盧許波，趙 陽，德吉央金，格桑卓瑪，德 吉

（西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

拉薩扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌的分離與鑒定

盧許波，趙 陽，德吉央金，格桑卓瑪，德 吉

（西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

開展瑞香狼毒（Stellera chamaejasma）根際土壤微生物的研究，能夠?yàn)槎糁撇菰先鹣憷嵌镜乃僚疤峁﹨⒖假Y料。釆用稀釋倒平板法從瑞香狼毒根際土壤中分離、純化細(xì)菌；采用經(jīng)典分類和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析相結(jié)合的技術(shù)，對純化的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離自拉薩河谷（扎葉巴溝）的瑞香狼毒土壤中的細(xì)菌55株，歸屬為鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas melonis）、Pseudomonas sp.、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、日本假單胞菌（Pseudomonas japonica）、芽孢桿菌（Bacillus sp.），其中又以鞘氨醇單胞菌為優(yōu)勢種；扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)間存在一定差異。其中鞘氨醇單胞菌對瑞香狼毒的抑制作用值得進(jìn)一步研究。

拉薩；扎葉巴溝；瑞香狼毒；土壤；26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析

目前，國內(nèi)外對瑞香狼毒的研究有很多，涉及對花粉萌發(fā)和種子結(jié)實(shí)的花粉化感效應(yīng)及其防控［6-7］，以及其地域分布、中藥的性能等的研究［8］。研究方向傾向于對瑞香狼毒活性物質(zhì)的提取以及測定活性物質(zhì)對真菌、腫瘤細(xì)胞的抑制作用或體外抗氧化作用、免疫功效等［9-13］，如楊國紅等對瑞香狼毒生物活性成分研究；王敏等對瑞香狼毒總黃酮的抗瘤研究；王宇等的瑞香狼毒總黃酮對老鼠的高脂血癥降脂的研究等。

青藏高原被譽(yù)為第三極，獨(dú)特的地理環(huán)境（高海拔、高寒、缺氧、強(qiáng)輻射等）造就了許多具有特異性的物種，加之地廣人稀沒有過多的人類活動，青藏高原的原始生態(tài)并未遭到太大破壞，可以說青藏高原是未完全開發(fā)的研究極端環(huán)境生物的基地。由于青藏高原地理環(huán)境的特殊性，也造就了豐富特殊的微生物資源［14］。而關(guān)于青藏高原的瑞香狼毒根際土壤的微生物尚未見報(bào)道。本研究旨在開展拉薩河谷瑞香狼毒土壤細(xì)菌多樣性研究，以期為青藏高原微生物資源的開發(fā)利用以及為瑞香狼毒微生物抑制劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年9月，在拉薩河谷扎葉巴溝隨機(jī)采取瑞香狼毒根際土壤9份。土壤樣品為瑞香狼毒根際周圍10 cm以內(nèi)、土層垂直深度5～15 cm的土壤。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基具體配制參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行。

1.2 細(xì)菌的分離純化與鑒定

將土壤樣品混勻，從每份土壤中稱量1 g后迅速倒入含有99 mL無菌水的三角瓶中，震蕩20 min，得到10-2土壤懸液。取10-2土壤懸液直至稀釋至10-7土壤懸液。用移液器接種0.1 mL的10土壤懸液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，均勻涂抹，每份土壤樣品處理3次重復(fù)，采用平板劃線法進(jìn)行菌株純化，28℃培養(yǎng)2 d。樣本由北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel軟件計(jì)算細(xì)菌多樣性指數(shù)，計(jì)算不同土壤樣品細(xì)菌Jaccard相似性系數(shù)，不同土壤中細(xì)菌總豐度差異性分析采用Duncan檢驗(yàn)法。

細(xì)菌多樣性指數(shù)主要包括物種豐富度、細(xì)菌總豐度、出現(xiàn)頻率、相對豐度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）、Pielou 均勻度指數(shù)（J′）及Simpson多樣性指數(shù)（D）等。其中，物種豐富度指從其中某一份土壤樣品分離的細(xì)菌物種數(shù)，細(xì)菌總豐度指某一份土壤樣品分離的細(xì)菌數(shù)量（CFU/g），出現(xiàn)頻率為某一種細(xì)菌出現(xiàn)的土壤樣品數(shù)占所有土壤樣品數(shù)的百分比，相對豐度指某一種細(xì)菌株數(shù)占所有細(xì)菌菌株數(shù)的百分比。

式中，N為某一份土壤分離細(xì)菌的總株數(shù)，Pi為某一份土壤第i種細(xì)菌菌株數(shù)與該土壤細(xì)菌總株數(shù)的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 拉薩河谷扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌群落組成

結(jié)合經(jīng)典分類法及種屬鑒定將分離自拉薩河谷扎葉巴溝9份根際土壤的55株細(xì)菌歸為3個(gè)屬5個(gè)種。結(jié)果（表1）顯示，鞘氨醇單胞菌屬（1個(gè)屬1個(gè)種）占分離菌株的29.09%，假單胞菌屬（1個(gè)屬2個(gè)種）占分離菌株的36.36%，芽孢桿菌屬（1個(gè)屬2個(gè)種）占分離菌株的34.55%?？梢姡?份土壤樣品中這3個(gè)屬的細(xì)菌相對豐度較高，沒有顯著差異。

從5種細(xì)菌在土壤中的分布情況（表1）可以看出，鞘氨醇單胞菌出現(xiàn)頻率最高、為88.89%，其次為Pseudomonas sp.（77.78%）、蠟狀芽孢桿菌（66.67%） 、芽孢桿菌（55.56%）。相對而言，日本假單胞菌分布不太廣泛，只在4份土壤中出現(xiàn)。

表1 拉薩河谷扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌種群分布

細(xì)菌種類水平相對豐度數(shù)據(jù)（表1）顯示，鞘氨醇單胞菌相對豐度最高，占分離菌株數(shù)的29.09%；其次為Pseudomonas sp.（20.00%）和蠟狀芽孢桿菌（20.00%），相對豐度也較高；日本假單胞菌和Bacillus sp.的相對豐度分別為16.36% 和14.55%。細(xì)菌出現(xiàn)頻率和總相對豐度數(shù)據(jù)表明，鞘氨醇單胞菌為拉薩扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢種。

2.2 拉薩河谷扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤樣寬頻細(xì)菌組成相似度分析

從表2可以看出，9份土壤細(xì)菌Jaccard相似性系數(shù)介于0～1之間。1號樣品與3號、5號、6號、8號樣品之間為極度相似（0.75～1），3號 樣品與5號、6號、8號樣品之間，5號樣品與6號、8號樣品之間以及6號樣品與8號樣品之間也呈極度相似（0.75～1）。而2號樣品與其他8個(gè)樣品之間相似度均較低，基本為極度不相似（0～0.25）?？傊?，不同樣品間細(xì)菌組成存在不同程度的差異。

表2 拉薩河谷扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤樣品細(xì)菌Jaccard相似性系數(shù)

2.3 拉薩河谷扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

從表3可以看出，1號和6號土壤樣品細(xì)菌物種豐富度最高，從其中均分離到5種細(xì)菌，其次是3號、5號和8號樣品（4種），再次是4號樣品（3種），而2號土壤 樣品僅分離到1種細(xì)菌。9個(gè)樣品的數(shù)量總豐富度并無顯著差異。

采用Excel軟件分析9份土壤樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)，結(jié)果（表3）顯示，1號和6號樣品細(xì)菌多樣性最豐富，分布也相對均勻，它們的H′和D約為1.47和0.75；3號、5號和8號樣品細(xì)菌多樣性也較豐富，而2號樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)最低。

3 結(jié)論與討論

采用稀釋涂平板法從拉薩扎葉巴溝采取9份瑞香狼毒根際土壤獲得55株細(xì)菌，經(jīng)北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行種屬鑒定，將其歸為3個(gè)屬5個(gè)種。其中鞘氨醇單胞菌屬相對豐度約為29%，在大多土壤樣本中均有分布，為扎葉巴溝瑞香狼毒土壤根際的優(yōu)勢細(xì)菌種類。超過50%的土壤樣品細(xì)菌多樣性較為豐富，只有2個(gè)樣品細(xì)菌種類極少分布不均勻。

表3 拉薩河谷扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

代平等［16］研究顯示，西藏土壤微生物結(jié)構(gòu)在海拔3 100～3 800 m之間的細(xì)菌主要有大腸桿菌、綠膿桿菌、糞鏈球菌、嗜麥芽假單胞菌、枯草桿菌、聚團(tuán)腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、海洋梭菌、壞名梭菌等，這與本研究結(jié)果明顯不同。另外，周攀［17］研究了青海瑞香狼隊(duì)根際土壤細(xì)菌種類，發(fā)現(xiàn)根際細(xì)菌主要包括變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（B a c t e r o i d e t e s）、綠彎菌門（Chloroflexi）、撫微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（P l a n c t o m y c e t e s）、 芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。這與本研究結(jié)果差別較大，一方面可能由于西藏高原土壤理化性質(zhì)的差別導(dǎo)致細(xì)菌種群的差異，另一方面也可能與瑞香狼毒自身抑菌活性的差異有關(guān)，我們將進(jìn)一步研究瑞香狼毒對不同種類微生物的皿內(nèi)抑菌作用以及特殊微生物制劑對瑞香狼毒的活體防效等。這能為拉薩甚至青藏高原不同生境的瑞香狼毒土壤中的細(xì)菌多樣性或資源的保護(hù)利用奠定基礎(chǔ)。

蠟狀芽孢桿菌廣泛分布于自然界中，是食品及化妝品中常見的污染菌［18］，目前有學(xué)者開展了其對包內(nèi)外酶（如膽固醇氧化酶）、除草活性、重金屬離子（如Cr6+、Pb2+）污染處理活性等的研究［19-22］。芽孢桿菌屬廣泛分布于自然界中，目前有學(xué)者開展了其對廢水染料、鉀長石風(fēng)化等的研究［23-24］。Pseudomonas sp.目前有學(xué)者開展了其對抗生素、污水處理、原料乳中攜帶菌的研究［25-27］。日本假單胞菌目前有學(xué)者開展了其對抗細(xì)菌活性的研究［28］。鞘氨醇單胞菌目前有學(xué)者開展了其對涉及污水處理的研究［29］。可見，拉薩河谷扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤分離出的細(xì)菌基本與降解環(huán)境中存在的污染物等有關(guān)，其中蠟狀芽孢桿菌也與除草活性有關(guān)。

瑞香狼毒本身具有毒性，是肆虐草原的危害植物，拉薩河谷扎葉巴溝的瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌多數(shù)具有降解污染物的潛力。比較西藏拉薩土壤的細(xì)菌群落組成可知，本研究所分離的菌種與西藏拉薩河谷的菌種差異極大，這可能與瑞香狼毒根部分泌的毒性物質(zhì)有關(guān)。我們將進(jìn)一步對獲得的細(xì)菌菌株進(jìn)行污染物降解能力的測定，以更好地開發(fā)利用青藏高原寶貴的微生物資源。

［1］ 史志誠，李柞煌，鄒康南，等. 中國草地重要有毒植物［M］. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1997：140-150.

［2］ 中國科學(xué)院青藏高原綜合科學(xué)考察隊(duì). 西藏植物志［M］. 北京：科學(xué)出版社，1983：329-330.

［3］ 李亞偉. 藏北高寒草原狼毒資源的綜合利用

［D］. 北京：中央民族大學(xué)，2013.

［4］ 王歡，馬青成，耿朋帥，等. 天然草地瑞香狼毒研究進(jìn)展［J］. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（12）：154-160.

［5］ 金輝，楊曉燕，燕志強(qiáng)，等. 瑞香狼毒根際和土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落動態(tài)變化規(guī)律研究// 中國第六屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會論文摘要集［C］. 成都：中國植物保護(hù)學(xué)會植物化感作用專業(yè)委員會，2013.

［6］ 孫庚，羅鵬，吳寧. 瑞香狼毒對青藏高原東部高寒草甸主要物種花粉萌發(fā)和種子結(jié)實(shí)的花粉化感效應(yīng)［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30（16）：4369-4375.

［7］ 王慶海，李琴，龐卓，等. 中國草地主要有毒植物及其防控技術(shù)［J］. 草地學(xué)報(bào)，2013，21（5）：831-841.

［8］ 竇洪舉，李鋒，侯勇躍. 狼毒及瑞香狼毒的研究進(jìn)展［J］. 畜牧與飼料科學(xué)，2013，34（11）：43-47.

［9］ 楊國紅. 瑞香狼毒等三種藥用植物的生物活性成分［D］. 上海：復(fù)旦大學(xué)，2005.

［10］ 王敏，賈正平，馬駿. 瑞香狼毒總黃酮提取物的抗腫瘤作用［J］. 中國中藥雜志，2005，30（8）：603-605.

［11］ 王宇. 瑞香狼毒總黃爾對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠降脂作用的研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［12］ 竇洪舉，李鋒，侯勇躍. 狼毒及瑞香狼毒的研究進(jìn)展［J］. 畜牧與飼料科學(xué)，2013，34（11）：43-47.

［13］ 趙磊，杜娟，卜春亞，等. 瑞香狼毒活性物質(zhì)對草莓灰霉病菌的抑制作用［J］. 植物病理學(xué)報(bào)，2012，42（4）：411-417.

［14］ 孔維棟. 極地陸域微生物多樣性研究進(jìn)展生物多樣性［J］. 生物多樣性，2013，21（4）：456-467.

［15］ 黃秀梨，幸明秀. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］. 第2版. 北京：高等教育出版社，2015：附錄二.

［16］ 代平，車應(yīng)龍，曾桂茹，等. 西藏高原不同海拔高度土壤細(xì)菌學(xué)調(diào)查［J］. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1997（3）：188-89.

［17］ 周攀. 瑞香狼毒對根際微生物群落的影響及在干旱脅迫下狼毒蛋白表達(dá)譜的變化［D］. 西安：西北大學(xué)，2015.

［18］ 周幗萍，袁志明. 蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）污染及其對食品安全的影響［J］. 食品科學(xué)，2007，28（3）：357-360.

［19］ 葛飛，龔倩，張慧敏，等. Bacillus cereus SG03 10L發(fā)酵罐中產(chǎn)胞外膽固醇氧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 食品工藝科技，2014，35（17）：137-140.

［20］ 楊娟，張明月，張崎峰，等. 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）XG1的分離、鑒定與除草活性研究［J］. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（2）：81-86.

［21］ 肖偉，王磊，李倬鍇，等. 六價(jià)鉻還原細(xì)菌Bacillus cereus S5. 4還原機(jī)理及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］. 環(huán)境科學(xué)，2008，29（3）：751-755.

［22］ 潘建華，劉瑞霞. 蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus吸附鉛的研究［J］. 環(huán)境科學(xué)，2004，25（2）：166-169.

［23］ 李凡姝，劉海洋，范麗莉，等. 菌株Bacillus sp. CLb芽孢漆酶對染料、模擬染料廢水脫色的研究［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（15）：4569-4572.

［24］ 黃智，何琳燕，盛下放，等. 礦物分解細(xì)菌Bacillus sp．L11對鉀長石的風(fēng)化作用［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2013，53（11）：1172-1178.

［25］ 梁艷瓊，賀春萍，鄭肖蘭，等. 解磷細(xì)菌對7種常見抗生素的抗性研究［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（33）：207-213.

［26］ 呂晶華，馬挺，鄭先強(qiáng)，等. PCR-DGGE技術(shù)解析A2/O工藝好氧單元中微生物群落結(jié)構(gòu)［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2012，6（6）：1904-1914.

［27］ 周國君，唐玲，胡萍，等. 應(yīng)用PCR-DGGE對巴氏消毒乳中腐敗細(xì)菌的污染溯源研究［J］. 食品工業(yè)科學(xué)，2015，36（16）：49-51，57.

［28］ 劉郵洲，Shien Lu，陳志誼，等. secG在假單胞菌Pseudomonas japonica YL23抗細(xì)菌活性中的功能研究//中國植物保護(hù)學(xué)會成立50周年慶祝大會暨2012年學(xué)術(shù)年會論文集［C］. 北京：中國植物保護(hù)學(xué)會，2012.

［29］ 吳堅(jiān). 污水處理池中兩株細(xì)菌的分離及性能鑒定［D］. 成都：西南交通大學(xué)，2009.

（責(zé)任編輯 楊賢智）

Isolation and identification of bacteria from the rhizosphere soil of Stellera chamaejasme L. in Zhayeba Valley，Lhasa

LU Xu-bo，ZHAO Yang，DEJI Yang-jin，GESANG Zhuo-ma，DE Ji

（School of Science，Tibet University，Lhasa 850000，China）

Study on the microorganisms from rhizosphere soil of Stellera chamaejasme L. can provide reference for the suppression of rampant S. chamaejasme L. Bacteria from the rhizosphere soil of Stellera chamaejasme L. were isolated and purified by dilution plate method，and the purified bacterial strains were identified using classical classification method combined with sequence analysis of the D1/D2 domain of 26S rDNA；data processing and analysis were conducted by Microsoft Excel and SPSS 19.0 software. Results demonstrated that 55 bacterial strains isolated from the soil of S. chamaejasme L. in Lhasa river valley （Zhayeba valley） belonged to Sphingomonas melonis，Pseudomonas sp.，Bacillus cereus，Pseudomonas japonica and Bacillus sp.，among which Sphingomonas melonis was a dominant species. Additionally，there was a certain difference in the population structure of bacteria from the rhizosphere soil of S. chamaejasme L. in Zhayeba valley. In conclusion，the inhibitory effect of S. melonis on S. chamaejasme L. is worthy of further study.

Lhasa；Zhayeba Valley；Stellera chamaejasma；soil；sequence analysis of the D1/D2 domain of 26S rDNA

S154.38+1

A

1004-874X（2016）10-0095-05

2016-07-24

西藏國家級大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510694006）

盧許波（1994-），男，在讀本科生，E-mail：779499064@qq.com

德吉（1972-），女，藏族，講師，E-mail：1307944864@qq.com

盧許波，趙陽，德吉央金，等. 拉薩扎葉巴溝瑞香狼毒根際土壤細(xì)菌的分離與鑒定［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（10）：95-99.

瑞香狼毒（Stellera chamaejasma）是瑞香科狼毒屬植物，分布在我國東北、華北、西北、西南等地區(qū)，主要生長在海拔2 600～4 200 m的草坪、灘地和干燥陽坡，西南地區(qū)分布于西藏，但

西藏的瑞香狼毒主要產(chǎn)于西藏東部及南部。瑞香狼毒是很強(qiáng)的入侵性毒草，在一些地區(qū)已經(jīng)成為危害性物種。瑞香狼毒根部生長或腐解時(shí)都會釋放出有毒物質(zhì)抑制其他植物生長，而且其莖葉也含有有毒物質(zhì)，牛羊誤食后會出現(xiàn)中毒癥狀，其不僅對草原生態(tài)有著不可忽視的破壞，也對牧業(yè)有著很大的危害［3-5］。