鄧鋒, 劉延勝, 龐正平, 平正明, 王建國*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌330045；2.常州市武進區(qū)白蟻防治所，江蘇常州213100；3.廣東省昆蟲研究所，廣州510260)

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東亞地區(qū)棲北散白蟻的遺傳分化研究

鄧鋒1, 劉延勝1, 龐正平2, 平正明3, 王建國1*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌330045；2.常州市武進區(qū)白蟻防治所，江蘇常州213100；3.廣東省昆蟲研究所，廣州510260)

本研究通過收集中國的棲北散白蟻Reticulitermessperatus(Kolbe)種類，進行線粒體DNA 細胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因擴增測序，將所得序列與日本和韓國的R.speratusCOⅡ序列進行比較分析，進而比較東亞地區(qū)R.speratus種類的親緣關(guān)系和遷徙路線。結(jié)果顯示中國與韓國、中國與日本分別存在相同的R.speratus亞種，且R.speratus在東亞地區(qū)的最有可能遷徙路線是先從中國遷徙到日本，再從日本傳播到韓國。

棲北散白蟻；COⅡ；傳播路線；親緣關(guān)系

白蟻是生態(tài)系統(tǒng)中重要的分解者，影響土壤的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及有機質(zhì)的分布和質(zhì)量，在有機質(zhì)循環(huán)中占有非常重要的地位。但同時，白蟻對木構(gòu)件和建筑的破壞，也使其成為一種經(jīng)濟害蟲。

散白蟻屬Reticulitermes由Holmgren于1913年定名，屬內(nèi)共138種，主要分布在東洋區(qū)、古北區(qū)、新北區(qū)等(程冬保，楊兆芬，2014)，中國擁有其中大部分的種類，共計111種(黃復(fù)生等，2000)。其中，棲北散白蟻Reticulitermessperatus(Kolbe)最早在1885年由Kolbe定名，模式產(chǎn)地為日本，后因?qū)俚淖儎?，由Snyder在1949年確定為現(xiàn)在的名字，并沿用至今(黃復(fù)生等，2000)。因其地理分布和分類地位，R.speratus在亞洲散白蟻種類中顯得尤為有趣。在東亞地區(qū)，R.speratus同時分布在中國、日本和韓國。在日本，Morimoto(1968)報道了R.speratus的5個亞種，分別為R.s.speratus、R.s.leptolabralis、R.s.kyushuensis、R.s.okinawanus和R.s.yaeyamanus。但Takematsu和Yamaoka(1999)等認為R.s.okinawanus和R.s.yaeyamanus可用碳氫化合物的方法明顯區(qū)分開來，但其他3個亞種R.s.speratus、R.s.leptolabralis、R.s.kyushuensis都不能通過形態(tài)和化學(xué)的方法明顯區(qū)分開。因此，目前認為日本只存在3個R.speratus亞種。經(jīng)過Kim等(2012)和Park等(2013)的調(diào)查研究，確定韓國只有R.s.kyushuensis1個亞種。在中國，R.speratus并沒有進行亞種的細分。另外，R.speratus為中國分布最北的1個白蟻物種，分布在遼寧省丹東市(黃復(fù)生等，2000)。李小榮(2012)報道了R.speratus在吉林省公主嶺市的分布，從而改寫了中國白蟻分布的北界。

R.speratus為東亞廣布種，因而其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遷徙路線備受關(guān)注(Parketal.，2006；Kimetal.，2012)。Park等(2006)通過分子系統(tǒng)發(fā)育分析、古地理學(xué)假設(shè)等方法，分析了韓、日兩國R.speratus的種類以及傳播途徑，提到其傳播可能和中國有關(guān)，并提出R.speratus是從中國遷徙到日本，然后再從日本遷徙到韓國的假設(shè)。但由于缺乏中國地區(qū)的R.speratus種類，其關(guān)于R.speratus遷徙路線的假設(shè)可能存在問題。因此，本研究通過加入中國地區(qū)的R.speratus種類，對R.speratus進行線粒體細胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因擴增，并將所得序列與日、韓已提交NCBI的序列進行比較，對中、日、韓三國R.speratus的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行分析，探討東亞地區(qū)棲北散白蟻的起源和擴散路線，并對其進化機制進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗標(biāo)本信息

所用標(biāo)本采集于中國遼寧省和山東省的6個市，每個市采集3～5個巢群，其中公主嶺市標(biāo)本為大連市白蟻防治辦公室李小榮女士贈送。所有標(biāo)本分2份保存，1份常溫保存于75%乙醇中用于形態(tài)鑒定，1份-20 ℃保存于100%乙醇中用于DNA提取。實驗隨機選擇每個市的1～2個地理種群進行DNA提取，標(biāo)本詳細信息見表1。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

利用NIKON SMZ1500顯微觀測設(shè)備對標(biāo)本進行拍照和測量，將獲得的測量數(shù)據(jù)與《中國動物志 昆蟲綱 第十七卷 等翅目》(黃復(fù)生等，2000)中的原始數(shù)據(jù)進行比較分析，獲得初步的形態(tài)鑒定結(jié)果，然后將標(biāo)本和結(jié)果送白蟻分類專家平正明老師復(fù)核，最終確定種名。

1.3 基因組DNA提取和檢測

采用組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取散白蟻基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 mtDNA序列擴增和測序

為了驗證形態(tài)鑒定的結(jié)果，并進行后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析，我們對線粒體DNA COⅡ基因進行了部分測序。COⅡ基因片段廣泛用于歐洲的白蟻研究(Marini & Mantovani，2002；Luchettietal.，2007；Leniaudetal.，2010)。

COⅡ基因片段擴增引物序列為：TL-J-3037(5’-ATGGCAGATTAGTGCAATGG-3’)，TK-N-3785(5’-G-TTTTAAGAGACCAGTACTTG-3’)(Xingetal.，2001)。

PCR程序為：94 ℃5 min，45 ℃1 min，65 ℃3 min,35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于-20 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用DNAStar對所得序列進行拼接和編輯，去除兩端引物；然后用MEGA 6.0對序列進行比對，將比對后的序列用DAMBE進行堿基替換飽和性檢測，再將適合建樹的序列進行分析，計算其堿基組成、核苷酸差異、平均堿基含量等。之后用MEGA基于Kimura 2-parameter模型計算遺傳距離，并用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)在Kimura 2-parameter模型下構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對系統(tǒng)發(fā)育樹各進化支進行Bootstrap 1 000次的置信度檢驗，比較不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析散白蟻的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。為了明確中國R.speratus種類的分類地位，下載了GenBank中韓國和日本提交的R.speratus序列用于比較分析(表1)。

表1 散白蟻標(biāo)本信息

圖1 棲北散白蟻兵蟻頭部和前胸背板的特征

Fig.1 Characteristics of the soldiers’ pronotum and the head ofReticulitermessperatus

a.頭部正面, b.頭部背面, c.頭部側(cè)面, d.前胸背板。

a.Head, front view, b.Head, dorsal view, c.Head, lateral view, d.pronotum.

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)數(shù)據(jù)比對，本研究所用標(biāo)本為R.speratus種類。圖1為兵蟻頭部和前胸背板的特征。

2.2R.speratus的DNA序列分析

對樣本進行測序分析后，選取長度為655 bp的序列與日、韓兩國已提交GenBank的序列一起進行系統(tǒng)發(fā)育分析，其中保守位點581個，變異位點74個，簡約信息位點62個。A、T、C、G的平均比例分別為39.6%、23.6%、23.3%、13.5%；G+C平均含量為37%，A+T平均含量為63%。個體間的遺傳距離詳見表2。

序列通過ML和NJ構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所得結(jié)果見圖2和圖3。結(jié)果顯示日本南部和韓國的R.speratus種類聚為一支，日本北部的R.speratus種類單獨聚為一支，中國的R.speratus種類在兩支均有分布。

3 討論

3.1R.speratus在東亞地區(qū)的分布及親緣關(guān)系

R.speratus種類為亞洲廣布種，中國的遼寧、河北、天津和北京等地都有分布(黃復(fù)生等，2000)，日本主要分布在吐噶喇海峽以北(Yasudaetal.，2000)，而韓國幾乎全國都有分布(Kimetal.，2012；Parketal.，2013)。但由于地理生態(tài)環(huán)境的差異以及擴散因素的影響，各地分布的亞種并不相同。日本R.speratus有3個亞種，其分布因地理而異，北部以R.s.speratus為主，南部因吐噶喇海峽的存在，在吐噶喇海峽以南無R.speratus的分布，可能是吐噶喇海峽阻礙了R.speratus的擴散。韓國的R.speratus種類與日本的R.s.kyushuensis相同。中國的R.speratus并未細分到亞種，但結(jié)合遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹，對中國的R.speratus進行以下2種分析：第一種分析，從圖2和圖3中可以看到中國的R.speratus分布在3個大支，可以認為有3個亞種的存在，即中國大部分R.speratus種類與韓國和日本南部的種類聚在一起，構(gòu)成第一個亞種，第二個亞種是與日本北部R.speratus種類聚在一起的2個種群，第三個亞種是從GenBank中下載的中國R.speratus種類，它們單獨成一支存在；第二種分析，從遺傳距離來看，前面2個亞種與前一種分析一致，但在GenBank中下載的中國R.speratus序列構(gòu)成的第三個亞種有待討論，因為這個亞種與前2個亞種的種內(nèi)遺傳距離大于前2個亞種與其他種類的種間遺傳距離，理論上可以認為是2個不同物種，即中國的R.speratus只存在2個亞種，但Austin等(2002)在比較分析北美和歐洲的散白蟻時，發(fā)現(xiàn)有的種類因為起源的不同，確實存在種內(nèi)遺傳距離差異很大的情況。綜上可知,中國的R.speratus種類至少存在2個亞種，且在日本和韓國都有相同種類分布。

3.2R.speratus在東亞地區(qū)的傳播路線

R.speratus在中、日、韓三國都有分布，因而其遷徙路線備受關(guān)注。通過分析3個國家R.speratus的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并結(jié)合古地理學(xué)假設(shè),我們對R.speratus在東亞地區(qū)的傳播路線進行了2個假設(shè)：第一個假設(shè)，在更新世時期，東海陸架盆地可能是在水面之上的，R.speratus通過東海陸架盆地從中國東部遷徙到日本的主要島嶼，然后分布到日本的北部和南部，日本種群再擴散到韓國，形成現(xiàn)在的韓國R.speratus種群(Parketal.，2006)。R.speratus從中國遷徙到日本后，由于第四紀冰川的反復(fù)出現(xiàn)，使得遷徙到日本北方的種群經(jīng)歷了多次的寒冷氣候，因此，出現(xiàn)了形態(tài)變化和遺傳變異來適應(yīng)環(huán)境的變化。在韓國，R.speratus的分布緯度與日本南部R.speratus的差不多，均在35°N左右，因而其與日本南部種類遺傳差異較小。但是，在進化樹中可以看到中國青島和大連的R.speratus與日本北部的遺傳變異也較小，我們推測可能是與青島和大連的地理位置有關(guān)，青島和大連是中國重要的港口，與外國貿(mào)易往來非常多，可能是日本北部的R.speratus通過貿(mào)易往來被重新人為地帶回了中國。

表2 散白蟻個體間的遺傳距離

圖2 基于線粒體COⅡ序列構(gòu)建的棲北散白蟻最大似然樹

▲ 本研究中作者采集的中國標(biāo)本; 下圖同。

▲ The specimens were collected in China; the same below.

另外一種假設(shè)是，中國R.speratus本身就存在幾個亞種，幾個亞種都遷徙到日本，然后幾個亞種在日本廣泛分布，并擴散到韓國。但是，在第四紀冰川時期，部分種類出現(xiàn)了形態(tài)變化和遺傳變異來適應(yīng)環(huán)境的變化，最終形成了現(xiàn)在的分布情況。如果能增加日本、韓國等地更多的地理種群標(biāo)本，再針對某個基因在不同地理種群中的表達差異進行分析，可能會得到更好的結(jié)果。

圖3 基于線粒體COⅡ序列構(gòu)建的棲北散白蟻鄰接樹

Fig.3 Neighbor-joining tree ofReticulitermessperatusbased on mitochondrial COⅡ sequences

致謝：感謝青島白蟻防治研究所李萬紅、煙臺白蟻防治辦公室陳同石、大連白蟻防治辦公室宋寶臣和李小榮對北方標(biāo)本采集給予的極大支持和幫助。

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Genetic Differentiation ofReticulitermessperatusin East Asia

DENG Feng1, LIU Yansheng1, PANG Zhengping2, PING Zhengming3, WANG Jianguo1*

(1.School of Agricultural Sciences, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;2.Changzhou Wujing Institute of Termites Control, Changzhou, Jiangsu Province 213100, China;3.Guangdong Entomological Institute, Guangzhou 510260, China)

In this study,Reticulitermessperatus(Kolbe) were collected in China and a portion of the mitochondrial gene encoding for the cytochrome oxidase subunit Ⅱ (COⅡ) was sequenced.In order to compare the phylogenetic relationship and migration route ofR.speratusin east Asia, GenBank data of Korean populations, southern and northern Japanese populations were used.According to the comparative analysis of the sequences, it was suggested that the sameR.speratussubspecies existed in China and Japan, China and Korea, respectively, andR.speratusmigrated into the Japanese main islands from east China, and Korean populations diverged from Japanese populations.

Reticulitermessperatus; COⅡ; migration route; phylogenetic relationship

2015-10-12 接受日期：2016-01-30 基金項目：江西省研究生創(chuàng)新專項資金項目(YC2014-S180); 國家自然科學(xué)基金項目(31160380，30960223); 江蘇省常州市武進區(qū)白蟻所橫向項目(WJ 20130418)

鄧鋒(1991—), 男, 碩士研究生, 主要從事白蟻系統(tǒng)發(fā)育研究, E-mail：dfeng0827@163.com

*通信作者Corresponding author，E-mail：ppdjxau@gmail.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20150313

Q951; Q969

A

1000-7083(2016)03-0361-07