易 錦 辛隨成 王 鉦 吳致力 姜存旺 趙 鵬 陳 默 高 亮 王 虹 周小波

(1 北京按摩醫(yī)院治未病門診部，北京，100010； 2 北京中醫(yī)藥大學針推學院，北京，100010； 3 北京百奧易康科技有限公司，北京，100010)

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腰腹部推拿對壓力性尿失禁大鼠尿道組織NPY和PGP9.5表達的影響

易 錦1辛隨成2王 鉦1吳致力1姜存旺1趙 鵬1陳 默2高 亮2王 虹3周小波1

(1 北京按摩醫(yī)院治未病門診部，北京，100010； 2 北京中醫(yī)藥大學針推學院，北京，100010； 3 北京百奧易康科技有限公司，北京，100010)

目的：觀察壓力性尿失禁大鼠尿道組織神經(jīng)肽Y(NPY)及蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)表達的變化以及腰骶部推拿和腹部推拿對其產(chǎn)生的影響，為壓力性尿失禁的推拿手法治療提供一定的研究依據(jù)。方法：取SUI模型大鼠、正常大鼠、腹部推拿治療大鼠、腰骶部推拿治療大鼠的尿道標本并用免疫組化的方法檢測標本中NPY、PGP9.5的表達情況。結(jié)果：通過模擬產(chǎn)傷和絕經(jīng)可以獲得壓力性尿失禁的動物模型。免疫組化染色顯示，NPY和PGP9.5存在于尿道組織中，且模型對照組與空白對照組、腹部推拿組以及腰骶部推拿組相比較，模型組中NPY和PGP9.5染色強度顯著降低(P<0.05)。腹部推拿組與腰骶部推拿組NPY的陽性表達差異無統(tǒng)計學意義。腹部推拿組比腰骶部推拿組PGP9.5的陽性表達顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：腰腹部推拿對SUI的治療作用可能與其對神經(jīng)損傷的修復有關(guān)。體現(xiàn)了“從陰引陽，從陽引陰”理論。

推拿；壓力性尿失禁；尿道；神經(jīng)肽Y；蛋白基因產(chǎn)物9.5

Effect of Tuina on Abdomen or Lumbago on the Expression of NPY and PGP9.5 in Urethral Tissue of Rats with Stress Urinary Incontinence

壓力性尿失禁(Stress Urinary Incontinence，SUI)是指當噴嚏或咳嗽等腹壓增高時出現(xiàn)不自主的尿液自尿道外口溢出。根據(jù)朱蘭等[1]對我國7個城市婦女的流行病學調(diào)查，尿失禁的患病率為30.887%。本病嚴重損害并威脅婦女健康，影響廣大婦女正常社交活動、嚴重影響其生活質(zhì)量。女性SUI有多種發(fā)病機制，盆底神經(jīng)損傷可能是該病的發(fā)病機制之一，國內(nèi)外學者的研究目前多集中于盆底組織神經(jīng)傳導速度等電生理方面。目前有多項研究顯示NPY、PGP9.5的表達在壓力性尿失禁模型大鼠泌尿及生殖道存在不同程度減少[2-3]，從神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙對控尿組織影響來闡述本病可能的發(fā)生機制。

本病在中醫(yī)屬于“小便不禁”“遺尿”“膀胱咳”范疇，皆因氣虛固攝無力，氣化失司,不能約束尿道，尿液不能固守而致。其病位在膀胱，同時其病變又與肺、脾、腎有著密切關(guān)系。近年來大量的臨床研究報道運用電針“關(guān)元”“中極”“次髎”“八髎”“會陽”等穴治療SUI，取得了很好的療效。中醫(yī)推拿治療對于改善漏尿量、減少漏尿次數(shù)、提高患者的生活質(zhì)量已經(jīng)臨床研究得到證實，但缺乏相應的機制研究[4]。本研究是通過動物試驗，觀察推拿手法對SUI大鼠尿道組織NPY和PGP9.5表達的影響，為推拿治療本病的有效途徑提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雌性SD大鼠(SPF級)，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證編號：SCXK(京)2012-0001)，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，SPF級實驗室。實驗室溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)10～15次/h，12 h明/暗周期照明。動物自由飲水進食，實驗動物常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 動物分組 隨機分為4組，具體分組如下：1)腹部推拿組：正常雌性產(chǎn)后SD大鼠7只，體質(zhì)量(363.14±55.83)g；2)腰骶部推拿組：正常雌性產(chǎn)后SD大鼠9只，體質(zhì)量(346.44±34.15)g；3)模型對照組：正常雌性產(chǎn)后SD大鼠8只，體質(zhì)量(346.38±51.55)g；4)空白對照組：正常雌性SD未育大鼠10只，常規(guī)飼養(yǎng)至取材，體質(zhì)量(330.70±21.02)g。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=0.866，P=0.47，各組間大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.3 動物模型建立 除空白對照組外，其他3組均按以下步驟進行造模[5]：1)陰道球囊擴張：雌鼠產(chǎn)后1 d，將10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mg/kg)麻醉，并仰臥位固定。排空膀胱，將8Fr弗萊氏導尿管插入陰道，約2～3 cm，然后向氣囊注入2～2.5 mL生理鹽水，使其過度撐開陰道，并維持該狀態(tài)4 h，撤出導尿管，并局部消毒；2)雙側(cè)卵巢切除：球囊擴張術(shù)后2周，按無菌操作原則行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。首先大鼠予10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mg/kg)麻醉，然后從大鼠腰部(L3水平)后正中線行長約2 cm切口，進行組織剝離，向左側(cè)找到左側(cè)卵巢，結(jié)扎并切除縫合，然后向右側(cè)找到右側(cè)卵巢，結(jié)扎并切除縫合。分別縫合雙側(cè)腹壁及背部皮膚，常規(guī)消毒；3)術(shù)后處置：術(shù)后防止感染，以獸藥注射用青霉素鉀(重慶市先鋒動物藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2.5 g/400萬單位)，每次8萬IU腹腔注射，1次/d，共7 d，常規(guī)飼養(yǎng)1個月。

1.4 噴嚏試驗[6]是通過該試驗以檢測造模后大鼠在噴嚏時是否因腹壓增高而出現(xiàn)漏尿，來判斷建模是否成功。將少量胡椒粉撒至大鼠口鼻，因氣味刺激而噴嚏漏尿者，噴嚏試驗陽性。所有造模后大鼠噴嚏試驗均為陽性?？瞻讓φ战M大鼠噴嚏試驗均為陰性。

1.5 干預方法 1)腹部推拿組：大鼠俯臥位，操作者用左手護住避光方巾覆蓋大鼠頭部及背部，以右手中指豎直向上，置于大鼠下腹部，于大鼠關(guān)元穴區(qū)行震顫法3 min，用右手食指、中指、無名指順時針按揉下腹部7 min。2)腰骶部推拿組：大鼠俯臥位，操作者用左手護住避光方巾覆蓋大鼠頭部及軀干，右手食指、中指、無名指順時針按揉腰骶部5 min。棉簽或雙手食指尖點按雙側(cè)次髎穴2 min，以右手掌根在腰骶部行橫擦法3 min。隔日1次，10次為1個療程，共3個療程。3)模型對照組：普通飼料喂養(yǎng)，不干預，從籠中抓提大鼠，隔日1次，10次為1個療程，共3個療程。4)空白對照組：普通飼料喂養(yǎng)，不干預，從籠中抓提大鼠，隔日1次，10次為1個療程，共3個療程。

1.6 取材與切片制備 各組分別于推拿治療30次結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mg/kg)，腹主動脈取血處死。取尿道標本(約0.5 cm×0.5 cm)置于10%中性甲醛固定液中固定12 h。常規(guī)脫水，行石蠟包埋，將3 m厚的切片裱于涂有多聚賴氨酸的清潔玻片，置于80 ℃烤箱1 h，低溫保存?zhèn)溆?。切片及染色均由北京百奧易康科技有限公司協(xié)助。

1.7 免疫組織化學染色

1.7.1 主要試劑 兔抗NPY多克隆抗體、兔抗PGP9.5多克隆抗體(均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.7.2 染色步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟，放置于0.01 mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐中高火4 min，低火8 min修復抗原；滴加雙氧水溫浴10 min，用正常山羊血清封閉液孵育10 min，中和非特異性抗原；切片滴加1∶50一抗溶液溫浴1 h，4 ℃過夜；將切片用生物素標記山羊抗兔IgG以及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育各30 min；最后DAB染色2 min。切片中可見神經(jīng)遞質(zhì)的陽性區(qū)域顯色為棕黃至棕褐色。

1.8 圖像采集與分析 利用OLYMPUS-DP72顯微鏡數(shù)碼成像系統(tǒng)，分別在4×10、10×10、10×20、10×40倍光鏡下觀察尿道切片NPY及PGP9.5免疫組化染色，采集圖像。圖像觀察并采集后，對400倍視野下圖像使用Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件計算每個視野中的平均光密度=免疫組化染色陽性區(qū)域的累積光密度/照片面積。平均光密度越大，說明染色后的顯色強度越高，神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)纖維含量越多。

2 結(jié)果

通過觀察，在各組大鼠尿道黏膜上皮層以及固有層均有神經(jīng)纖維及小神經(jīng)束分布，NPY和PGP9.5均有不同程度表達，在各組切片中NPY和PGP9.5的免疫組化染色陽性區(qū)的顯色為棕黃至棕褐色。

2.1 模型對照組與空白對照組、腹部推拿組以及腰骶部推拿組相比較 NPY的染色較淡，分布較為稀疏，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腹部推拿組和腰骶部推拿組NPY的陽性表達較空白對照組和模型對照組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腹部推拿組與腰骶部推拿組NPY的陽性表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 尿道NPY模型對照組(400倍) 圖2 尿道NPY空白對照組(400倍)

圖3 尿道NPY腹部按摩組(400倍) 圖4 尿道NPY腰骶部按摩組(400倍)

2.2 模型對照組與空白對照組、腹部推拿組以及腰骶部推拿組相比較 PGP9.5表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腰骶部推拿組PGP9.5的陽性表達較腹部推拿組、空白對照組和模型對照組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腹部推拿組和空白對照組PGP9.5的陽性表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖5、圖6、圖7、圖8。見表1。

圖5 尿道PGP9.5模型對照組(400倍) 圖6 尿道PGP9.5空白對照組(400倍)

圖7 尿道PGP9.5腹部推拿組(400倍) 圖8 尿道PGP9.5腰骶部推拿組(400倍)

分組例數(shù)NPYPGP9.5空白對照組100.1070±0.01176*▲☆0.1596±0.05921*☆模型對照組80.0790±0.02921△▲☆0.0899±0.02357△▲☆腹部推拿組70.1525±0.01568△*0.1666±0.04544*☆腰骶部推拿組90.1670±0.02417△*0.2431±0.09369△*▲

注：與空白對照組相比，△P<0.05；與模型對照組相比，*P<0.05；與腹部推拿組相比，▲P<0.05；與腰骶部推拿組相比，☆P<0.05。

3 討論

SUI是由于腹內(nèi)壓升高然后下傳于膀胱所致，而膀胱本身并沒有收縮，因腹壓突然升高傳到膀胱而使膀胱內(nèi)壓升高，超過了膀胱頸和尿道括約肌的阻力而導致了漏尿，因而正常狀態(tài)下無遺尿，當腹壓突然增高時尿液自動流出[7]。關(guān)于SUI的解剖學發(fā)生機制目前尚不明確，尿道控制尿液的功能受損是大部分研究得出的統(tǒng)一結(jié)論[8]。支配控尿組織結(jié)構(gòu)的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙是2011版中國泌尿外科疾病診斷治療指南指出SUI的發(fā)病機制之一[9]。

本實驗主要是通過模擬難產(chǎn)以及去卵巢功能等女性SUI的發(fā)病機制，來觀察SUI大鼠模型的神經(jīng)功能損傷、局部的缺血性損傷以及雌激素水平的下降對大鼠尿道組織所產(chǎn)生的影響，同時觀察腹部和腰骶部推拿手法的干預對尿道組織變化的影響。通過免疫組化方法進行研究，了解神經(jīng)肽分布變化與SUI發(fā)生以及腰腹部推拿手法治療對其影響的關(guān)系。實驗結(jié)果表明，SUI模型空白組大鼠與正常對照相比，NPY和PGP9.5的表達明顯減少。通過腹部和腰骶部推拿手法的治療NPY和PGP9.5的表達有相對SUI模型空白組大鼠存在不同程度的增加。PGP9.5的表達在空白對照組和腹部推拿組間無明顯差異。

NPY肽能神經(jīng)纖維作為交感神經(jīng)纖維[10]，對血管有較強的收縮作用，它是一種血管生成因子，能促進血管的有絲分裂以及再生。NPY可以促進血管內(nèi)皮細胞增生，并且促進白細胞沿血管壁流動、向外游走，而使血管增生。NPY分布與血管關(guān)系密切，在血管周圍豐富存在，有研究認為其可能通過神經(jīng)調(diào)節(jié)影響泌尿生殖道的局部血流[2]。本研究提示NPY在尿道的移行上皮、血管周圍、肌纖維和結(jié)締組織均表達顯著。在血管周圍表達最多，其次是移行上皮、肌纖維和結(jié)締組織。與相關(guān)文獻報道一致[2]。PGP9.5是神經(jīng)元中含量最高的可溶性蛋白，具備顯示細小神經(jīng)的條件[11]，它是神經(jīng)元和神經(jīng)纖維標記物[12]。在SUI模型組中PGP9.5含量減少，可能與SUI時伴隨有尿道組織神經(jīng)損傷有關(guān)。而通過腹部推拿和腰骶部推拿治療的SUI大鼠尿道組織的NPY和PGP9.5表達均有不同程度的增多，提示推拿治療對SUI大鼠尿道組織有神經(jīng)修復的作用。尿道組織神經(jīng)分布變化，以及NPY和PGP9.5表達在模型組以及腰腹部推拿組的不同變化，說明它們在SUI的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸中可能起一定的作用。

推拿手法治療，尤其是腹部、腰骶部以及下肢部位相應經(jīng)絡(luò)穴位的手法對SUI漏尿量及漏尿次數(shù)均有明顯改善[4]。腹部和和腰骶部的手法治療很好地體現(xiàn)了“從陰引陽，從陽引陰”這一中醫(yī)的臨床治療思想。其原文出自《素問·陰陽應象大論》：“故善用針者，從陰引陽，從陽引陰，以左治右，以右治左，以我知彼，以表知里，以觀過與不及之理……”通過刺激機體的陽分或陰分，能夠調(diào)節(jié)相對一方經(jīng)脈的虛實盛衰，這是由于機體的陰陽氣血外內(nèi)上下相互貫通。SUI按照病位屬于腑病，腑屬于陽，因而在腹部關(guān)元穴行手法治療是以陰經(jīng)之穴治療陽病，“從陰引陽”。關(guān)元為任脈與足三陰經(jīng)交會穴，為三焦氣所出，在關(guān)元行震顫手法可培元固本、補益下焦；下腹部有氣海、關(guān)元、中極等穴，行揉法能能益臟腑元氣，固護元陽，增強膀胱氣化的功能。《針灸聚英·難經(jīng)》載“表陽里陰，調(diào)陰陽之氣者，如從陽引陰，從陰引陽，陽病治陰，陰病治陽之類也”表者，陽也；里者，陰也。SUI的腰骶部手法治療為“內(nèi)病外治”也當屬于“從陽引陰”，“治陽”的治法。腰骶部的揉法和橫擦法，主要可刺激八髎穴。八髎穴最早出自于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，分上髎、次髎、中髎、下髎，骶椎兩側(cè)各4個總共8個，因此稱為八髎穴[13]。王玲玲在臨床實踐體會中指出，臨床表現(xiàn)出尿便異常、生殖功能異常，的相關(guān)病癥選八髎穴具有很好的臨床療效。八髎穴位于骶部正對四對骶后孔，針刺八髎穴可以刺激到骶神經(jīng)干，能夠幫助協(xié)調(diào)逼尿肌和尿道內(nèi)括約肌使其通過節(jié)律性的收縮舒張運動完成正常排尿過程[14]。故本研究選用八髎穴作為主要治療穴。而使用點按次髎，是因為次髎為膀胱經(jīng)穴，可調(diào)理下焦，治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病。具有調(diào)整下焦氣機、培補元氣、振元陽、促氣化、恢復固攝之功；同時溫通經(jīng)脈，調(diào)暢氣血，從而使膀胱約束力增強，小便得控[15]。根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學解剖學以及排尿反射神經(jīng)通路，骶叢神經(jīng)是排尿中樞。在“次髎”穴下有支配膀胱等盆腔臟器的骶神經(jīng)，因而刺激該穴可以激活與排尿相關(guān)的傳入、傳出神經(jīng)，同時也可以將刺激通過傳入神經(jīng)元傳入到脊髓排尿中樞等高級中樞，以引起逼尿肌及膀胱內(nèi)括約肌的節(jié)律性收縮和舒張運動，促使其建立并完成排尿反射[16-17]。因而在腰骶部的揉法和擦法以及點按次髎可以通過刺激骶神經(jīng)，同樣可達到協(xié)調(diào)逼尿肌和尿道內(nèi)括約肌節(jié)律性收縮舒張的作用，使小便得控。

本研究中腰骶部推拿組PGP9.5的表達較腹部推拿組的增多，可能與該組手法對骶神經(jīng)的刺激有關(guān)。但是實驗未設(shè)立空白推拿治療組，未能明確推拿治療對于空白組和模型組大鼠是否有一定的差異。如果對一組大鼠同時實行腰骶部和腹部的推拿手法，結(jié)果會怎樣的差異性。另外實驗缺乏尿動力學指標觀察推拿對SUI的影響，尿動力學指標是驗證推拿有效性的金指標，同時也是下一步研究的主要方向。

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(2015-12-02收稿 責任編輯：張文婷)

Yi Jin1, Xin Suicheng2, Wang Zheng1, Wu Zhili1, Jiang Cunwang1, Zhao Peng1,

Chen Mo2, Gao Liang2, Wang Hong3, Zhou Xiaobo1

(1OutpatientDepartment,BeijingTuinaHospital,Beijing100010,China; 2SchoolofAcupunctureandMoxibustion,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100010,China; 3BeijingBaiAoTechnologyCo.,Ltd.,Beijing100010,China)

Objective:To observe changes of the expression of neuropeptide Y (NPY) and protein gene product 9.5 (PGP9.5) in urethral tissue of rats with stress urinary incontinence (SUI) and the effect of tuina on abdomen or lumbago, providing research evidence for tuina therapy in treating SUI. Methods:Samples at urethra were obtained from the rat models of SUI, normal rats, tuina on abdomen rats and tuina on lumbago rats and the expression levels of NPY and PGP9.5 were detected by immunohistochemistry. Results:The rat models of SUI were established create birth injury and menopause. Immunohistochemistry showed that NPY and PGP9.5 existed in urethral tissue, and the staining intensities of NPY and PGP9.5 in rat model group decreased significantly compared with normal control group, tuina on abdomen group and tuina on lumbago group (P<0.05). There was no significant difference of the expression of NPY between tuina on abdomen group and tuina on lumbago group. Compared with tuina on lumbago group, the expression of PGP9.5 in tuina on abdomen group decreased significantly (P<0.05). Conclusion:The therapeutic effects of tuina on abdomen or lumbago for SUI may have certain connection with repairing the neurogenic injury. This therapy reflects the theory of “inducing Yang from Yin and inducing Yin from Yang”.

Tuina; Stress urinary incontinence; Urethra; Neuropeptide Y; Protein gene product

北京市自然科學基金項目(編號：7143187)

R244.1；R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.045