馬玉嬌,楊天楓,張彥民,代秉玲

(西安交通大學 醫(yī)學部藥學院, 陜西 西安 710061)

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·生命科學·

黃連素聯(lián)合塔斯品堿衍生物對肝癌細胞遷移及凋亡的影響

馬玉嬌,楊天楓,張彥民,代秉玲

(西安交通大學 醫(yī)學部藥學院, 陜西 西安 710061)

應用MTT法檢測黃連素聯(lián)合Ta1722對SMMC-7721細胞活力的影響,以金正均法計算q值判斷兩藥相互作用。根據細胞劃痕實驗與Hoechst染色實驗,研究黃連素聯(lián)合Ta1722對SMMC-7721的遷移及凋亡的影響。使用western blot檢測遷移和凋亡相關蛋白表達。黃連素濃度在3.125～25μmol/L范圍內、Ta1722濃度在20μmol/L時,兩者為協(xié)同作用,黃連素聯(lián)合Ta1722對SMMC-7721細胞的遷移無明顯作用,遷移相關蛋白NF-κB,CXCR4,MMP2,MMP9表達無明顯變化。黃連素聯(lián)合Ta1722可誘導SMMC-7721細胞凋亡,上調P53,上調促凋亡蛋白Bax,下調抑凋亡蛋白Bcl-2。黃連素聯(lián)合Ta1722對SMMC-7721細胞的遷移無明顯作用,但可誘導SMMC-7721細胞凋亡,其機制可能是其上調抑癌基因P53的表達,從而導致促凋亡Bax上調,抑凋亡蛋白Bcl-2下調有關。

黃連素；細胞遷移；細胞凋亡

肝癌是威脅我們生命健康的主要惡性腫瘤之一,根據2012年統(tǒng)計,發(fā)展中國家肝癌新增人數男性、女性分別排名第2位和第6位,死亡人數分別位居第2位和第5位,而我國也正是全球肝癌發(fā)生率最高的地區(qū)之一[1]。

轉移是肝癌的基本特征,是影響肝癌治療效果的重要因素。凋亡是一種廣泛存在的生物現(xiàn)象,許多疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡的失衡有關。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn),塔斯品堿衍生物(Ta1722)能夠較好地抑制腫瘤細胞生長,對SMMC-7721肝癌細胞尤為敏感[2]。大量文獻報道,黃連素(Berberine)在抗肝癌作用上具有較好藥理活性,在誘導凋亡、抑制遷移、抑制增殖方面均有一定效果[3],且與放化療聯(lián)用時,可增強腫瘤細胞對傳統(tǒng)放化療的敏感性[4]。因此,本課題以聯(lián)合用藥的方式,研究黃連素聯(lián)合Ta1722對肝癌細胞SMMC-7721遷移及凋亡的影響。

圖1 Ta1722與黃連素結構式(A:Ta1722 B:黃連素)Fig.1 The structural formula of Ta1722 and Berberine (A: Ta1722 B: Berberine)

1 材料與儀器

Ta1722由西安交通大學食品藥品研究與檢測中心合成,RPMI1640培養(yǎng)基(干粉)購自美國 Sigma-Aldrich 公司,胎牛血清購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司,胰蛋白酶購自美國 Amresco 公司,SDS-PAGE制膠試劑盒購自陜西先鋒生物有限公司。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

將本實驗室保持的SMMC-7721細胞,培養(yǎng)于含有10%(體積分數)胎牛血清,100U/mL青霉素與鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在37 ℃,5%(體積分數)CO2條件下培養(yǎng),隔天換液,3-4天胰酶消化傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT試驗

取對數生長期的細胞胰酶消化,計數,接種于96孔板中(4×104個/孔),細胞懸液體積為180μL/孔。每組設5個平行孔,在37℃,5%(體積分數)CO2條件下培養(yǎng)24h后加藥。設不接種細胞的空白組、陰性對照組、黃連素單獨用藥組、黃連素聯(lián)合Ta1722組,其中黃連素組的終濃度為3.125，6.25，12.5，25，50，100μmol/L，聯(lián)合用藥組終濃度設置見表1,再次放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h,吸棄培養(yǎng)基,以無血清的RPMI1640稀釋MTT至0.5mg/mL,每孔加200μL,37 ℃孵育4～6h,小心吸去MTT(噻唑藍),每孔加入二甲基亞砜150μL,搖床上震蕩15min,于490nm處檢測吸光度值。按照以下公式計算細胞活力。

(1)

采用金正均法判斷兩藥聯(lián)用是否具有協(xié)同作用。

q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea*Eb)

(2)

式(2)中 Ea+b為聯(lián)合處理組的抑制率, Ea，Eb分別為a藥和b藥單獨處理組的抑制率。 若q值在0.85～1.15間為兩藥聯(lián)用單純相加, 若q>1.15為有協(xié)同作用, 若q<0.85表示兩藥聯(lián)用有拮抗作用。

2.3 細胞劃痕實驗

取對數期生長的SMMC-7721細胞,接種于12孔板。培養(yǎng)細胞長至70%～80%時,用200μL槍頭在孔板中央劃出一道寬度均勻的劃痕,PBS緩沖溶液洗去漂浮細胞,加入完全培養(yǎng)基,拍照,記作0h。加入Ta1722,黃連素及聯(lián)合組的濃度分別為20,25,20+25μmol/L,設置陰性組,加入相同體積的培養(yǎng)基。分別在24h和48h拍照。

2.4 Hoechst染色實驗

取對數生長期的細胞,消化成單細胞混懸液后接種于24孔板,培養(yǎng)24h貼壁后加入Ta1722,黃連素及聯(lián)合組的濃度分別為20,25,20+25μmol/L,設置陰性組加入相應體積的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后PBS緩沖液洗2次,每次3min,每孔加300μL Hoechst 33258染色液,染色5min后,三蒸水沖洗干凈,在340nm波長紫外光下激發(fā),拍照記錄熒光。

2.5 Western blot實驗

取對數生長期的SMMC-7721接種于6孔板,培養(yǎng)24h貼壁后分別加入Ta1722,黃連素及聯(lián)合組,其濃度為20,25,20+25μmol/L,設置陰性組加入相應體積的無血清培養(yǎng)基。藥物作用48h后,PBS緩沖液洗2次,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30mim,于細胞破碎儀上冰上破碎,4℃,12 000g,離心10min,取上清,BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度。其余蛋白加入上樣緩沖液,沸水中煮沸變性5min,10%SDS-PAGE膠電泳,半干電轉法將蛋白轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉(TBST緩沖溶液稀釋)室溫封閉2h后,加入相應的一抗4℃ 孵育過夜。取出PVDF膜TBST緩沖溶液洗4次,每次5min。加入二抗(稀釋比例1∶20 000，體積比)37℃ 1h,TBST緩沖溶液洗4次,每次5min。ECL化學發(fā)光檢測條帶,用GAPDH作內參。

2.6 數據統(tǒng)計

所有數據均采用平均值±標準誤(means ± SEM)表示,用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05表示差異有顯著性。

3 結 果

3.1 聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞的抑制作用

隨著黃連素劑量的不斷增大,黃連素單獨用藥組與聯(lián)合用藥組對細胞的抑制作用不斷增強,且聯(lián)合組的抑制作用明顯強于黃連素單獨用藥組(P<0.05),見圖2。金正均法檢測顯示除最后兩大濃度組外,其余各組q>1.15,見表1。Ta1722聯(lián)合黃連素在Ta1722為20μmol/L，黃連素濃度在3.125～25μmol/L時，其聯(lián)合效果均為協(xié)同作用。

圖2 黃連素單獨與聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞增殖的影響(*P<0.05)Fig.2 The effect of Berberine and combination on proliferation of SMMC-7721(*P<0.05)

表2 黃連素,Ta1722單獨及聯(lián)合對SMMC-7721細胞的抑制率與聯(lián)合指數q值(x±s,n=3)

Tab.2 The proliferation inhibition rate and combination index q of Berberine, Ta1722 and combination to SMMC-7721(x±s,n=3)

濃度/μmol·L-1BBRTa1722+BBRq值2011.0192±3.727---3.125-6.1440±1.61223.5230±5.5481.436.25-9.0114±0.34632.1329±2.8421.6912.5-15.3222±3.54638.6972±4.2741.5725-38.3474±0.96554.4728±1.9071.2150-50.8764±2.05763.8569±1.5141.13100-64.4710±1.48874.8966±1.0511.10

3.2 聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗結果表明,黃連素單獨用藥組與黃連素聯(lián)合Ta1722組抑制SMMC-7721細胞遷移的效果無明顯差別。同時,western blot也證實其遷移相關蛋白NF-κB,CXCR4,MMP2,MMP9均無明顯差異,見圖3。Ta1722聯(lián)合黃連素對SMMC-7721細胞遷移無明顯影響。

A 細胞劃痕圖； B 細胞遷移相關蛋白表達圖圖3 Ta1722及BBR單獨、聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞遷移的影響Fig.3 The effect of Ta1722, Berberine and combination on migration of SMMC-7721

3.3 聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞凋亡的影響

Hoechst染色實驗結果可以看出,聯(lián)合用藥組凋亡細胞數明顯增加。同時western blot結果顯示,抑癌蛋白p53上調,p38下調,促凋亡蛋白Bax上調,抑凋亡蛋白Bcl-2下調,見圖4。Ta1722聯(lián)合黃連素可以誘導SMMC-7721細胞凋亡。

A Hoechst染色:a. control b. Ta1722 c.BBR d. Ta1722+BBR B 細胞凋亡相關蛋白表達圖圖4 Ta1722及BBR單獨、聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of Ta1722, Berberine and combination on apoptosis of SMMC-7721

4 討 論

化療是肝癌治療的主要手段之一,因單一藥物化療的毒副作用和耐藥性較強,目前臨床多采用聯(lián)合藥物化療。中藥源于自然,不良反應小,不僅能夠提高患者的免疫功能,同時可以彌補手術、化療、生物治療等不足,與放、化療聯(lián)用時增強療效[5]。黃連素是從中草藥黃連、黃柏等植物中提取分離得到的一種異喹啉類生物堿,最早用于臨床上主要治療腸道感染、清熱解毒等。20世紀70年代日本學者最先提出黃連素具有抗腫瘤作用后,目前已發(fā)現(xiàn)黃連對多種腫瘤如肝癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌等均具有抑制作用[3]。Ta1722是本課題組根據從藥用植物紅毛七中分離得到的塔斯品堿為基本骨架,合成得有較好生物活性的化合物。研究發(fā)現(xiàn)Ta1722對SMMC-7721,A549,MCF-7,LOVO等細胞均具有良好的抑制活性,并且發(fā)現(xiàn)Ta1722可以抑制SMMC-7721細胞血管生成,下調VEGFR-2[2]。因此,本實驗將兩種對于肝癌細胞SMMC-7721有較好藥理活性的化合物聯(lián)合用藥,研究其對SMMC-7721的聯(lián)合效果。結果表明,黃連素濃度在3.125～25μmol/L范圍內、Ta1722濃度在20μmol/L時，兩者具有協(xié)同作用,抑制SMMC-7721細胞增殖,且具有濃度依賴性。

腫瘤的侵襲與轉移是惡性腫瘤重要的生物學特征,是一個多步驟的復雜過程?；|金屬蛋白酶(MMPs)是人體降解細胞外機制的主要酶類,參與腫瘤演變的眾多生理和病理過程[6]。Ta1722聯(lián)合黃連素對基質金屬蛋白酶MMP2,MMP9的影響無顯著性,且細胞劃痕實驗也無顯著性,因此,Ta1722聯(lián)合黃連素對SMMC-7721的抑制作用可能與細胞的遷移無關。

正常人體組織、細胞的生長受到精確的調控。而腫瘤細胞,通過研究證實,腫瘤細胞的無限生長是腫瘤細胞凋亡受抑制的結果,因而凋亡障礙同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關系[7]。Bcl-2家族成員在細胞凋亡的線粒體通路中起重要調控作用。Bcl-2具有抗凋亡作用,主要阻止細胞色素C等凋亡因子從線粒體中釋放,使腫瘤組織中最主要的抑制凋亡蛋白之一,在多數腫瘤中Bcl-2表達水平升高[8]。Bax與Bcl-2作用機制相反具有促凋亡作用,通過線粒體上的電壓依賴性離子通道的相互作用,介導細胞色素C的釋放[9]。P53可以控制提高Bax/Bcl-2比例,即上調Bax與下調Bcl-2的表達水平,來完成促進細胞凋亡的作用。Ta1722聯(lián)合黃連素能夠上調P53的表達,下調抑凋亡蛋白Bcl-2,上調促凋亡蛋白Bax。表明Ta1722聯(lián)合黃連素誘導SMMC-7721細胞凋亡,可能與P53,Bcl-2及Bax表達量的變化有關。

Ta1722與黃連素聯(lián)合用藥,可以顯著提高其對SMMC-7721細胞的抑制效果,且誘導細胞凋亡。由此可見,黃連素確實可以增強腫瘤細胞對一些化療藥物的敏感性。

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(編 輯 陳鐿文)

Effects of Berberine combined with the tlerivative of taspine on apoptosis and migration of liver cancer cells

MA Yujiao, YANG Tianfeng, ZHANG Yanmin,DAI Bingling

(Health Science Center, College of Pharmacy, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061， China)

Cell proliferation was assessed by MTT assay. The interaction of Berberine and Ta1722 was estimated by Jin Zheng jun′s method. Wound Scratch assay and Hoechst assay were used to study the effect of Berberine combined with Ta1722 on apoptosis and migration of SMMC-7 721 liver cancer cells. There is a synergic effect between the Berberine and Ta1722 when concentrations of Berberine change from 3.125μmol/L to 25μmol/L and the concentration of Ta1 722 is 20μmol/L. There is no significantly effect on cell migration, as well as NF-κB, CXCR4, MMP2 and MMP9 expression. However, Berberine combined with Ta1722 induced apoptosis which could upregulate P53 and Bax expression and downregulate Bcl-2 expression. Berberine combined with Ta1722 has no significantly effect on cell migration, but can induce apoptosis on SMMC-7721, this effect may be related to the increase of the expression of P53 which leads to the increase of the expression of Bax, reducing the expression of Bcl-2.

Berberine； migration； apoptosis

2016-07-26

國家自然科學基金資助項目(81370088 ; 81503101)

馬玉嬌，女，陜西西安人，從事抗腫瘤化合物藥理學活性研究。

代秉玲，女，山西呂梁人，從事抗腫瘤化合物藥理學活性研究。

R966

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-05-015