委基金項(xiàng)目(No.cstc2010ca1010； No.cstc2014jcyjA80014)； 重慶市教委科技項(xiàng)目(KJ1400502)

陳圍(1988—)， 女， 碩士研究生， 研究方向?yàn)轸~類寄生蟲學(xué)， E-mail:weer2013@foxmail.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:drczyang@126.com； zhaoyuanjuncqnu@126.com

Q959.115

A

1000-7083(2016)02-0183-07