袁　野，李浩鵬，邢小勇，胡永浩?

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅　蘭州　730070；2.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南　鄭州　450000）

小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗抗體水平影響

袁野1，2，李浩鵬2，邢小勇1，胡永浩1?

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南鄭州450000）

本試驗旨在研究小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗抗體水平的影響，采用將免疫增強劑小分子發(fā)酵抗菌肽分別添加于正?？乖考皽p量抗原含量的新城疫ND-禽流感（H 9 F株）二聯(lián)滅活苗，禽流感（H 5N 1亞型Re-6株、Re-7株）二價滅活苗中，分別免疫SPF雞。同時用不加免疫增強劑的新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗和禽流感二價滅活疫苗免疫SPF雞作為對照組。結(jié)果表明，通過監(jiān)測雞免疫后不同天數(shù)的血清抗體水平，發(fā)現(xiàn)抗原用量不變的情況下，試驗組比對照組抗體效價均有提高；在抗原用量減少50%的情況下試驗組比對照組抗體效價也均有一定的提高。結(jié)果提示，小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗能起到一定的抗體增強的效果。

免疫增強劑；小分子發(fā)酵抗菌肽；新城疫；禽流感；抗體滴度

新城疫（Newcast le disease，ND）和禽流感（avian inf luenza）是危害禽類的重大疾病，其病原分別是新城疫病毒和禽流感病毒，都屬于高度接觸性傳染病，對世界養(yǎng)禽業(yè)危害[1-3]。

目前，新城疫和禽流感的預(yù)防主要是接種疫苗[4-5]，雞新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程苗[6-7]，而弱毒疫苗為目前市場上最常見的疫苗。禽流感現(xiàn)階段常見的疫苗為全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組活載體疫苗[8-9]。雖然使用常規(guī)疫苗免疫接種可以防治新城疫、禽流感，但在實際情況下常規(guī)單苗存在免疫繁瑣，免疫效果不盡理想，成本高等缺點，針對市場的需求，進而研制出既節(jié)約成本又增強免疫效果的免疫增強劑。

小分子發(fā)酵抗菌肽屬于有機肽類，具有廣譜抗菌抗病毒活性[10]，無殘留，無副作用，無耐藥性，熱穩(wěn)定好，耐熱100℃，10 min，使用方便，分子質(zhì)量小，水溶性好，強堿性，還具有抗原蟲殺瘤作用[11-13]。使用過小分子發(fā)酵抗菌肽的畜禽（如禽飼喂適量）抗病能力增強，生產(chǎn)性能優(yōu)良，經(jīng)濟效益良好。禽用疫苗的生產(chǎn)成本逐年增高，疫苗客戶群對疫苗免疫效果的要求愈高，為能降低滅活苗成本，同時又能增強抗體的實用效果。本研究在正常抗原含量及減量抗原含量下，通過不添加免疫增強劑作為對照組，探討小分子發(fā)酵抗菌肽對雞體感染新城疫，禽流感的免疫調(diào)節(jié)作用，為應(yīng)對新城疫，禽流感能夠達到更加理想的免疫預(yù)防效果奠定了理論依據(jù)[14-17]。

1　材料與方法

1.1試驗動物28日齡SPF雞125只均購自乾元浩生物股份有限公司。

1.2主要試劑小分子發(fā)酵抗菌肽：購自中農(nóng)穎泰生物股份有限公司[99%（純品）]。二硬脂酸鋁：購自溫州（20140102）。司本-80：購自廣東省肇慶市超能實業(yè)有限公司（20131208）。吐溫-80：購自廣東省肇慶市超能實業(yè)有限公司（20130419）

1.3主要儀器M52：購自法國（VG5111304P）。T-18型臺式微型剪切機購自德國IKA公司。LS900激光顆粒粒度分析儀購自青島歐美克公司。八道移液器：購自德國艾本德公司。IKA T10微量乳化機、離心機：購自德國IKA公司。

1.4疫苗疫苗由乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠提供。

1.5小分子發(fā)酵抗菌肽的制備

1.5.1小分子發(fā)酵抗菌肽水相的制備將5 mg小分子發(fā)酵溶于5 mL生理鹽水（0.85%）中，使其濃度為1 mg/mL（1μg/μL）；取含滅活抗原的水相2 mL，加入上述小分子發(fā)酵溶液80μL，混勻待用，即為小分子發(fā)酵免疫增強劑疫苗的水相，最終疫苗中小分子發(fā)酵濃度達到10μg/mL。水相最終pH應(yīng)為6.0～7.0。

1.5.2小分子發(fā)酵抗菌肽油相的制備由中國牧工商集團總公司（乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠）提供疫苗油相，小分子發(fā)酵免疫增強劑疫苗需要6 mL油相。

1.5.3小分子發(fā)酵抗菌肽的乳化按中國牧工商集團總公司（乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠）8 mL體積滅活疫苗配方，進行乳化配苗：將配制好的油相先與小分子發(fā)酵抗菌肽的水相用德國IKAT18型高速剪切機先進行預(yù)乳化，待將水相加入完全后，按一定轉(zhuǎn)速、時間乳化結(jié)束，分裝以備用于動物試驗。

1.6疫苗物理性狀的檢測取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴散為宜。

取10 mL疫苗于離心管中，經(jīng)3 500 r/min離心15 min，應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象；疫苗在37℃左右條件，放置21 d不應(yīng)有破乳現(xiàn)象為佳。

用下口內(nèi)徑為1.2 mm，上口內(nèi)徑為2.7 mm的1 mL移液吸管在25℃左右的條件下吸取疫苗1 mL，令其垂直流出，記錄流出0.4 mL所需的時間。

取5μL疫苗混勻于10 mL白油中，置于LS900激光粒度分析儀中檢測。

1.7疫苗無菌檢測疫苗抽樣，分別取硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基2支，瓊脂培養(yǎng)基2支，葡萄糖培養(yǎng)基1支，每支接種疫苗0.2 mL分別放置于37℃，25℃培養(yǎng)箱中做無菌檢驗。

1.8免疫接種試驗取3周齡的SPF雞125只，分13組：第1～2組每組禽流感（Re-6+Re-7）免疫劑量0.3 mL/羽，第1組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第3～4組每組禽流感H9 F株免疫劑量0.2 mL/羽，第3組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第5～6組每組新城疫ND免疫劑量20μL/羽；第5組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第7～12各組每羽份在原有抗原含量基礎(chǔ)上抗原含量全部減半：第7～8組每組禽流感（Re-6+Re-7）免疫劑量0.3 mL/羽，第7組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第9～10組每組禽流感H9 F株免疫劑量0.2 mL/羽，第9組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第11～12組每組新城疫ND免疫劑量20μL/羽；第11組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第13組取5只作為空白對照，不進行免疫接種。

1.9H H I I抗體檢測SPF雞分別在免疫后21、28、35 d采血、測抗體。

2　結(jié)果與分析

2.1疫苗物理性狀的檢測添加小分子發(fā)酵抗菌的疫苗顏色無變化，呈乳白色，無破乳現(xiàn)象，且無分層現(xiàn)象，粘度、顆粒度也和普通疫苗無明顯差異。

2.2疫苗的無菌檢測添加小分子發(fā)酵抗菌的各組疫苗均呈無菌狀態(tài)。

2.3疫苗的免疫試驗

2.3.1抗原含量正常時禽流感（Re-6株、Re-7株）疫苗的免疫增強試驗結(jié)果

圖1　Re-6株試驗結(jié)果Fig.1　Experimental results o f Re-6 diseased plant

圖2　Re-7株試驗結(jié)果Fig.2　Experimental results o f Re-7 diseased plant

免疫后結(jié)果顯示，抗原含量正常時，由圖1和圖2可以看出，禽流感H5N1 Re-6株和Re-7株，試驗組比對照組均有增強效果。并且，從28 d到35 d，試驗組、對照組抗體效價均呈上升趨勢；由圖1可以看出，Re-6株試驗組比對照組抗體效價提高明顯，21 d時，提高0.4個滴度，28 d時提高1.0個滴度，35 d時提高1.1個滴度；由圖2可以看出，Re-7株試驗組比對照組抗體效價均有提高，在21 d時，提高0.7個滴度，28 d時提高0.2個滴度，35d時提高0.2個滴度。

2.3.2抗原含量正常時新城疫ND、禽流感H 9 F株疫苗的免疫增強試驗結(jié)果

圖3　ND試驗結(jié)果Fig.3　Experim ental results o f ND

圖4　H9 F株試驗結(jié)果Fig.4　Experimental results o f H9 F diseased plant

由圖3可以看出，ND試驗組比對照組抗體效價略有提高，28 d時提高0.2個滴度，35 d時提高0.4個滴度；由圖4可以看出，F(xiàn)株試驗組比對照組抗體效價提高明顯，其中，21 d時，比對照組提高0.8個滴度，28 d時，比對照組提高0.7個滴度，35 d時，比對照組提高0.3個滴度。

2.3.3抗原含量減半時禽流感（Re-6株、Re-7株）疫苗的免疫增強試驗結(jié)果

圖5　Re-6株試驗結(jié)果Fig.5　Experimental results of Re-6 diseased p lant

圖6?。碦e-7株試驗結(jié)果Fig.6　Experimental results of Re-7 diseased plant

由圖5和圖6可以看出，Re-6株和Re-7株，試驗組比對照組都有一定增強效果；由圖5可以看，Re-6株試驗組比對照組抗體效價均有提高，21 d時提高0.6個滴度，28 d時提高0.3個滴度，35 d時提高0.1個滴度；由圖6可以看出，Re-7株試驗組比對照組抗體效價均有提高，21 d時提高0.5個滴度，28 d時提高0.2個滴度，35 d時提高0.6個滴度。

2.3.4抗原含量減半時新城疫ND、禽流感H 9 F株疫苗的免疫增強試驗結(jié)果

由圖7和圖8可以看出，ND、F株試驗組比對照組均有提高；由圖7可以看出，ND試驗組比對照組均有提高，21 d時，提高0.5個滴度，28 d時，提高0.5個滴度，35 d時，提高0.4個滴度；由圖8可以看出，F(xiàn)株試驗組比對照組略有提高，28 d時，提高0.2個滴度，35 d時，提高0.4個滴度。

3　討論

抗菌肽是一類由原核動物與真核動物體內(nèi)均能合成的多肽，具有小分子、強陽離子性、熱穩(wěn)定性好、無藥物屏蔽且不影響真核細胞等特點?？咕耐ǔＷ饔糜诩毦?，在真核生物的天然免疫方面發(fā)揮著重要作用，被認為是古代進化中哺乳動物體內(nèi)有效保留的免疫分子[14-15]。劉莉如等[16]通過飼糧添加天蠶素抗菌肽可不同程度提高蛋用仔公雞生長性能、免疫器官指數(shù)，并能有效降低前炎性細胞因子基因的mRNA相對表達水平。抗菌肽一般通過飼料添加的方式以提高動物機體的免疫水平，但作為疫苗免疫增強劑研究不多見。本試驗通過在抗原量相同的情況下，隨著動物免疫天數(shù)的逐步增加，對于同種抗原而言，小分子發(fā)酵抗菌肽的添加組比同抗原不添加組抗體效價均有所提高，禽流感試驗組比對照組抗體效價均有提高，新城疫ND試驗組比對照組抗體效價略有提高，禽流感F株試驗組比對照組抗體效價提高明顯。試驗結(jié)果表明，在獸醫(yī)免疫中，小分子發(fā)酵抗菌肽可以作為疫苗添加劑以增強免疫效果。

圖7　ND試驗結(jié)果Fig.7　Experim enta l resu lts of ND

圖8　H9 F株試驗結(jié)果Fig.8　Experimental results of H9 F diseased p lant

本試驗還通過在抗原用量減少50%的情況下，小分子發(fā)酵抗菌肽的添加，使得禽流感試驗組比對照組抗體效價有所提高，而新城疫ND試驗組比對照組均有提高，禽流感F株試驗組比對照組略有提高；在抗原用量減少50%時，試驗期望達到正?？乖吭囼炛械目贵w效價水平，而從不同抗原含量的試驗結(jié)果看，在抗原用量減少50%情況下，禽流感（Re-6+Re-7）、新城疫ND和禽流感F株抗體效價均比對照組高。本試驗對小分子發(fā)酵抗菌肽作為禽用疫苗免疫增強劑進行初步研究，試驗結(jié)果表明，小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗能起到抗體增強的效果。小分子發(fā)酵抗菌肽作為疫苗增強劑應(yīng)用前景廣泛，但作為疫苗增強劑的最佳添加劑量、添加時間以及免疫增強機制都有待進一步研究。

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Effectof vaccine antibody levels based on Fermentation antim icrobialpeptide of smallmolecule on inactivated vaccine againstavian

Yuan Ye1,2,Li Haopeng2,Xing Xiaoyong1,Hu Yonghao1*
(1.Col lege of Veterinary Medicine of Gansu Agricul tural University,GansuLanzhou730070；2.China Animal Husbandry Industry CO.,LTD.Zhengzhou biological pharmaceutical factory of QYH Biotech Company Limited),HenanZhenzhou450000)

The experiment was conducted to study the impact of antibody levels on antimicrobial peptide of smal l molecule fermentation on inactivated vaccine about avian.We had used the smal l molecule immune enhancer were added to the normal fermentation antibacterial peptide antigen content and the reduction of the antigen content of Newcast le disease ND and avian Inf luenza(H9 F st rain)duplex inactivated vaccine and avian inf luenza H5N1 Re-6 st rain and Re-7 st rain bivalent inactivated vaccine in SPF chickens were immunized.Addition Newcast le disease and avian inf luenza duplex inactivated vaccine and avian inf luenza H5N1 Re-6 strain and Re-7 strain bivalent inactivated vaccine without immune enhancer immunized SPF chickens as a cont rol group.The resul ts showed that monitoring the serum antibody levels of chicken by dif ferent days af ter immunization, the amount of antigen was found under the same circumstances,the experimental group were increased than the control group in antibody titers,and reducing the amount of antigen in hal f of cases in the experimental group were increased than the cont rol group in antibody titers.The studysuggestthatantimicrobialpeptideofsmal lmoleculefermentationinactivatedvaccine against avian antibodies would improve the speci f ic enhanced ef fect.

Immunostimulants;Antimicrobial peptide of smal l molecule fermentation;Newcast le; Avian inf luenza;Titer of antibody

S859.797

B

1672-9692(2016)01-0008-07

2015-11-02

袁野（1983-），男，河南鄭州人，博士研究生，主要從事生物制品、藥品的研發(fā)與生產(chǎn)。

胡永浩（1962-），男，甘肅古浪人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為動物傳染病學(xué)。

國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）生物獸藥新產(chǎn)品研究和創(chuàng)制（2011AA10A214）。