張景景 祁曉婷 張 超 朱莉敏 杜 康 胡志剛,3

(1 南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，南陽，473000； 2 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢，430065；3 湖北中醫(yī)藥大學(xué)詹亞華名醫(yī)工作室，武漢，430065)

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ITS2序列鑒定大薊、小薊藥材及其近緣混偽品

張景景1,2祁曉婷1,2張 超2朱莉敏1,2杜 康2胡志剛2,3

(1 南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，南陽，473000； 2 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢，430065；3 湖北中醫(yī)藥大學(xué)詹亞華名醫(yī)工作室，武漢，430065)

目的：應(yīng)用ITS2序列鑒別大薊、小薊藥材及其近緣混偽品，以保障臨床用藥準(zhǔn)確。方法：收集大薊、小薊藥材的基原物種薊和刺兒菜及其近緣混偽品，經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增、測序和序列拼接等步驟，獲得ITS2序列，結(jié)合GenBank載序列共14個物種54條序列，用MEGA6.0對序列進(jìn)行比對分析，計算種內(nèi)種間K2P(Kimura 2-Parameter)遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)鄰接(NJ)樹。結(jié)果：ITS2序列分析表明，薊和刺兒菜種內(nèi)變異位點數(shù)均遠(yuǎn)小于其與混偽品種間變異位點，以上2個物種種內(nèi)最大(平均)K2P距離均小于其與混偽品種間最小(平均)K2P距離；基于ITS2序列的系統(tǒng)NJ樹可以將薊和刺兒菜及其近緣混偽品很好地區(qū)分開，且各物種均單獨成支。結(jié)論：ITS2序列可以很好地鑒定大薊、小薊藥材及其近緣混偽品。

大薊；小薊；ITS2序列；鑒定；近緣混偽品

《中華人民共和國藥典》(2015年版)記載，大薊、小薊藥材分別為菊科薊屬(CirsiumMill.)植物薊CirsiumjaponicumFisch.ex DC.和刺兒菜Cirsiumsetosum(Willd.)MB.的干燥地上部分[1]，為我國常用涼血止血和祛瘀消腫藥，具有重要的藥用價值。薊屬植物在我國分布有50余種，其中10余種可作藥用[2]，其在植物形態(tài)和藥材性狀方面極為相似，難以區(qū)分。大薊和小薊藥材在我國藥用歷史悠久，始于《名醫(yī)別錄》。兩者雖然外形相似，成分相近，但臨床應(yīng)用各有側(cè)重，大薊解毒療瘡作用較強(qiáng)，而涼血止血作用弱，小薊涼血止血作用強(qiáng)，而解毒之力弱，故應(yīng)區(qū)別使用，不可混淆[3-4]。據(jù)本草考證記載，大薊藥材除來源于同屬植物外，還用了飛廉屬(CarduusL.)植物，且中藥小薊存在多來源情況[5-6]。目前全國各地藥材市場上流通的大薊和小薊藥材混淆現(xiàn)象時有發(fā)生，大薊藥材涉及菊科3屬13種植物[7-8]，同屬多種植物都充作小薊藥材使用，直接影響到臨床用藥的安全與準(zhǔn)確。由于傳統(tǒng)的四大鑒定方法主觀性強(qiáng)、穩(wěn)定性差、依賴專業(yè)鑒定人才，具有一定的局限性。因此，亟待建立一種快速準(zhǔn)確的鑒定方法來區(qū)分大薊、小薊藥材及其近緣混偽品。

DNA條形碼(DNA barcoding)是利用基因組中一段通用的標(biāo)準(zhǔn)短序列來實現(xiàn)物種鑒定的新方法，具有操作簡易、可重復(fù)性強(qiáng)、不受樣品形態(tài)特征限制等優(yōu)點，在生物分類學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用[9]。陳士林[10]等通過大樣本量系統(tǒng)研究，建立了以ITS2序列為主體、psbA-trnH序列為補(bǔ)充的藥用植物DNA條形碼鑒定體系，中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則于2010年已列入《中華人民共和國藥典》[11]。目前，以ITS2序列為代表的DNA條形碼技術(shù)在中藥材物種鑒定領(lǐng)域已經(jīng)得到了大量驗證[12-16]，并成功應(yīng)用于藥材市場真?zhèn)螜z測[17]，在中藥材物種基原鑒定方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究運用ITS2序列來鑒別大薊、小薊藥材及其近緣混偽品，為該屬植物的準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù)。

1 材料

本研究收集大薊、小薊藥材基原物種薊和刺兒菜及同屬混偽品共7個物種20份樣品，經(jīng)中國科學(xué)院武漢植物園趙子恩研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館。另從GenBank數(shù)據(jù)庫下載34條相關(guān)序列，所有序列經(jīng)查閱文獻(xiàn)確保其準(zhǔn)確可靠[18-24]。樣本信息及GenBank下載序列信息詳見表1。

表1 大薊、小薊藥材及其近緣混偽品樣本信息

2 方法

2.1 DNA提取 取干燥葉片經(jīng)75%乙醇擦拭表面后稱取30 mg，用球磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30 Hz)，采用改良的CTAB法提取實驗樣品總DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增及測序 ITS2通用引物：正向引物ITS2-P3：5′-YGACTCTCGGCAACGGATA-3′，反向引物ITS2-E4：5′-RGTTTCTTTCCTCCGCTTA-3′；反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL，總DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[11]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇條帶單一且清晰的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理 測序所得峰圖采用CondonCode Aligner V4.2.4(CondonCode Co.，USA)軟件進(jìn)行校對拼接，基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除5.8S端和28S端，獲得ITS2間隔區(qū)序列[25]。使用軟件MEGA(Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis)6.0進(jìn)行序列變異分析，計算種內(nèi)種間K2P(Kimura2-Parameter)遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)鄰接(Neighbor Joining，NJ)樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 序列變異分析 大薊藥材基原物種薊共獲得11條ITS2序列，序列比對后長度為227 bp，有3個單倍型，產(chǎn)生2個變異位點。見表2；小薊藥材基原物種刺兒菜共有14條ITS2序列，序列比對后長度為228 bp，未產(chǎn)生變異位點；薊屬10個物種共41條ITS2序列，序列比對后長度為231 bp，共產(chǎn)生40個變異位點；薊屬及其混偽品14個物種共54條序列，序列比對后長度為222 bp，共產(chǎn)生99個變異位點，遠(yuǎn)多于以上薊屬物種種間變異位點數(shù)(40個)。

表2 大薊藥材基原物種薊ITS2序列變異位點

注：括號中數(shù)字代表單倍型序列條數(shù)，“*”表示與第一行堿基相同。

3.2 遺傳距離分析 應(yīng)用MEGA6.0分析大薊、小薊藥材及其混偽品的種內(nèi)種間K2P距離，結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，大薊藥材最大K2P距離(0.009)小于其與混偽品的最小K2P距離(0.019)，平均K2P距離(0.003)小于其與混偽品的種間平均K2P距離(0.112)；小薊藥材最大K2P距離(0.000)小于其與混偽品的最小K2P距離(0.059)，平均K2P距離(0.000)小于其與混偽品的種間平均K2P距離(0.139),這說明K2P距離可很好地區(qū)分開大薊、小薊藥材及其混偽品。

表3 大薊、小薊藥材及其混偽品K2P距離

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的大薊、小薊藥材及其近緣混偽品NJ樹圖

注：Bootstrap 1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。

3.3 系統(tǒng)聚類分析 基于ITS2序列構(gòu)建的大薊、小薊藥材及其混偽品的系統(tǒng)NJ樹見圖1。從NJ樹可知，大薊藥材基原物種薊11條序列單獨聚為一小支，與煙管薊聚成的一小支共同聚在一大支上，支持率為76%，說明兩者的親緣關(guān)系很近；小薊藥材基原物種刺兒菜14條序列單獨聚為一支，支持率為100%；同時其余所有近緣混偽品也各自聚為一支，均能很好地區(qū)分開。

4 討論

近年來，中藥材市場快速發(fā)展，藥材摻偽現(xiàn)象屢有發(fā)生，為中醫(yī)用藥安全帶來隱患。大薊、小薊藥材因其混偽品主要來自于同科或同屬植物，極易產(chǎn)生藥材混用情況。中藥材的準(zhǔn)確鑒定直接影響到臨床用藥的有效性和安全性，故應(yīng)選擇準(zhǔn)確有效的方法以鑒定大薊和小薊藥材。由于傳統(tǒng)的鑒別方法鑒定困難，而DNA條形碼技術(shù)拋開了植物形態(tài)及藥材性狀上的假象，擺脫了傳統(tǒng)鑒定方法依賴專業(yè)鑒定人才的障礙，故本研究采用了該技術(shù)以鑒定大薊、小薊藥材及其近緣混偽品。

ITS2序列變異結(jié)果可知，大薊、小薊藥材種內(nèi)變異位點數(shù)(2個和0個)遠(yuǎn)小于其與混偽品的種間變異，薊屬物種種間變異位點數(shù)(40個)遠(yuǎn)小于該屬物種與其近緣混偽品種間變異位點數(shù)(99個)，此結(jié)果與物種分類學(xué)的結(jié)論相吻合。K2P距離分析結(jié)果表明，大薊和小薊藥材及其混偽品的種內(nèi)最大(平均)K2P距離均小于其各自與混偽品的種間最小(平均)K2P距離，說明K2P距離可將以上2種藥材及其混偽品很好地區(qū)分開?；贗TS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)NJ樹可知，大薊和小薊藥材均單獨成支，顯示良好的單系性，且其余各物種均單獨聚為一支。NJ樹結(jié)果表明，ITS2序列不僅能很好地區(qū)分大薊和小薊藥材，且對本研究涉及的相關(guān)近緣混偽品均具有較好的鑒定效果。

本研究結(jié)果表明，ITS2序列可以很好地鑒定大薊、小薊藥材及其近緣混偽品，為這2種藥材的臨床用藥安全提供了可行的物種基原鑒定技術(shù)，且從基因水平上為薊屬及近緣物種的分子鑒定分類系統(tǒng)研究及資源開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Identification of Cirsium japonicum，Cirsium setosum and Their Adulterants Based on ITS2 Sequence

Zhang Jingjing1,2，Qi Xiaoting1,2，Zhang Chao2,Zhu Limin1,2，Du Kang2,Hu Zhigang2,3

(1ZhangZhong-jingTraditionalChineseMedicineCollege,NanyangInstituteofTechnology,Nanyang473004,China；2CollegeofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China； 3FamousDoctor′sStudioofZhanYahua，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065,China)

Objective:To identify C.japonicum, C.setosum and their adulterants through ITS2 Sequence method to ensure clinical medication safety. Methods:DNA was extracted from C. japonicum and C.setosum, which were the original plant samples of Cirsii Japonici Herba and Cirsii Herba together with their adulterant and ITS2 sequences were obtained by PCR, sequencing, and sequence assembly. Totally, 54 sequences of 14 species were downloaded from the GenBank, using MEGA 6.0 to align all sequences, calculating the intraspecific and interspecific Kimura-2-Parameter (K2P) genetic distance and constructing NJ tree. Results:It suggested that the intraspecific variation locis between C.japonicum and C.setosum were much less than that between adulterants. The maximum (average) intraspecific distance of C. japonicum and C.setosum was lower than the minimum (average) interspecific distance of adulterants. Based on ITS2 sequences, this identification method of NJ Tree were effective and clearly distinguished C. japonicum and C.setosum from their adulterant. Also, all species showed obvious monophyly. Conclusion:The sequence of ITS2 identified the herbal materials of C.japonicum, C.setosum and their Adulterants.

Cirsium japonicum；Cirsium setosum；ITS2 sequence；Identification；Adulterants

湖北省科技支撐計劃(研發(fā)與示范類)(編號：2015BCA275)：茯苓等8種湖北優(yōu)勢中藥材DNA條形碼分子鑒定體系構(gòu)建，負(fù)責(zé)人：胡志剛

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.052