柳言平 李福廣 郝光軍 洪 偉 熊裕民

(1 陜西省安康市中心醫(yī)院普外科,安康,725000; 2 陜西省榆林市第一醫(yī)院腫瘤科,榆林,719000)

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扶正消癌方對乳腺癌患者癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響

柳言平1李福廣1郝光軍2洪 偉1熊裕民1

(1 陜西省安康市中心醫(yī)院普外科,安康,725000; 2 陜西省榆林市第一醫(yī)院腫瘤科,榆林,719000)

目的:探討扶正消癌方對乳腺癌患者癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響,并研究凋亡分子機(jī)制。方法:66例乳腺癌患者隨機(jī)分為對照組30例和治療組36例,對照組患者接受化療藥物表阿霉素和環(huán)磷酰胺治療,治療組患者在對照組基礎(chǔ)上加用扶正消癌方,日1劑,連服9周;2組患者治療結(jié)束后接受手術(shù),術(shù)中留取瘤體組織。用免疫組化法檢測乳腺癌組織中Ki67、MMP2、Fas基因的表達(dá)水平,Western blotting分析凋亡分子Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:治療組乳腺癌組織Fas陽性率明顯高于對照組(P<0.05);治療組乳腺癌組織Ki67、MMP2的陽性表達(dá)率明顯低于對照組;Western blotting結(jié)果顯示治療組乳腺癌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)顯著多于對照組,而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯少于對照組,差異比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:扶正消癌方可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,這可能是扶正消癌方治療乳腺癌的作用機(jī)制。

扶正消癌方;乳腺癌;Ki67;MMP2;Fas;凋亡

乳腺癌為臨床常見的惡性腫瘤,發(fā)病率高,已轉(zhuǎn)移,目前主要治療方式包括外科手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療等[1-3]。中西醫(yī)結(jié)合治療乳腺癌療效顯著[4-5],中藥復(fù)方扶正消癌方聯(lián)合西藥治療中晚期乳腺癌患者療效滿意[6],且能改善乳腺癌術(shù)后內(nèi)分泌綜合征癥狀,提高患者生活質(zhì)量[7],但未見相關(guān)分子機(jī)制研究,為進(jìn)一步探討扶正消癌方治療乳腺癌的機(jī)制,本研究觀察扶正消癌方用藥后對乳腺癌組織中細(xì)胞核增殖抗原ki-67、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子MMP2及促細(xì)胞凋亡因子Fas表達(dá)的影響,還對其凋亡分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2015年6月安康市中心醫(yī)院普外科收治,經(jīng)組織活檢及病理學(xué)檢查診斷為乳腺癌的患者66例,均為女性,所有患者病理分期TNM分期≥Ⅱ期,生存期預(yù)計≥8個月,KPS評分≥60分,排除其他惡性腫瘤者,接受放療、藥物過敏者。治療組36例,年齡30～65歲,平均年齡(48.2±9.78)歲,TNM分期:Ⅱ期9例、Ⅲ期17例、Ⅳ期10例,病理分期:浸潤性導(dǎo)管型19例、浸潤性小葉型13例、腺癌型4例,KPS評分60～71分,平均(65.87±2.24)分。對照組30例,年齡31～67歲,平均年齡(49.1±8.72)歲,TNM分期:Ⅱ期7例、Ⅲ期14例、Ⅳ期9例,病理分期:浸潤性導(dǎo)管型16例、浸潤性小葉型11例、腺癌型3例,KPS評分61～70分,平均(64.36±2.58)分。2組間患者年齡、TNM分期、病理分期及KPS評分差異比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 治療方法 對照組患者僅接受化療藥物治療,聯(lián)用表阿霉素(輝瑞制藥無錫有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字X20000496)和環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字H32020857),表阿霉素以60 mg/m2,靜脈注射,1次/周;環(huán)磷酰胺以600 mg/m2,靜脈注射,1次/周,連用2周后停用1周。以3周為1個療程,共治療3個療程。治療組患者在對照組化療藥物基礎(chǔ)上加用扶正消癌方[7],藥方成分包括:熟地黃30 g、枸杞子30 g、白花蛇舌草30 g、太子參30 g、半枝蓮20 g、桑椹20 g、黃芪20 g、菟絲子15 g、茯苓15 g、女貞子15 g、白術(shù)15 g、莪術(shù)15 g、蒲公英15 g、貓爪草15 g、山藥15 g、三棱15 g、淫羊藿12 g,日1劑,常規(guī)水煎分2次服用,連續(xù)服用3個療程,共9周。2組患者治療結(jié)束后接受乳腺癌外科手術(shù)(乳房切除術(shù)或保乳術(shù)),手術(shù)時留取腫瘤標(biāo)本,所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋切片。

1.3 免疫組化及結(jié)果判定 采用免疫組化SP法二步操作,具體實(shí)驗步驟按照試劑說明書進(jìn)行,用PBS替代一抗作為陰性對照。采用雙盲法觀察陽性反應(yīng)。以細(xì)胞被染成黃色或棕色為陽性細(xì)胞,隨機(jī)選擇6個高倍視野,每個視野計數(shù)400個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比均值,當(dāng)此均值>10%即為陽性表達(dá)[8]。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司,鼠抗人MMP-2抗體購自上海太陽生物技術(shù)公司;兔抗人Ki67抗體、鼠抗人Fas抗體均購自武漢博士德生物工程公司。

1.4 Western blot檢測細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平 收集組織,充分裂解,離心收集上清,BCA法測定蛋白濃度,按每管30 μg分裝,加入上樣緩沖液5 μL沸水浴高溫變性,低溫保存,按實(shí)驗需要順序上樣、SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育一抗、二抗,顯影,定影,拍照保存,用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析。組織裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、Bax與Bcl-2一抗購自南京碧云天生物技術(shù)公司,β-actin抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購自北京博奧森生物技術(shù)公司。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 相關(guān)統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 20.0軟件,組間比較計數(shù)資料采用χ2檢驗,計量資料采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測乳腺癌組織中Ki67、MMP2和Fas的表達(dá) 結(jié)果如表1所示,治療組患者乳腺癌組織Ki67陽性率41.7%,顯著低于對照組MMP2陽性率70.0%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.298,P=0.021);MMP2陽性率38.9%顯著低于對照組陽性率76.7%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.481,P<0.01);但是患者乳腺癌組織中Fas陽性率61.1%則顯著高于對照組陽性率33.3%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.053,P=0.024)。乳腺癌組織中Ki67、MMP2和Fas的免疫組化蛋白表達(dá)情況。見圖1、圖2、圖3。

表1 Ki67、MMP2及Fas抗原檢測陽性結(jié)果的比較

注：*P<0.05,與對照組比較。

圖1 免疫組化法檢測Ki67的細(xì)胞核表達(dá)

圖2 免疫組化法檢測MMP2的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)

2.2 Western blotting分析Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示,與對照組比較,治療組患者癌組織細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)顯著上升,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降,差異比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.325,P<0.05)。見圖4。

圖3 免疫組化法檢測Fas的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)

圖4 Western blotting檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺癌發(fā)生與邪毒滯留、正氣不足相關(guān),癌毒蟄伏、正氣虧虛及血瘀內(nèi)阻導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,因此中醫(yī)治療強(qiáng)調(diào)扶正以祛邪、祛邪不傷正,調(diào)整機(jī)體陰陽、氣血、臟腑功能的平衡,達(dá)到“養(yǎng)正積自消”之目的[7,9-10]。扶正消癌方以桑椹、熟地黃、菟絲子、女貞子滋補(bǔ)肝腎之精血;三棱、貓爪草、莪術(shù)活血散結(jié)消腫;黃芪、山藥、茯苓、太子參、白術(shù)益氣健脾,五臟得和,精血自生;半枝蓮、白花蛇舌草、蒲公英清熱解余毒;淫羊藿補(bǔ)腎助陽[7]。研究表明扶正消癌方臨床治療肺癌、乳腺癌、胃癌具有一定的療效[6,11-12]。

Ki-67是增殖細(xì)胞核抗原,是可靠而全面的反應(yīng)細(xì)胞群體增殖活性的客觀指標(biāo),基質(zhì)金屬蛋白酶2(Maix Metalloproteinases2,MMP2)可降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)新生血管的形成,促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,Fas是細(xì)胞凋亡的信號分子,以二聚體與Caspase-8結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體,最后終激活Caspase-3而導(dǎo)致表達(dá)Fas的靶細(xì)胞凋亡。研究表明,薏苡仁提取物康萊特通過協(xié)同新輔助化療下調(diào)乳腺癌患者Survivin和Ki-67表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞,提高腫瘤緩解率,結(jié)果說明Ki-67在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[7,13]。本研究在化療基礎(chǔ)上聯(lián)用扶正消癌方治療乳腺癌患者,與對照組比較可顯著下調(diào)細(xì)胞增殖抗原Ki67的陽性表達(dá)率,表明扶正消癌方抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖。薯蕷丸方顆粒劑協(xié)助化療可降低Ki-67的陽性表達(dá)率,有利于降低乳腺癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[13],與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示,扶正消癌方可顯著上調(diào)治療組促凋亡因子Fas的陽性表達(dá)率,Fas為促凋亡基因,治療后Fas在乳腺癌組織表達(dá)增多,凋亡促進(jìn)蛋白bax表達(dá)上調(diào),而凋亡抑制因子bcl-2表達(dá)下調(diào),吳蕾等研究表明曲普瑞林導(dǎo)致的bcl-2/bax比值減小促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[14],為本研究結(jié)論提供一定支持。研究證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)[3],本文還研究了扶正消癌方治療乳腺癌與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子MMP2的表達(dá)關(guān)系,結(jié)果表明,MMP2在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率也明顯小于對照組,說明扶正消癌方可能對乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移具有一定的影響[15]。

綜上所述,扶正消癌方通過抑制乳腺癌組織Ki67、MMP2基因表達(dá)降低人乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力,還通過上調(diào)Fas、Bax基因表達(dá)及下調(diào)Bcl-2表達(dá)促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的凋亡,這可能是扶正消癌方治療乳腺癌的作用機(jī)制,但還需要通過大量的試驗進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

[1]宣雯霞,郭泰,王伏生.乳腺癌的治療進(jìn)展[J].中國藥物與臨床,2015,15(2):203-205.

[2]孫放,郭淳,孫行云,等.乳腺癌的中醫(yī)藥治療進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,17(4):87-89.

[3]趙建新,林增茂,段學(xué)寧,等.新輔助化療對乳腺癌組織因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和蛋白酶激活受體-2的表達(dá)及療效的影響[J].中國癌癥雜志,2013,23(3):195-199.

[4]范洪橋,劉麗芳,胡金輝,等.中醫(yī)藥治療乳腺癌臨床與實(shí)驗研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(4):178-181.

[5]彭博,賀蓉,徐啟華,等.筋骨草提取物抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移與MMPs和TIMPs表達(dá)的關(guān)系研究[J].中國中藥雜志,2011,36(24):3511-3514.

[6]王萍,蔣益蘭.扶正消癌方干預(yù)治療晚期乳腺癌36例臨床觀察[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,14(5):23,39.

[7]孫獻(xiàn)甫,劉慧,賀亞寧,等.扶正消癌方治療乳腺癌術(shù)后內(nèi)分泌綜合征50例[J].中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志,2014,20(2):192-195.

[8]馬寅芙,楊廣民,郭玉琳,等.胃癌中幽門螺桿菌與凋亡相關(guān)蛋白p53、BcL-2、Fas表達(dá)相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2009,30(21):2590-2592.

[9]司徒紅林,陳前軍,朱華宇.林毅教授辨治乳腺癌經(jīng)驗介紹[J].新中醫(yī),2008,40(7):5-6.

[10]徐海虹,童林根,周旭東.綜合治療提高乳腺癌術(shù)后患者生活質(zhì)量的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥,2013,8(11):1674-1676.

[11]侯安繼,吳昊,張紅衛(wèi),等.扶正消癌方聯(lián)合針刺防治老年肺癌患者化療后肝腎功能損傷的臨床觀察[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(10):33-35.[12]侯安繼,顧魏峰,孫行家,等.扶正消癌Ⅰ號方結(jié)合最佳支持療法治療晚期胃癌近期療效觀察[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(5):51-52.

[13]林金棠,謝甦,李麗紅,等.薯蕷丸對化療期間乳腺癌患者減毒增效作用的臨床研究[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(10):1540-1542.

[14]吳蕾,張瑞紅,申彩云,等.曲普瑞林對子宮肌瘤及內(nèi)膜組織ER、PR、bcl-2、bax的影響[J].武警醫(yī)學(xué),2011,22(1):45-47.

[15]方瑜,楊柳青,王松林,等.扶正抗癌方對H22移植瘤小鼠凋亡和端粒酶表達(dá)影響的實(shí)驗研究[J].陜西中醫(yī),2013,34(10):1423-1425.

(2016-05-24收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Fuzheng Xiaoai Decoction on Cell Proliferation, Invasion and Apoptosis in Tissues of Breast Cancer

Liu Yanping1, Li Fuguang1, Hao Guangjun2,Hong Wei1, Xiong Yumin1

(1DepartmentofGeneralSurgery,CentralHospitalofAnkangCityofShaanxiProvince,Ankang725000,China；2Departmentofoncology,YulinFirstHospital,ShaanxiProvince，Yulin719000，China)

Objective:To investigate the effects of Fuzheng Xiaoai Decoction on cell proliferation, invasion and apoptosis in tissues of breast cancer, and its relevant apoptotic molecular mechanisms. Methods:A total of 66 cases of breast cancer were randomly divided into the control group (30 cases) and the treatment group (36 cases). The control group received chemotherapy drugs doxorubicin and cyclophosphamide. On the basis of the control group, the treatment group were treated with Fuzheng Xiaoai Decoction once a day for nine weeks. Ki67, MMP2 and Fas protein expression levels were determined by immunohistochemical technology. The protein levels of Bax, Bcl-2 were detected by western blotting. Results:The Fas expressions of breast cancer tissues were significantly higher in treatment group than the control group (P<0.05). The Ki67, MMP2 expressions in breast cancer tissues were lower in treatment group compared with the control group (P<0.05). Results of western blotting indicated that the protein level of Bax in breast cancer tissues of the treatment group increased significantly compared with the control group, but the Bcl-2 expression level decreased significantly, the differences were statistically significant (bothP<0.05). Conclusion:Fuzheng Xiaoai Decoction can inhibit the proliferation and invasion breast cancer cells, promote the apoptosis of breast cancer cells, which may be the molecular mechanism of Fuzheng Xiaoai Decoction in the treatment of breast cancer.

Fuzheng Xiaoai Decoction; Breast cancer; Ki67; MMP2; Fas; Apoptosis

陜西省科技計劃項目(編號:2013KJXX-78)

R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.014