勾新磊，趙新穎，高 峽,2，周明強，劉偉麗,2

(1.北京市理化分析測試中心，有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京 100089；2.北京市科學技術研究院分析測試技術重點實驗室，北京 100089)

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超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定保健食品中10種磷酸二酯酶-5抑制劑

勾新磊1，趙新穎1，高 峽1,2，周明強1，劉偉麗1,2

(1.北京市理化分析測試中心，有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京 100089；2.北京市科學技術研究院分析測試技術重點實驗室，北京 100089)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)同時測定保健食品中10種磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑。樣品采用 Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)色譜柱分離，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，甲醇為提取溶劑超聲萃取，經HLB固相萃取柱凈化濃縮；在電噴霧正離子模式下，以多反應監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。結果表明，10種磷酸二酯酶-5抑制劑在1.0～100.0 μg/L范圍內線性關系良好，線性相關系數(R2)均大于0.993，方法定量限為1.0 μg/kg；空白樣品在100.0、200.0和1 000.0 μg/kg添加水平下的回收率為85.6%～94.3%。該方法簡便、快速、檢出限低，適用于保健食品中10種磷酸二酯酶-5抑制劑的同時檢測。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)；磷酸二酯酶-5抑制劑(PDE-5)；固相萃??；保健食品

近年來，隨著工作和生活壓力的逐漸加大，很多人會出現易疲勞、免疫力下降等癥狀，因此，可以緩解這些癥狀的保健食品應運而生。然而，一些不法商販受利益驅使，在壯陽、補腎、抗疲勞類保健食品中非法添加西地那非、伐地那非、他達拉非等磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑以增強其效果[1]。消費者誤服或長期大量使用，會出現頭暈、惡心等癥狀，嚴重者會造成腎功能、心臟功能及心血管系統(tǒng)的損傷[2-3]。因此，建立保健食品中磷酸二酯酶-5抑制劑的檢測方法，對打擊制假販假行為、保護消費者健康具有重要意義。

目前，磷酸二酯酶-5抑制劑的檢測方法主要有液相色譜法(LC)[4-7]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[8-14]。LC法靈敏度較低，無法滿足違禁藥物檢測的要求；而LC-MS/MS法具有靈敏度高、檢出限低、可同時進行多組分定性定量檢測的特點，是目前報道較多的方法。但現有文獻[13-14]均主要針對西地那非、伐地那非、他達拉非等常見的磷酸二酯酶-5抑制劑進行檢測，而對通過化學修飾改變部分官能團得到的烏地那非、真地那非等磷酸二酯酶-5抑制劑的新型類似物關注較少，缺乏相關的檢測方法研究。

本工作擬結合超聲提取和固相萃取技術，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)法同時檢測保健食品中10種磷酸二酯酶-5抑制劑，希望為相關保健食品的質量監(jiān)督和安全保障提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Acquity 超高效液相色譜儀，XEVO TQ 串聯(lián)質譜儀：美國Waters 公司產品，配有Masslynx4.1 工作站，Targetlyne數據分析軟件；HLB 固相萃取柱(500 g/6 L)：美國 Waters 公司產品；KQ6000V超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司產品；N-EVAP-112氮吹儀：美國Organomation公司產品；Milli-Q 超純水器：美國Millipore公司產品。

1.2 主要材料與試劑

豪莫西地那非、那莫西地那非、紅地那非、偽伐地那非、硫代艾地那非標準品：純度>95%，由中國食品藥品檢定研究院提供；西地那非、伐地那非標準品：純度>95%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司產品；他達那非、烏地那非、真地那非標準品：純度>95%，加拿大TLC Pharma Chem公司產品；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷、丙酮：均為色譜純，美國Fisher公司產品；實驗用水：由Milli-Q系統(tǒng)凈化，經0.22 μm濾膜過濾的去離子水。

1.3 標準溶液的配制

分別準確稱取適量的上述標準品，用甲醇溶解并定容，制得質量濃度均為1 000 mg/L的單標儲備液。準確移取各標準儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 mg/L的混合對照品儲備液。所有標準溶液均在4 ℃下保存。

1.4 樣品處理

稱取1.0 g樣品(片劑碾碎，膠囊去殼研細，液體直接稱取)，置于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，冷卻至室溫后，用甲醇定容，搖勻，靜置5 min。取1.0 mL上清液，置于10 mL容量瓶中，用水定容，搖勻備用。

分別用5 mL甲醇、5 mL去離子水活化、平衡固相萃取小柱，加入1.0 mL上述樣品溶液，用2 mL去離子水淋洗，棄去流出液。用4 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于氮吹管中，40 ℃氮吹至近干，再用甲醇定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，待UPLC-MS/MS測定。如果樣品含量過高，可根據具體情況進行稀釋。

1.5 實驗條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為甲醇溶液；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；梯度洗脫程序：0～7 min、40%～80%B，7～9 min、80%B，9～9.5 min、80%～40%B，9.5～11 min、40%B。

1.5.2 質譜條件 電噴霧電離正離子模式(ESI+)；多反應監(jiān)測(MRM)模式；毛細管電壓：3.0 kV；萃取電壓：5.0 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：650 L/h；錐孔氣流速：20 L/h。

2 結果與討論

2.1 質譜和色譜條件的選擇

采用蠕動泵以10 μL/min分別將10種磷酸二酯酶-5抑制劑的標準溶液單獨注入質譜的離子源中，測定其在正離子(ESI+)和負離子(ESI-)模式下的質譜信號強度。結果表明，在ESI-模式下，部分磷酸二酯酶-5抑制劑未能檢測到明顯的[M-H]-準分子離子峰；而在ESI+模式下，10種磷酸二酯酶-5抑制劑均可獲得較高豐度的[M+H]+準分子離子峰。確定母離子后，采用子離子掃描方式進行二級質譜分析，并對子離子進行優(yōu)化選擇，以確定定量離子和定性離子；然后對離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、錐孔氣流量等參數進行優(yōu)化，使目標物的離子化效率達到最佳。10種磷酸二酯酶-5抑制劑的質譜參數列于表1。

表1 10種磷酸二酯酶-5抑制劑的質譜參數

注：*代表定量離子

實驗分別考察了甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相的分離效果。結果表明，相對于乙腈體系，采用甲醇作為有機相可獲得更好的分離效果和儀器響應；在流動相中加入0.1%甲酸，有助于化合物的離子化，可使目標物的響應增大，靈敏度增強。因此，選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。另外，采用梯度淋洗可提高磷酸二酯酶-5抑制劑各組分在色譜柱中的分離效率。在以上優(yōu)化的條件下，獲得的10種磷酸二酯酶-5抑制劑的疊加總離子流圖示于圖1。

圖1 10種磷酸二酯酶-5抑制劑的總離子流色譜圖(50 μg/L)

2.2 提取條件的優(yōu)化

實驗分別考察了正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲醇作為提取溶劑時，各目標化合物的回收率，結果示于圖2?？梢?，在1 000 μg/g加標水平下，使用正己烷作為提取溶劑時，各化合物的回收率最低；而使用甲醇作為提取溶劑時，10種磷酸二酯酶-5抑制劑的回收率最佳。因此，選擇甲醇作為提取溶劑。

同時，進一步考察了提取時間對提取效率的影響。結果發(fā)現，在超聲0～30 min時，10種磷酸二酯酶-5抑制劑的回收率均逐漸提高；而在超聲30 min后，目標化合物的回收率沒有明顯提高。因此，確定超聲時間為30 min。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

與傳統(tǒng)的液液提取、液固提取相比，固相萃取技術可對目標物質進行選擇性吸附，在完成樣品富集的同時也使萃取液得到凈化，且可明顯提高靈敏度。

在1 000 μg/kg加標水平下，分別考察了ENVI-Carb柱、C18柱和HLB柱對各目標化合物回收率的影響，結果示于圖3。可見，ENVI-Carb柱對10種磷酸二酯酶-5抑制劑的回收率均不足50%；C18柱和HLB柱所得的回收率比較接近，均高于80%，但HLB柱的回收率相對更高。這可能是因為HLB柱屬于親水親酯的通用型固相萃取柱，與待測物有多個親水性和親酯性位點結合，過柱損失較少，因此回收率較高。

在1 000 μg/kg加標水平下，以甲醇為洗脫溶劑，比較了洗脫溶劑體積分別為2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL的洗脫效果。結果表明，隨著洗脫溶劑體積的增加，10種磷酸二酯酶-5抑制劑的回收率明顯提高；當洗脫溶劑體積大于4.0 mL時，各目標化合物的回收率趨于穩(wěn)定。因此，最終選擇4.0 mL甲醇溶液作為洗脫溶劑。

圖2 不同提取溶劑對10種磷酸二酯酶-5抑制劑回收率的影響

圖3 不同固相萃取柱對10種磷酸二酯酶-5抑制劑回收率的影響

2.4 基質效應與標準曲線

基質效應(matrix effects, ME)會對色譜系統(tǒng)的共洗脫化合物的電離程度產生影響：ME=1不產生基質效應，待測物電離不受干擾；ME>1為基質增強效應，待測物電離程度被增強；ME<1為基質抑制效應，待測物電離程度被減弱。本實驗采用式(1)對基質效應進行評估。

ME=Ais/Ai

(1)

式中，Ais為凈化后甲醇溶劑中添加待測物的系列標準溶液曲線的斜率；Ai為甲醇溶劑系列標準溶液曲線的斜率。

在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內，對10種磷酸二酯酶-5抑制劑系列混合標準工作溶液進行測定。結果表明，10種目標物質的基質效應均小于95.0%，存在基質抑制作用。為降低基質效應的影響，以空白樣品經前處理后得到的甲醇溶液為空白溶劑，配制系列標準溶液，采用外標法進行定量測定。

分別以10倍信噪比(S/N=10)和3倍信噪比(S/N=3)計算10種磷酸二酯酶-5抑制劑的方法定量限(LOQ)和檢出限(LOD)，結果列于表2。可見，10種磷酸二酯酶-5抑制劑在1.00～100 μg/L范圍內的線性關系良好，線性相關系數(R2)均大于0.993；方法的定量限(LOQ)為1.0 μg/kg，檢出限(LOD)為0.3 μg/kg。

表2 10種磷酸二酯酶-5抑制劑的線性方程、相關系數、檢出限、定量限和基質效應

2.5 加標回收率和精密度

向空白片劑樣品中分別添加不同濃度的標準溶液，進行加標回收率和精密度實驗。添加水平分別為100.0、200.0、1 000.0 μg/kg時，所得上機測試液理論濃度水平為4.0、8.0和80.0 μg/L，每個添加濃度平行測定3次，結果列于表3?？梢?，各待測物的平均回收率為85.6%～94.3%。

2.6 實際樣品分析

應用該方法對市售的20種具有抗疲勞、壯陽、補腎功能的保健食品(包括6種片劑、13種膠囊和1種保健酒)進行檢測，結果列于表4?？梢?，除片劑4、5外，其余樣品中均檢出西地那非，含量為1.3～210.8 mg/g；在片劑1中同時檢出伐地那非，含量為2.4 mg/g；在膠囊2中同時檢出他達那非，含量為1.2 mg/g。

表3 加標回收率和精密度檢測結果

表4 20種保健食品中磷酸二酯酶-5抑制劑的檢測結果

3 結論

本工作建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定保健食品中10種磷酸二酯酶-5抑制劑。樣品采用甲醇超聲萃取，HLB固相萃取柱凈化濃縮處理，UPLC-MS/MS檢測。結果表明，10種磷酸二酯酶-5抑制劑在1.0～100.0 μg/L范圍內線性關系良好，線性相關系數(R2)均大于0.993，方法定量限為1.0 μg/kg，檢出限為0.3 μg/kg；空白樣品在100.0、200.0和1 000.0 μg/kg添加水平下的回收率為85.6%～94.3%。應用該方法對市售的20種具有抗疲勞、壯陽、補腎功能的保健食品(6種片劑、13種膠囊和1種保健酒)進行檢測，除2種片劑外，其余樣品中均檢出西地那非，含量為1.3～210.8 mg/g；在其中1種片劑中同時檢出伐地那非，含量為2.4 mg/g；在1種膠囊中同時檢出他達那非，含量為1.2 mg/g。該方法操作簡單、檢出限低、準確度高，能夠滿足保健食品中10種磷酸二酯酶-5抑制劑的實際檢測要求，可為相關保健食品的質量監(jiān)督和安全保障提供技術支持。

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Simultaneous Determination of Ten Phosphodiesterase-5 Inhibitors in Health Foods by Ultra Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

GOU Xin-lei1, ZHAO Xin-ying1, GAO Xia1,2, ZHOU Ming-qiang1, LIU Wei-li1,2

(1.BeijingKeyLaboratoryofOrganicMaterialsTestingTechnology&QualityEvaluation,BeijingCentreforPhysicalandChemicalAnalysis,Beijing100089,China;2.KeyLaboratoryofAnalysisandTestingTechnology,BeijingAcademyofScienceandTechnology,Beijing100089,China)

A method was developed for simultaneous determination of ten phosphodiesterase-5 (PDE-5) inhibitors in health foods by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), such as vardenafil, acetildenafil, sildenafil, homosildenafil, udenafil, tadalafil, thioaildenafil, gendenafil, pseudovarnafil, norneosildenafil. The separation was performed using water containing 0.1% formic acid and methanol as mobile phases with gradient elution at a flow rate of 0.2 mL/min. Qualitative and quantitative analysis were achieved after the chromatographic separation on a Waters Acquity UPLC BEH C18 column (100 mm×2.1 mm×1.7 μm). The electrospray ionization (ESI) source in positive ion mode was used for analysis of ten phosphodiesterase-5 inhibitors in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The nuclear ratio of parent ion and daughter ion, cone voltage, collision voltage were investigated. The sample was ultrasonic-assisted treatment using the methanol as extraction solvent, and then purified by Waters Oasis HLB solid-phase extraction (SPE) column. The results indicate that the linear range of the method is from 1.0 μg/L to 100.0 μg/L withR2>0.993, which means the method has a good linearity. The limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of ten phosphodiesterase-5 inhibitors are 0.3-1.0 μg/kg and 1.0-2.5 μg/kg, respectively. The average recoveries of ten phosphodiesterase-5 inhibitors at three spiked levels of 100.0, 200.0 and 1 000.0 μg/kg are 85.6%-94.3%. The method was applied to analysis of the investigated compounds in twenty health foods. The results indicate that sildenafil are found in eighteen samples with the range of 1.3-210.8 mg/g, vardenafil and tadalafil are found in a tablet and a capsule, respectively. This method is accurate, simple, rapid and feasible for simultaneous determination of phosphodiesterase-5 inhibitors in health foods.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); phosphodiesterase-5 inhibitors (PDE-5); solid phase extraction; health foods

2015-12-02;

2016-01-27

北京市科學技術研究院創(chuàng)新工程Ⅲ-1項目(2015-178305)；北京市科學技術研究院萌芽計劃項目(2015-02)資助

勾新磊(1983—)，男(漢族)，天津人，助理研究員，從事色譜質譜分析。E-mail: 817411@163.com

劉偉麗(1980—)，女(漢族)，山東人，副研究員，從事材料化學成分分析及檢測。E-mail: liuweili@iccas.ac.cn

時間：2016-07-05；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1207.008.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0554-08

10.7538/zpxb.youxian.2016.0034