葛怡情， 曹玲珍

(江西師范大學生命科學學院，鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室，南昌330000)

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基于RNA-seq的黃蜻頭部轉(zhuǎn)錄組測序與分析

葛怡情， 曹玲珍*

(江西師范大學生命科學學院，鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室，南昌330000)

利用RNA-seq技術(shù)對黃蜻Pantalaflavescens(Fabricius)頭部細胞的全部轉(zhuǎn)錄本進行測序、功能分析。提取黃蜻頭部總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，在Illumina平臺上進行測序，經(jīng)拼接、組裝、聚類后獲得全部unigenes，并將所得的unigenes與數(shù)據(jù)庫比對，對其進行功能注釋和分類?？偣驳玫?7 039 040條堿基序列，包含了7 102 895 040個堿基序列信息，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的44.05%。將測序結(jié)果進行組裝，組裝所得到的unigenes為34 406 502條，對所得到的unigenes進行不同的數(shù)據(jù)庫注釋，共有44 499條unigenes被注釋到數(shù)據(jù)庫，其中有大量unigenes與代謝過程、結(jié)合活性、催化活性和細胞進程有關(guān)。與COG數(shù)據(jù)庫比對，根據(jù)功能可以分為26類，其中信號轉(zhuǎn)導機制最為豐富。與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，線粒體基因在所測樣本中最為豐富，與KEGG ORTHOLOGY注釋后，代謝活動基因最為豐富。這些與線粒體和代謝有關(guān)的基因與我們研究中與黃蜻遷飛基因相關(guān)，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

黃蜻；轉(zhuǎn)錄組；測序；基因分析；功能注釋

蜻蜓目Odonata是一類比較古老的昆蟲，是天敵昆蟲和藥用、食用資源昆蟲，也是水體污染程度的指示昆蟲之一(張大治,楊貴軍，2006)。黃蜻Pantalaavescens(Fabricius)隸屬于蜻蜓目蜻科Libellulidae黃蜻屬Pantala，在世界各地的熱帶和溫帶都有發(fā)現(xiàn)。黃蜻有一個極短的稚蟲期(34～43 d；Suhlingetal.，2004)，可以在熱帶輻合帶降雨產(chǎn)生的臨時水池中繁殖。成蟲被認為可以隨著熱帶輻合帶氣流進行廣泛的遷飛(Hobsonetal.，2012)。在一些分布區(qū)內(nèi)，黃蜻屬于季節(jié)性分布，其在遷飛或者擴散中常聚成大群(Fengetal.，2006)。蜻蜓目主要取食蚊、蠅、葉蟬、小型蛾子、蝴蝶、虻等各種小型昆蟲。一只普通蜻蜓1 h可吃掉40只蒼蠅或840只蚊子。蜻蜓稚蟲生活在水中，捕食蚊子幼蟲等水生動物，其對遷飛害蟲的生物防治起到了一定的作用，有利于農(nóng)業(yè)、園林的害蟲防治。以蜻蜓為材料認識遷飛在蜻蜓生活史中的作用，還能有效地對害蟲進行控制和預防。

迄今為止，國外關(guān)于蜻蜓目昆蟲多樣性研究主要從外部形態(tài)學標記和分子標記展開。關(guān)于遷飛技術(shù)的研究發(fā)展方面，人們常利用昆蟲的趨光性，用誘蟲燈對遷飛昆蟲進行誘捕(劉立春，1994)。20世紀30—40年代，英國昆蟲學家借助風箏對白天飛行的昆蟲進行了取樣研究(Hardy & Milne，1938); Chapman等(2004)利用氣艇在英國南部對遷飛昆蟲群落進行了取樣分析; 20世紀70年代，全國褐飛虱Nilaparvatalugens科研協(xié)作組在全國設(shè)置了40多個高山捕蟲網(wǎng)(海拔>2 000 m)，開展了褐飛虱和白背飛虱Sogatellafurcifera的研究(鄧望喜，1981)；近年來，通過用永久性標記在翅上寫號碼做標記，容易獲得樣品(van Noordwijk，1978；Watanabeetal.，2004)。Wikelski等(2006)在巴拿馬的巴羅科羅拉多島上，通過在碧偉蜓Anaxparthenopejulius腹部安裝1個300 mg信號發(fā)射器來研究其南遷現(xiàn)象，但由于碧偉蜒的中途停留、遷飛的不確定性以及標記個體的死亡，該方法難度較大，效果不是很理想。微衛(wèi)星DNA廣泛分布于原核和真核生物中，具有重復性好、共顯性遺傳、遺傳多態(tài)性高、操作簡單快速及結(jié)果可靠等優(yōu)點，使其在物種的遺傳和進化中被廣泛使用(Freelandetal.，2003；Matthews, 2007; Matthewsetal.，2007；Wellenreutheretal.，2011)。穩(wěn)定的同位素分析被一致認為是研究脊椎動物和非脊椎動物種群遷飛的一種比較好的手段(Hobsonetal.，2010，2012)?！稗D(zhuǎn)錄組”最先由Velculescu等(1997)提出，為細胞功能的詮釋提供了更高的價值信息(吳瓊等，2010)，比傳統(tǒng)基因挖掘更具優(yōu)勢(張楠等，2013)。本研究將Illumina Hiseq 4000高通量測序技術(shù)應用到黃蜻轉(zhuǎn)錄組研究，將測序得到的大量數(shù)據(jù)進行拼接與組裝，結(jié)合生物信息學方法對所獲得的unigenes進行基因功能注釋、功能分類、代謝途徑分析等，從功能基因組水平上研究黃蜻遷飛過程中重要基因的表達，使人們能夠了解其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用，有利于物種保護和生物多樣性的形成，同時能夠?qū)σ恍┖οx進行有效控制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2015年7月于江西省南昌市郊捕捉黃蜻20只。本研究中所采用的都是成熟個體；雄性個體居多(前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)遷飛黃蜻的性比接近1∶1，雌雄個體對本研究影響不大)。取其頭部，冷凍于液氮中。

1.2 提取總RNA

從黃蜻頭部提取總RNA，利用Nanodrop 2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1)取50～100 mg黃蜻頭部，于液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀后倒入離心管中，加入2 mL Trizol震蕩30 s，靜置30 s，加入1/5體積的氯仿，震蕩30 s，靜置1 min。12 000 r·min-1，4 ℃離心5 min。

2)小心地吸取上層液相，并避免接觸到下層液相，加入1/2體積的異丙醇，震蕩30 s，靜置1 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心5 min。

3)棄上清液，加入1 mL 75%乙醇，翻轉(zhuǎn)洗滌沉淀RNA， 12 000 r·min-1，4 ℃離心5 min。

4)將沉淀的樣品置于超凈工作臺上晾干，加入適量的DEPC H2O溶解(60 ℃促溶10 min)。

1.3 文庫構(gòu)建與測序分析

取黃蜻頭部總RNA用微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入破碎緩沖液，將獲得的mRNA隨機斷裂成200 bp左右的小片段，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用隨機引物，以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，隨后進行第二鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，再進行純化回收、修復粘性末端、于cDNA的3’末端加上堿基‘A’并連接接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增構(gòu)建文庫。制備好的文庫用Illumina Hiseq 4000進行測序。原始測序結(jié)果去除制備文庫時產(chǎn)生的接頭序列、兩端低質(zhì)量序列和低度復雜序列。利用Trinity(http：//trinityrnaseq.sourceforge.net)對樣品數(shù)據(jù)進行組裝，獲得RNA-seq高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)后，將所有測序讀段通過從頭組裝生成重疊群(contig)和單一序列(singleton)。

1.4 功能注釋與序列分析

將拼接所得核苷酸序列，使用BlastX分別與NR、String、SwissProt、KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對獲得相應的注釋信息，共有44 499條unigenes被注釋到數(shù)據(jù)庫。

美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫)包含SwissProt和PRF(Protein Research Foundation)等蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的功能注釋信息，得到unigene的GO條目，然后對所有的unigenes進行GO(Gene Ontology；http：//www.geneo-ntology.org)功能分類統(tǒng)計與GO數(shù)據(jù)庫比對，對應到GO的生物過程(biological process)、生物組分(cellular component)和分子功能(molecular function)。這3個大分支下面又分很多小層級(level)，level級別數(shù)字越大，功能越細致。通過與NR數(shù)據(jù)庫比對，查看本物種轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種相似的程度，以及同源序列的功能信息。然后對unigenes分別進行蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(Cluster of Orthologous Groups，COG；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)功能分類，與COG數(shù)據(jù)庫比對可以進行功能注釋、歸類以及對相關(guān)蛋白進化分析。與東京基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；http：//www.genome.jp/kegg/)代謝途徑分析，通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，獲得轉(zhuǎn)錄本對應的KO編號，根據(jù)KO編號可以獲得某轉(zhuǎn)錄本中一些基因的具體生物學通路，注釋后，可根據(jù)它們參與的KEGG代謝通路進行歸類。通過上述數(shù)據(jù)庫對基因注釋，找到與黃蜻遷飛運動過程相關(guān)基因的表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果與數(shù)據(jù)組裝

采用Illumina Hiseq 4000技術(shù)對黃蜻頭部轉(zhuǎn)錄組進行測序，共獲得45 908 046個片段，其中包含了6 694 354 464個核苷酸序列信息，堿基錯誤率為0.013 9%，G、C百分含量為44.05%，Q20為97.34%，Q30為91.64%。數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)量和質(zhì)量都較高。對所得的reads進行轉(zhuǎn)錄組組裝，得到轉(zhuǎn)錄本47 188條，unigenes 37 868條，其中，轉(zhuǎn)錄本長度為1～600 bp的有25 701條，占總體的54.47%；長度為1 001～5 000 bp的有14 480條，占30.69%；長度>10 000 bp僅占0.17%;unigenes長度為1～600 bp的有23 457條，占總體的61.94%，長度為1 001～5 000 bp的有9 385條，占24.78%，長度>10 000 bp的僅占0.09%(表1)。

2.2 unigenes的功能注釋結(jié)果

2.2.1 NR數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果 黃蜻的unigenes比對到最多的近緣物種有內(nèi)華達古白蟻Zootermopsis

表1 黃蜻頭部轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄本和unigene數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量統(tǒng)計

圖1 物種分類

nevadensis(4 613)，其次是赤擬谷盜Triboliumcastaneum(831)(圖1)。在區(qū)間0內(nèi)，基因數(shù)量最多(7 503)，匹配結(jié)果也最高，而在(1e-10，1e-5]區(qū)間內(nèi)，基因數(shù)量最少(919);相似度在80%～100%區(qū)間內(nèi)的基因數(shù)量最多(6 281)，而在20%～40%區(qū)間內(nèi)的基因數(shù)量最少(35)(圖2)。

2.2.2 GO注釋結(jié)果統(tǒng)計 黃蜻的unigenes分為生物過程、生物組分和分子功能3個本體，二級分支共60個功能組，注釋到生物過程的unigenes最多。在生物過程中，注釋最多的是細胞的進程(cellular process)和代謝過程(metabolic process)，而激素分泌(hormone secretion)、生物相(biological phase)、細胞殺傷(cell killing)等幾乎沒有。

生物過程二級分支中，與細胞的進程相關(guān)最多，有3 292條與其對應，與細胞組織生物合成(cellularcomponent organization or biogenesis)相關(guān)最少，有564條與其相對應；三級分支中，與有機物質(zhì)代謝過程(organic substance metabolic process)相關(guān)最多，有2 518條與其相對應，與建立定位(establishment of localization)相關(guān)最少，有858條與其相對應；四級分支中，與大分子代謝過程(macromolecule metabolic process)相關(guān)最多，有1 764條與其相對應，而與有機物生物合成過程(organic substance biosynthetic process)相關(guān)最少，有1 021條與其相對應。

圖2 比對結(jié)果e-value分布相似度分布

生物組分二級分支中，與細胞(cell)和細胞的部分(cell part)相關(guān)最多，有1 901條，胞外區(qū)域部分(extracellular region part)相關(guān)最少，有174條；三級分支中，與細胞的部分相關(guān)最多，有1 901條，與細胞器部分(organelle part)相關(guān)最少，有640條；四級分支中，與細胞內(nèi)的(intracellular)相關(guān)最多，有1 716條，與細胞內(nèi)的非膜結(jié)合細胞器(intracellular non-membrane-bounded organelle)相關(guān)最少，有616條。

分子功能二級分支中，與結(jié)合(binding)相關(guān)最多，有2 782條，與蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(protein binding transenption factor activity)相關(guān)最少，有38條；三級分支中，與有機環(huán)狀化合物結(jié)合(organic cyclic compound binding)和雜環(huán)化合物的結(jié)合(heterocyclic compound binding)相關(guān)最多，有1 741條，與跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(transmembrane transporter activity)相關(guān)最少，有329條；四級分支中，與核苷酸結(jié)合(nucleotide binding)和核苷磷酸結(jié)合(nucleotide phosphate binding)相關(guān)最多，有957條，與特定底物的跨膜轉(zhuǎn)運活動(substrate-specific transmembrane transporter activity)相關(guān)最少，有286條(圖3)。

2.2.3 ORF預測 利用Trinity軟件提供的ORF流程對組裝得到的轉(zhuǎn)錄本進行基因預測，得到大量的蛋白質(zhì)與核苷酸序列，找出其在組裝結(jié)果中的相對位置，并對轉(zhuǎn)錄本進行蛋白質(zhì)家族預測，有26 561條unigenes預測到了蛋白質(zhì)，有44 262條轉(zhuǎn)錄本預測到了蛋白質(zhì)。

2.2.4 COG注釋結(jié)果 黃蜻的unigenes根據(jù)其功能可分為26類，其中信號轉(zhuǎn)導(signal transduction mechanisms)最豐富，其次為轉(zhuǎn)錄(transcription)、一般功能預測(general function prediction only)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶(posttranslational modification， protein turnover， chaperones)(圖4)。

2.2.5 KEGG通路注釋結(jié)果 根據(jù)序列比對分析，獲得轉(zhuǎn)錄本參與的具體生物學通路，其中注釋數(shù)量較多的有核糖體(ribosome)(222條)、癌癥通路(pathways in cancer)(183條)、HTLV-I感染(HTLV-I infection)(179條)、舞蹈病(Huntinngton’s disease)(177條)、P13K-Akt信號通路(P13K-Akt signaling pathway)(176條)。根據(jù)它們在KEGG中的代謝通路進行分類，共有A(代謝)、B(遺傳信息處理)、C(環(huán)境信息處理)，D(細胞過程)和E(有機系統(tǒng))五大類。在這五大類中代謝類最多，而代謝中又以全球概覽圖(global and overview maps)含量最高，共有1 067個(圖5)。

3 討論

RNA-seq技術(shù)結(jié)合了轉(zhuǎn)錄組測序建庫的實驗方法與數(shù)字基因表達譜(digital gene expression profiling，DCE)的信息分析手段，具有定量準、可重復性高、檢測范圍寬等特點(朱立強，李慶花，2016)。Illumina高通量測序的數(shù)據(jù)量大、速度快、成本低、效率高(賈新平等，2014)。黃蜻運動能力強，飛行速度快，其調(diào)控過程與代謝速度有關(guān)，需要消耗大量的能量，而能量主要產(chǎn)生于線粒體。線粒體一般集中在代謝活躍的區(qū)域，此外，線粒體也較為集中地分布在有較多氧化反應底物的區(qū)域(牛京京等，2011)。

圖4 COG分類統(tǒng)計

圖5 KEGG 注釋統(tǒng)計

將拼接所得的核苷酸序列用BlastX分別與NR、String、SwissProt、KEGG、Pfam數(shù)據(jù)庫進行比對獲得相應的注釋信息，共有44 499條unigenes被注釋到數(shù)據(jù)庫，其中注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫9 190條(20.65%)，注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫7 418條(16.67%)，注釋到String數(shù)據(jù)庫5 071條(11.40%)，注釋到SwissProt數(shù)據(jù)庫9 783條(21.98%)，注釋到NR數(shù)據(jù)庫13 037條(29.30%)。

在我們的研究中，將核苷酸與數(shù)據(jù)庫進行比對，有許多unigenes無匹配，此部分包括以下3種類型：(1)unigenes 序列片段長度過短，不能獲得比對結(jié)果(張少平等，2016)；(2)基因注釋信息不足，近年很少有人利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對蜻蜓進行測序分析，生物信息庫還不完善，造成部分序列無法獲得相應的注釋結(jié)果；(3)可能有新的基因產(chǎn)生，在某些惡劣環(huán)境中，生物為了生存會有一些適應性的改變，相應的基因也會發(fā)生變化，在數(shù)據(jù)庫中沒有。

通過與各個數(shù)據(jù)庫注釋后獲得的結(jié)果比對，找到了大量與運動有關(guān)的酶系，如微管蛋白、驅(qū)動蛋白、中間纖維、動力蛋白、肌鈣蛋白、原肌球蛋白；與代謝有關(guān)的酶系，如ATP合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶、丙酮酸激酶、果糖-1，6-二磷酸激酶、己糖激酶等。但也有大量的基因沒有與數(shù)據(jù)庫對上，許多與運動代謝有關(guān)的酶系沒有得到注釋，這其間也可能有一些新出現(xiàn)的基因是數(shù)據(jù)庫里所沒有的。

動力蛋白與驅(qū)動蛋白是運動必不可少的蛋白，此次基因查詢結(jié)果發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白(28組)、動力蛋白(27組)、原肌球蛋白(37組)，有利于我們找出與運動相關(guān)基因。ATP合成酶主要參與線粒體內(nèi)的氧化磷酸化過程。細胞色素c氧化亞基為生物氧化過程中的電子傳遞體，在酶的作用下，對組織的氧化還原有迅速的酶促作用，細胞色素c還可以在通透性增強的情況下，進入線粒體，增強細胞氧化，提高氧的利用。本研究獲得19組ATP合成酶，12組細胞色素c氧化亞基和5組泛醌氧化還原酶。黃蜻的運動伴隨著能量的大幅度消耗和產(chǎn)生，而線粒體內(nèi)有關(guān)反應和酶也正是需要了解的，因此本研究結(jié)果有利于查找黃蜻所特有的與運動相關(guān)的基因，為園林害蟲和農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供基礎(chǔ)。

綜上所述，通過RNA-seq方法進行轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的與運動代謝有關(guān)的基因，為以后的相關(guān)研究提供了豐富的資源。

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1.1 一般資料 2015年—2017年應用LISS治療復雜股骨遠端骨折，男13例，女5例；年齡22～68歲，平均43歲；按AO分型：33C2型11例、33C3型7例；致傷原因：車禍傷9例，墜落傷5例，壓傷4例；閉合性骨折15例，開放性骨折3例均為Gustilo Ⅱ型。手術(shù)距受傷時間5～16 d，平均7.5 d；均采用髕骨旁外側(cè)切口，需輔助髕骨旁內(nèi)側(cè)切口3例，單純應用LISS接骨板固定骨折14例，應用LISS接骨板結(jié)合空心螺釘或松質(zhì)骨復位固定骨折4例。

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陜西省鳥類新紀錄——黑翅鳶

黑翅鳶隸屬于隼形目Falconiformes鷹科Accipitridae黑翅鳶屬。文獻曾記錄中國僅有南方亞種E.c.vociferus罕見于中國南部云南、廣東、廣西和香港(約翰·馬敬能等，2000)。但近年來該物種出現(xiàn)了向北擴散的趨勢，分布區(qū)逐步擴大。如在福建(唐兆和等，1993；林清賢等，2004)、山東黃河三角洲(單凱等，2005)、天津(王鳳琴，陳建中，2006)、北京(聞丞等，2013)、河南(卜艷珍等，2014)和四川(王疆評等，2016)等地相繼作為地區(qū)新紀錄發(fā)現(xiàn)該物種。目前已知的分布地還包括除上述地區(qū)之外的江西、江蘇、上海、浙江、澳門、海南和臺灣(鄭光美，2011)。此次黑翅鳶在西安渭河的發(fā)現(xiàn)尚屬首次，應為陜西省鳥類新紀錄。因為個體只有1只，作者判斷其為迷鳥的可能性大。該物種分布區(qū)向北甚至西北地區(qū)擴散是否與近年來的氣候變化有關(guān)有待進一步研究。

圖1 黑翅鳶Elanus caeruleus(王勇 攝)

圖2 黑翅鳶Elanus caeruleus(廖小青 攝)

廖小鳳1, 廖小青1, 于曉平2*

(1. 陜西省觀鳥協(xié)會，西安710082; 2. 陜西師范大學生命科學學院，西安710119)

*通信作者, E-mail:yuxp64@163.com

Transcriptome Analysis ofPantalaflavescens(Fabricius) Based on RNA-seq

GE Yiqing， CAO Lingzhen*

(School of Life Sciences， Jiangxi Normal University， Nangchang 330000， China)

The total transcripts ofPantalaflavescens(Fabricius) were obtained by RNA-seq followed by functional analysis. The head total RNA ofP.flavescens(Fabricius) was extracted and then sequenced by Illumina platform. A total of 47 039 040 reads containing 7 102 895 040 bp were generated. There were 34 406 502 unigenes with GC content of 44.05% afterdenovoassembly. All the unigenes were annotated based on different databases， and 44 499 unigenes were annotated. In this study， all the assembled unigenes could be broadly divided into biological processes， cellular components and molecular function categories of 60 branches by gene ontology， including metabolic process， binding， catalytic activity and cellular process. Unigenes were further annotated based on COG category， which could be grouped into 26 functional categories. The results of KEGG prediction suggested that mitochondrial genes were the most abundant in the tested samples. And after KEGG ORTHOLOGY annotation， the most abundant genes were metabolic-related. The genes of mitochondria and metabolism were related with the migration mechanism ofP.flavescens(Fabricius).

Pantalaflavescens(Fabricius); transcriptome; sequencing; gene analysis; function annotation

2016-08-23 接受日期：2016-10-08

鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室(江西師范大學)開放基金項目(PK2013001)； 江西省教育廳課題“基于線粒體分子標記的江西黃蜻遺傳多樣性研究”項目(7357)

葛怡情(1994—)， 本科生， 從事動物學研究， E-mail：1757883815@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：clzclz1011@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160227

Q963

A

1000-7083(2016)06-0852-08