唐道彬，張 凱，呂長文，謝德斌，傅體華，王季春

?

基于EST-SSR標記甘薯連鎖圖譜構(gòu)建及淀粉性狀的QTL定位

唐道彬1,2，張 凱2，呂長文2，謝德斌2，傅體華1，王季春2

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都611130；2西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/西南大學(xué)南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心/重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心，重慶400716）

【目的】利用分子標記技術(shù)，構(gòu)建甘薯遺傳連鎖圖譜，并分析甘薯淀粉含量性狀的QTL位點，為高淀粉含量甘薯種質(zhì)資源利用及甘薯分子標記輔助育種提供理論和實踐依據(jù)?！痉椒ā恳愿叩矸酆科贩N萬薯5號為母本、低淀粉含量品種商丘52-7為父本建立雜交群體，利用EST-SSR標記，采用“雙假測交”策略和運用JoinMap4.0軟件，分別構(gòu)建雙親遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合F1（2012、2013年）群體表型數(shù)據(jù)采用區(qū)間作圖法對淀粉含量性狀進行QTL檢測。【結(jié)果】利用1 679對EST-SSR引物篩選出的1 045對多態(tài)性引物檢測F1群體的標記基因型，獲得了1 418個標記位點。分別對上述獲得的父母本多態(tài)性標記進行遺傳連鎖分析，在LOD≥5.0情況下，分別構(gòu)建父母本的連鎖遺傳圖譜。采用642個標記的多態(tài)性位點構(gòu)建母本連鎖群74個，其中，215個標記位點位于連鎖圖譜上，占標記多態(tài)性位點總數(shù)的33.5%。每個連鎖群上有2—11個標記位點，連鎖群長度在0.6—129.4 cM,圖譜總長為3 826.07 cM，標記間平均距離為17.80 cM。屬于父本的776個標記位點構(gòu)建了80個連鎖群，共有252個標記位點構(gòu)建在連鎖圖譜上，占標記總數(shù)的32.5%，每個連鎖群上有2—24個標記位點，連鎖群長度在2.0—156.8 cM，圖譜總長為3 955.0 cM，標記間平均距離為15.7 cM。以F1雜交群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合2012年、2013年2個環(huán)境，利用QTL作圖軟件MapQTL5.0，采用區(qū)間作圖法進行分析，共檢測到17個與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL，貢獻率在8.4%—40.5%。其中、、3個QTL位于母本萬薯5號連鎖群上，且在2年環(huán)境中均可檢測到；14個QTL位于父本商丘52-7連鎖群上，、、、、、、、是在2個環(huán)境均檢測到的QTL。、、、、、是只在1個環(huán)境檢測到的QTL。標記GDAAS0603在雙親中和2個環(huán)境中均同時檢測到，這些環(huán)境穩(wěn)定QTL可用于分子標記輔助選擇。【結(jié)論】分別構(gòu)建了親本EST-SSR分子標記連鎖群圖譜，豐富了構(gòu)建甘薯圖譜的標記類型，定位了17個與淀粉含量相關(guān)的QTL位點。

甘薯；淀粉含量；EST-SSR；連鎖圖譜；數(shù)量性狀

0 引言

【研究意義】甘薯（（L.）Lam.）是世界上第七大主要作物，每年產(chǎn)量達到1.04×109t，其中95%的產(chǎn)量來自于發(fā)展中國家，是生物質(zhì)能源發(fā)展的優(yōu)勢作物[1]。因此，高淀粉含量成為甘薯育種和生物技術(shù)研究所關(guān)注的重要品質(zhì)性狀。對甘薯具有重要價值的性狀進行數(shù)量性狀位點（QTL）定位，利用與目標性狀QTL緊密連鎖的遺傳標記，對其進行跟蹤選擇，并分析這些數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律，將優(yōu)良的基因逐步累積到栽培品種中，培育具有突破性的高淀粉甘薯新品種，是今后甘薯育種研究的必然趨勢?！厩叭搜芯窟M展】甘薯是復(fù)雜的同源異源六倍體雜交種（2n=6x=90），染色體數(shù)目多且不穩(wěn)定，雜合性很強，遺傳背景復(fù)雜。自交不孕以及種內(nèi)、種間存在廣泛的雜交不親和。近緣野生種利用困難、遺傳資源匱乏、又以無性繁殖為主，遺傳分析和改良非常困難，極大地制約了甘薯生產(chǎn)的發(fā)展[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，“雙假測交”理論和分子標記技術(shù)的應(yīng)用，推動了多倍體植物遺傳作圖的迅速發(fā)展。1994年Hemmat等[3]提出了“雙假測交”（double pseudo-testcross）的構(gòu)想。1994年Grattapaglia等[4]采用“雙假測交”作圖方法，利用RAPD技術(shù)，分別構(gòu)建了桉樹雙親的遺傳圖譜。1995年Lodhi等[5]采用“雙假測交”理論，分別構(gòu)建了葡萄雙親的分子遺傳圖譜。“雙假測交”作圖理論和joinMap軟件開發(fā)[6]同樣為遺傳背景復(fù)雜、自交不親和、親本高度雜合的多倍體植物甘薯遺傳圖譜的構(gòu)建提供了方法。多種分子標記被應(yīng)用于甘薯遺傳多樣性的研究和遺傳圖譜構(gòu)建。1995年Arthur等[7]用RAPD標記在甘薯品種“Jewel”無性系材料中，檢測出變異在7.1%—35.7%。1996年Arthur等[8]對不同來源的芽產(chǎn)生的變異進行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)分生組織進行無性繁殖更能保持基因型的一致。1997年Thompson等[9]采用RAPD標記分析，構(gòu)建了具有134個標記的甘薯遺傳圖譜。1997年Ukoskit等[10]利用196個RAPD標記構(gòu)建了一個低密度遺傳圖譜。2003年Kriegner等[11]利用甘薯品種“Tanzania×Bikilamaliya”的雜交F1作圖群體，構(gòu)建了AFLP標記的遺傳連鎖圖，2個親本分別產(chǎn)生90和80個連鎖群，其中632個標記在Tanzania圖譜上，435個標記在Bikilamaliya圖譜上，連鎖圖譜長度分別為3 655.6 cM和3 011.5 cM，標記位點間平均圖距為5.8 cM。2004年Lander等[12]在前者的基礎(chǔ)上將100—200個SSR共顯性標記整合上去，這一作圖群體目前大約有500株。2008年Cervantes- Flores等[13]利用AFLP技術(shù)，以甘薯品種Tanzania×Beauregard雜交后代240個分離群體為材料，構(gòu)建了雙親分別為86個和90個連鎖群的遺傳圖譜。其中947個標記構(gòu)建在親本Tanzania的連鎖圖譜上，總圖距為5 792 cM，平均距離4.5 cM。726個標記構(gòu)建在親本Beauregard的連鎖圖譜上，總圖距為5 276 cM，平均距離4.8 cM。2010年Li等[14]利用Luoxushu 8×Zhengshu 20的雜交F1群體，分別構(gòu)建了含有81個（Luoxushu 8）連鎖群（包含473個SRAP標記）的連鎖圖譜和66個（Zhengshu 20）連鎖群（包含328個SRAP標記）的連鎖圖譜。2013年Zhao等[15]利用AFLP和SSR技術(shù)，分別構(gòu)建了雙親高密度遺傳圖譜。徐781連鎖圖譜包括90個連鎖群，總圖距為8 151.7 cM，平均距離為4.2 cM。徐薯18連鎖圖譜總圖距為8 184.5 cM，平均距離為3.9 cM。隨著國內(nèi)外關(guān)于甘薯遺傳圖譜的成功構(gòu)建，甘薯重要性狀的QTL定位也開展了大量研究。2005年吳潔等[16]利用構(gòu)建的甘薯SRAP連鎖圖。檢測到1個淀粉含量QTL，紅旗4號的加性效應(yīng)增加淀粉6.37%，解釋表型變異的20.1%。2010年蒲志剛等[17]利用AFLP構(gòu)建甘薯連鎖圖，在綿粉1號遺傳圖的第2連鎖群上檢測到E1M722可作為淀粉的臨近QTL。2010年李愛賢等[16]利用SRAP標記構(gòu)建了2個親本的高密度分子連鎖圖譜。同時檢測到了1個主效位點，加性效應(yīng)為-0.73，解釋表型變異的7.70%。2010年唐茜等[18]用BB3-26和潮薯1號的SRAP遺傳連鎖圖譜，檢測到1個淀粉含量QTL，BB3-26的加性效應(yīng)增加淀粉含量2.12%，解釋表型變異的21.3%。2011年Cervantes- Flores等[19]利用AFLP標記技術(shù)，定位了13個干物質(zhì)含量、12個淀粉含量和8個胡蘿卜素含量的QTL。2014年YU等[20]定位了8個甘薯淀粉含量的QTL。【本研究切入點】目前，國內(nèi)外甘薯遺傳圖譜大多以AFLP、SRAP、RAPD和少量SSR分子標記技術(shù)構(gòu)建完成，尚未有完全采用EST-SSR標記構(gòu)建甘薯遺傳連鎖圖譜和淀粉含量QTL定位的研究報道。采用通用性高、易于檢測、能直接定位功能基因的EST-SSR標記可以促進在甘薯新性狀基因的發(fā)現(xiàn)和構(gòu)建甘薯高密度遺傳圖譜中發(fā)揮重要作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用甘薯EST-SSR標記分別構(gòu)建甘薯親本連鎖遺傳圖譜，并在2年的環(huán)境中對甘薯淀粉含量進行QTL定位，為重要農(nóng)藝性狀進行精確分析和分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

田間試驗于2012—2013年在重慶市北碚區(qū)歇馬基地（北緯29°45′28″、東經(jīng)106°22′56″，海拔250 m）和重慶市槽上基地（北緯29°40′18″、東經(jīng)106°20′30″，海拔750 m）進行，室內(nèi)試驗在西南大學(xué)南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 甘薯品種 萬薯5號是重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出的高產(chǎn)高淀粉品種，該品種紅色薯皮、白色薯肉，淀粉率在24%—26%，干率為34.9%—37.2%。高產(chǎn)低淀粉品種商丘52-7系河南省商丘地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育，該品種紅色薯皮、淡黃色薯肉，淀粉率在8%—12%，干率為17%—21%。

1.2.2 群體構(gòu)建 2012年以萬薯5號為母本，商丘52-7為父本在海南陵水基地通過嚴格的人工雜交技術(shù)，共得到F1實生系189株；2012年6月將實生系材料繁殖分為兩套，分別將189株材料及親本在歇馬基地和槽上基地種植、收獲、留種并檢測薯塊淀粉含量。2013年6月將全部留種材料繁殖分為兩套，再次在歇馬基地和槽上基地種植、收獲、留種并檢測薯塊淀粉含量。在2個基地選擇全部株系建立標記作圖群體。

1.3 試驗設(shè)計

2012年全部F1實生系群體及親本在歇馬和槽上基地種植，每株系種植3株。2013年每株系采用5 m×0.8 m的單行小區(qū)設(shè)計。2次重復(fù)，收獲時親本及群體株系每重復(fù)隨機取3個鮮薯，并將鮮薯去皮切丁，薯丁混勻后稱取100 g裝入培養(yǎng)皿，3次重復(fù)，之后攤開轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿并在80℃烘箱中放置48 h，等薯干重量穩(wěn)定后用天平稱量并記錄干率數(shù)據(jù)。分別以2012年、2013年歇馬、槽上兩點干率的平均值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，干率與淀粉率的換算公式為淀粉率（%）=干率（%）×0.86945-6.34587。

1.4 總DNA提取、引物選擇和SSR分析

采用改良CTAB法[21]提取親本及F1實生系幼嫩植株葉片的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的純度和完整性，-20℃保存?zhèn)溆?。EST-SSR引物來源于廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和西南大學(xué)薯類作物研究所等開發(fā)設(shè)計的有關(guān)甘薯EST-SSR標記[22-26]。引物序列由上海英駿和上海生工公司合成。反應(yīng)體系為10 μL，包括1.2 μL 10×buffer（含Mg2+15 mmol·L-1）、0.2 μL dNTP、1 μL引物、0.1 μL Taq酶、1 μL模板DNA（約50 ng·μL-1）、5.5 μL ddH2O。在ABI9700PCR儀上進行。反應(yīng)程序為94℃5 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃5 min；25℃5 min，最后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。SSR擴增產(chǎn)物經(jīng)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用銀染法檢測。

1.5 親本間標記多態(tài)性與雜交群體（F1）標記基因型檢測

利用不同的甘薯EST-SSR引物系列對親本萬薯5號、商丘52-7進行多態(tài)性篩選，在親本中表現(xiàn)多態(tài)性的引物被用于檢測雜交群體189個單株的多態(tài)性。根據(jù)位點分離類型，依照Joinmap4.0說明書中的標準基因型分析方法對雜交群體中189個單株分別記錄其基因型代碼。與親本萬薯5號具有相同帶型記為lm，沒有記為ll，與親本商丘52-7具有相同帶型記為np，沒有記為nn；在親本萬薯5號和親本商丘52-7中均有，但在雜交后代中發(fā)生分離的也按照以上標準記錄。只有清晰的帶型才被記錄，缺失和模糊帶型用“--”表示?？ǚ綑z測用于檢測位點的偏分離情況。

1.6 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建采用作圖軟件JoinMap4.0[27]，以LOD≥5.0，Kosambi作圖函數(shù)進行連鎖分析。2個親本連鎖群分別命名，萬薯5號和商丘52-7連鎖圖譜分別用“W”和“S”表示，其小數(shù)點后的數(shù)字01—90表示所屬連鎖群的序號。

1.7 標記位點命名

標記命名為引物名后加一大寫字母，A/B/C/D表示同一EST-SSR引物擴增出的不同位點。如標記SIP272B表示標記SIP272的第二條多態(tài)性帶；引物名后加一大寫字母再加數(shù)字，表示雙親本共顯但后代發(fā)生分離的四種標記命名，如SIP272D3表示共顯性標記SIP272的第四條多態(tài)性帶的第三種分離帶型。

1.8 QTL定位

采用MapQTL5.0軟件對甘薯淀粉含量進行統(tǒng)計分析[28]，確定不同水平淀粉含量在群體中的分布頻率。利用QTL分析軟件MapChart 2.2對SSR數(shù)據(jù)進行分析[29]，采用區(qū)間作圖法（interval mapping，IM）對全基因組進行QTL掃描，選擇1.0 cM的步長，參數(shù)為1 000次回歸，顯著水平為0.01，以LOD≥3.0作為閾值對淀粉含量可能存在的QTL進行定位和效應(yīng)估計。加性效應(yīng)以萬薯5號的等位基因為背景，即正效應(yīng)表示萬薯5號的等位基因增加性狀表型值，負效應(yīng)表示萬薯5號的等位基因減少性狀表型值，而商丘52-7的等位基因效應(yīng)相反。

2 結(jié)果

2.1 甘薯EST-SSR分子標記引物多態(tài)性分析

利用1 679對EST-SSR引物篩選親本間的引物多態(tài)性，共獲得1 045對多態(tài)性引物，利用1 045對多態(tài)性引物檢測189個F1群體的標記基因型，每個標記檢測到有1—5個位點，共獲得了1 418個標記位點，含共顯現(xiàn)標記位點166個，占11.7%。1 418個標記位點中屬于母本的標記位點642個，屬于父本的標記位點776個。

2.2 甘薯EST-SSR分子標記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用JoinMap4.0軟件分別對上述獲得的父母本多態(tài)性標記進行遺傳連鎖分析，在LOD≥5.0情況下，分別構(gòu)建父母本的連鎖遺傳圖譜。其中屬于母本的642個標記位點構(gòu)建了74個連鎖群，共有215個標記位點構(gòu)建在連鎖圖譜上，占標記總數(shù)的33.5%，每個連鎖群上有2—11個標記位點，連鎖群長度在0.6—129.4 cM，圖譜總長為3 826.07 cM，標記間平均距離為17.80 cM。屬于父本的776個標記位點構(gòu)建了80個連鎖群，共有252個標記位點構(gòu)建在連鎖圖譜上，占標記總數(shù)的32.5%，每個連鎖群上有2—24個標記位點，連鎖群長度在2.0—156.8 cM，圖譜總長為3 955.0 cM，標記間平均距離為15.7 cM（表1，圖1—圖2）。

表1 遺傳連鎖圖譜中連鎖群的圖距和分布

QTL of、、在2個環(huán)境均被檢測到,, andwere detected in two environments

圖1 萬薯5號EST-SSR分子標記連鎖圖及淀粉含量QTL的分布

Fig. 1 The EST-SSR linkage map of Wanshu 5 and distribution of QTLs for starch content

、、、、、、、是在2個環(huán)境中均被檢測到的QTL。、、、、、只在1個環(huán)境被檢測到的QTL

QTL of,,,,,,,andwere detected in two environments. QTL of,,,,, andwere detected in one environment

圖2 商丘52-7 EST-SSR分子標記連鎖圖及淀粉含量QTL的分布

Fig. 2 The EST-SSR linkage map of shangqiu52-7 and distribution of QTLs for starch content

2.3 甘薯淀粉含量的表型分析

通過對親本及后代群體甘薯淀粉含量的測定（表2），結(jié)果表明，淀粉含量在后代群體中差異較明顯，親本萬薯5號的淀粉含量在2012年和2013年分別為24.52%和23.10%，商丘52-7分別為4.86%和4.35%，因此，萬薯5號的淀粉含量明顯高于商丘52-7。F1后代有超親表現(xiàn)，且呈連續(xù)分布，說明淀粉含量性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀，群體符合QTL定位的要求。通過對F1群體方差分析表明（表3）。淀粉含量不僅受基因型影響外，還受環(huán)境條件的影響。

表2 親本及F1群體淀粉含量的表型分析

表3 F1群體淀粉含量的方差分析

**顯著水平Significance levels at＜0.01

圖3 淀粉含量的頻率分布圖

由頻率分布圖（圖3）可知，2012年和2013年（兩點平均）甘薯的淀粉含量指標在群體中表現(xiàn)明顯正態(tài)分布，在后代群體中分布的峰度和偏度均小于1，且均有一定數(shù)量的超親類型存在，呈現(xiàn)為連續(xù)變異，變異系數(shù)分別為19.74%和18.51%，具有數(shù)量性狀遺傳的典型特點，適于進一步QTL分析。

2.4 甘薯淀粉含量的QTL分析

利用區(qū)間作圖法在2012年和2013年共檢測到17個與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL。其中，3個位于母本萬薯5號遺傳圖譜連鎖群上，14個位于父本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上（表4，圖1—圖2）。

定位在母本的W.01連鎖群上，且在2年中均被檢測到，置信區(qū)間分別為21.70—26.77，與最近的標記GDAAS0603A平均距離為2.5 cM，其2年平均貢獻率為31.9%。母本萬薯5號的等位基因為負的加性效應(yīng)，減少性狀表型值，2年分別為-2.93和-3.04。

定位在母本的W.10連鎖群上，且在2年中均被檢測到，置信區(qū)間為3.00—8.74，與最近的標記GDAAS0163A2平均距離為1.0 cM，其2年平均貢獻率為11.05%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值，2年分別為+3.43和+2.54。

定位在母本的W.28連鎖群上，且在2年中均被檢測到，置信區(qū)間為0.00—29.00，與最近的標記SIP010距離2年平均為5.0 cM，其2年平均貢獻率為17.2%。母本萬薯5號的等位基因為負的加性效應(yīng)，減少性狀表型值，2年分別為-2.01和-1.55。

定位在父本的S.01連鎖群上，且在2年中均被檢測到，置信區(qū)間為62.07—72.35，與最近的標記GDAAS0809A的距離2年平均為1.5 cM，其2年平均貢獻率為33.5%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值2年分別為+3.74和+3.17。

定位在父本的S.02連鎖群上，且在2年中均被檢測到，置信區(qū)間為8.00—70.04，與最近的標記GDAAS0519B距離2年平均為24.0 cM，其2年平均貢獻率為23.75%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值2年分別為+2.28和+1.96。

定位在父本的S.04連鎖群上，且在2年中均被檢測到，置信區(qū)間為60.89—81.6，在標記unigene12034的位置，其2年平均貢獻率為10.10%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值2年分別為+1.49和+1.25。

定位在父本的S.05連鎖群上，且在,2年中均被檢測到，置信區(qū)間為14.00—26.68，在標記GDAAS0603C的的位置，其2年平均貢獻率為10.15%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值2年分別為+1.46和+1.29。

定位在父本的S.07連鎖群上，只在2013年中檢測到，置信區(qū)間為8.00—24.92，在標記IBS121的位置，其2013年貢獻率為8.4%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值為+1.21。

定位在父本的S.09連鎖群上，只在2013年中檢測到，置信區(qū)間為32.40—51.70，在標記GDAAS0776B的位置，其2013年貢獻率為8.4%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值為+1.21。

定位在父本的S.10連鎖群上，只在2012年中檢測到，置信區(qū)間為10.00—29.051，與最近的標記SIP003的距離6.05 cM，其2012年貢獻率為14.6%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值為+1.77。

定位在父本的S.14連鎖群上，且在2年中均都檢測到，置信區(qū)間為60.20—75.33，在標記IbY40的位置，其兩年平均貢獻率為13.10%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值,2年分別為+1.65和+1.57。

定位在父本的S.18連鎖群上，只在2012年中檢測到，置信區(qū)間為97.02—105.02，與最近的標記GDAAS0485的距離5.3 cM，其2012年貢獻率為24.4%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值為+2.35。

定位在父本的S.19連鎖群上，且在2年中均都檢測到，置信區(qū)間為52.6—68.6，與最近的標記GDAAS0894的距離兩年平均為10.0 cM，其2年平均貢獻率為24.05%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值2年分別為+2.24和+1.17。

定位在父本的S.22連鎖群上，且在2年中均都檢測到，置信區(qū)間為0.00—38.00，與最近的標記GDAAS0479A的距離兩年平均為18.5 cM，其2年平均貢獻率為27.5%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值2年分別為+2.35和+2.20。

定位在父本的S.34連鎖群上，且在2年中均都檢測到，置信區(qū)間為60.83—85.17，與最近的標記GDAAS0102的距離兩年平均為2.1 cM，其2年平均貢獻率為14.15%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值2年分別為+1.74和+1.57。

定位在父本的S.35連鎖群上，只在2012年中檢測到，置信區(qū)間為10.00—32.74，與最近的標記GDAAS0035A3的距離12.74 cM，其2012年貢獻率為19.2%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值為+1.96。

定位在父本的S.54連鎖群上，只在2013年中檢測到，置信區(qū)間為68.64—70.88，與最近的標記IbU20A4的距離1.44 cM，其2013年貢獻率為25.1%。母本萬薯5號的等位基因為加性效應(yīng)，增加性狀表型值為+2.52。

表4 甘薯淀粉含量的QTL及其效應(yīng)分析

a1、a2：加性效應(yīng)，正值表示正向效應(yīng)的等位變異來自萬薯5號，負值表示負向效應(yīng)的等位變異來自商丘52-7

a1, a2: Additive effects, positive value indicates that positive effect allele is coming from Wanshu 5, negative value indicates that the negative effect allele is coming from Shangqiu52-7

3 討論

3.1 甘薯作圖標記的選用

分子標記是指基于生物個體之間DNA序列的差異而建立的遺傳標記，是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因定位、目標性狀分子標記篩選等研究的理想工具。衡量遺傳圖譜質(zhì)量的一個重要標準是標記分布的均勻程度，而標記類型是影響連鎖群上的標記均勻分布與否的重要因素之一。

目前用于甘薯研究的分子標記主要包括AFLP、RAPD、RFLP、SSR、EST-SSR，其中EST-SSR標記成為構(gòu)建遺傳圖譜的新資源。EST-SSR標記是采用高通量數(shù)據(jù)直接測序開發(fā)，cDNA又不含內(nèi)含子，300—400 bp的EST-SSR就能反映出基因的性質(zhì)，具有多、快、好、省的特點。同時EST-SSR標記來自轉(zhuǎn)錄基因，可有效揭示基因的轉(zhuǎn)錄功能，標記間的定位關(guān)系就是對基因組序列的定位，因而可直接用于甘薯遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因作圖，加速了甘薯新性狀基因的發(fā)現(xiàn)，所以EST-SSR標記技術(shù)將在構(gòu)建甘薯遺傳圖譜中發(fā)揮重要的作用。

由于EST-SSR引物的特異性和開發(fā)的成本較高，目前，開發(fā)出的有關(guān)甘薯的EST-SSR引物較少，利用EST-SSR引物構(gòu)建的甘薯遺傳圖譜更少。本研究利用開發(fā)的EST-SSR引物[22-26]，首次開展了全部基于EST-SSR標記的甘薯遺傳圖譜構(gòu)建研究，為以后甘薯圖譜構(gòu)建研究提供參考標記，為甘薯重要品質(zhì)性狀的QTL定位提供更多的研究方法和分子標記。

3.2 甘薯的遺傳圖譜

甘薯（2n=6x=90）是多倍體無性繁殖植物，因為同時具有其染色體數(shù)量多還不穩(wěn)定；自交不親和同一孕群內(nèi)品種間雜交不親和；材料間異交導(dǎo)致其遺傳組成高度雜合，且F1就大量分離等特點，是公認的圖譜構(gòu)建、QTL定位等遺傳學(xué)研究較困難的主要農(nóng)作物[30]。Thompson等[9]采用RAPD標記分析了引物的多態(tài)性，并構(gòu)建甘薯遺傳圖譜。Jie等[30]、Kriegner等[11]和Cervantes-Flores等[13]利用AFLP技術(shù)和“雙假測交”策略分別構(gòu)建了不同群體、連鎖群數(shù)量不等的雙親的遺傳圖譜，蒲志剛等[17]利用AFLP技術(shù)構(gòu)建了連鎖群數(shù)量較少的遺傳圖譜。吳潔等[16]和唐茜等[18]利用SRAP標記構(gòu)建了連鎖群數(shù)量較少的遺傳圖譜，但李愛賢等[14]利用SRAP標記構(gòu)建了2個親本的、連鎖群數(shù)量多的高密度分子連鎖圖譜。Zhao等[15]和Li等[31]利用AFLP和SSR兩種類型標記，構(gòu)建2個親本密度高、連鎖群數(shù)量多的遺傳圖譜。以上研究只有吳潔等[14]、唐茜等[17]和蒲志剛等[15]利用雜交群體，構(gòu)建的是群體的圖譜，但均有連鎖群數(shù)量少、圖譜密度較小的不足。其他研究均采用了“雙假測交”策略，構(gòu)建的是雙親的遺傳圖譜。

本研究運用EST-SSR標記，采用JoinMap4.0軟件和“雙假測交”策略分別構(gòu)建父母本的連鎖遺傳圖譜。有215個標記位點構(gòu)建在母本連鎖圖譜上，252個標記位點構(gòu)建在父本連鎖圖譜上，是目前構(gòu)建的EST-SSR標記數(shù)量最多的甘薯遺傳圖譜。母本74個連鎖群圖譜總長為3 826.07 cM，標記間平均距離為17.80 cM，父本80個連鎖群圖譜總長為3 955.0 cM，標記間平均距離為15.7 cM，是連鎖群數(shù)量多、密度中等的遺傳圖譜。

本研究構(gòu)建的遺傳圖譜連鎖群數(shù)量母本為74個，父本為80個，與實際甘薯90個連鎖群數(shù)目有差異，主要是因為EST-SSR標記在染色體上分布是隨機的，染色體上不同區(qū)域的交換值具有異質(zhì)性，出現(xiàn)大量小片段的連鎖群或連鎖上有較大的空隙。同時，甘薯為區(qū)段異源多倍體（多數(shù)同源），遺傳表現(xiàn)與正常的物種不同，在分子標記條帶記錄上未表現(xiàn)出來，導(dǎo)致很多標記不能與連鎖群對應(yīng)，也可能導(dǎo)致結(jié)論出現(xiàn)差異。增加群體數(shù)量、增加標記數(shù)量、增加標記種類有可能解決這些問題。

3.3 甘薯的QTL定位

淀粉含量是甘薯的主要品質(zhì)性狀，高淀粉含量的甘薯品種具有更高的利用價值，甘薯塊根干物質(zhì)含量又與淀粉含量顯著正相關(guān)，控制淀粉含量和干物質(zhì)含量的QTL定位是甘薯研究的重點。Cervantes- Flores等[19]的研究結(jié)果表明，淀粉含量受多基因控制的數(shù)量性狀，表現(xiàn)型是基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果。吳潔等[16]檢測到1個淀粉含量QTL，紅旗4號的加性效應(yīng)增加淀粉6.37%，解釋表型變異的20.1%。蒲志剛等[17]在綿粉1號遺傳圖的第2連鎖群上檢測到E1M722可作為淀粉的臨近QTL。李愛賢等[14]檢測到了1個主效位點，位于父本鄭薯20的Z31連鎖群上，QTL的加性效應(yīng)為-0.73，解釋表型變異的7.70%。唐茜等[18]檢測到1個淀粉含量QTL，BB3-26的加性效應(yīng)增加淀粉含量2.12%，解釋表型變異的21.3%。Zhao等[15]檢測到27個干物質(zhì)含量QTL，供獻率在9.0%—45%。Li等[31]定位了9個與塊根產(chǎn)量相關(guān)的主效QTL。以上研究定位的與淀粉含量相關(guān)的QTL較少，并且多數(shù)只是在1個環(huán)境中被檢測到，沒有考慮多個環(huán)境的影響。

本研究利用EST-SSR技術(shù)，在2012年和2013年共檢測到17個與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL，貢獻率在8.4%—40.5%。其中，3個位于母本萬薯5號遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中均檢測到相同的標記。14個位于父本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中有8個均檢測到相同的標記。由于采用的是不同標記類型和作圖群體，定位的QTL無法進行相互比較和驗證，這也是未來研究的方向。

3.4 QTL定位圖譜分布及加性效應(yīng)

采用不同的作圖群體，檢測到的QTL在親本圖譜上分布具有差異，其加性效應(yīng)也有差異。

與前人研究相比，Cervantes-Flores等[19]檢測到13個干物質(zhì)含量QTL。5個位于高干物質(zhì)親本連鎖圖譜上，其中，4個具有正加性效應(yīng)，1個具有負加性效應(yīng)；8個位于低干物質(zhì)親本連鎖圖譜上，其中4個具有正加性效應(yīng)，4個具有負加性效應(yīng)；同時還檢測到12個淀粉含量的QTL，5個位于高淀粉親本連鎖圖譜上，其中，3個具有正加性效應(yīng)，2個具有負加性效應(yīng)；7個位于低淀粉親本連鎖圖譜上，其中，3個具有正加性效應(yīng)，4個具有負加性效應(yīng)。Zhao等[15]檢測到的27個干物質(zhì)含量QTL，22個定位在高干率親本徐781的遺傳圖譜上，其中20個具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。5個定位在低干率親本徐薯18圖譜上，其中只有1個具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。Li等[31]定位的9個與塊根產(chǎn)量相關(guān)的主效QTL。4個定位在高產(chǎn)親本徐薯18的遺傳圖譜上，其中2個具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。5個定位在低產(chǎn)親本徐781的遺傳圖譜上，其中只有1個具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。本研究定位的17個QTL，對于高淀粉親本萬薯5號的等位基因，15個QTL的加性效應(yīng)為正值，增加淀粉性狀的表現(xiàn)值，其中1個位于高淀粉親本萬薯5號遺傳圖譜連鎖群上，14個位于低淀粉親本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上。只有2個QTL加性效應(yīng)為負值，減少淀粉性狀的表型值，定位在高淀粉親本萬薯5號遺傳圖譜連鎖群上。出現(xiàn)這些差異可能具有2個方面的原因：一是選用的材料不同，萬薯5號是超高淀粉含量的甘薯品種（25%左右），而商丘52-7是超低淀粉含量的甘薯品種（5%左右），在一定概率范圍內(nèi)子代大多數(shù)超過低淀粉含量親本，增加表型性狀，表現(xiàn)為加性效應(yīng)；二是采用“雙假測交”的作圖方法，雙親分別作圖，控制高淀粉的等位基因在低淀粉性狀親本的遺傳圖譜上也能檢測到。這也印證了Cervantes- Flores等[19]在高淀粉育種中親本淀粉含量高有利于子代有利基因的積累的結(jié)論。

3.5 本研究需要說明的問題

由于采用的是不同分子標記和研究群體，分子標記間缺乏一致性，不同群體構(gòu)建的連鎖圖譜覆蓋的染色體區(qū)域存在差異，限制了遺傳圖譜和QTL間的相互比較。同時，由于公布的EST-SSR標記數(shù)量太少，且本研究尚有大量的標記不能構(gòu)建在連鎖遺傳圖譜上，造成2—3個標記的連鎖群數(shù)量偏多。為了構(gòu)建高密度的甘薯分子連鎖圖譜，可增加EST-SSR標記的數(shù)量和群體的數(shù)量，或者添加更多的標記種類，有利于甘薯QTL精細定位的后續(xù)研究。

4 結(jié)論

以高淀粉含量品種萬薯5號為母本、低淀粉含量品種商丘52-7為父本建立了189個雜交群體，分別構(gòu)建了基于EST-SSR標記的雙親遺傳連鎖 圖譜。其中母本構(gòu)建了74個連鎖群，圖譜總長為3 826.07 cM，標記間平均距離為17.80 cM。父本構(gòu)建了80個連鎖群，圖譜總長為3 955.0 cM，標記間平均距離為15.7 cM。檢測到17個與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL，貢獻率在8.4%—40.5%。其中3個位于母本萬薯5號遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中均檢測到相同的標記；14個位于父本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中有8個均檢測到相同的標記，標記GDAAS0603在雙親中和2個環(huán)境中同時檢測到，這些環(huán)境穩(wěn)定QTL可用于分子標記輔助選擇。該研究豐富了構(gòu)建甘薯遺傳圖譜的標記類型。

References

[1] FAOSTAT, Food and agriculture organization of the United Nations, production statistics. 2011, [2016-03-25]. http://faostat3.fao.org/home/ index.html.

[2] Dhir S K, Oglesby J, Bhagsari A S. Plant regeneration via somatic embryogenesis and transient gene expression in sweet potato protoplasts.,1998, 17: 665-669.

[3] Hemmat M, Weeden N F, Manganaris A G, LANSON D M. Molecular marker linkage map for apple., 1994, 85(1): 4-11.

[4] Grattapaglia D, Sederoff R. Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and Eucalyptus urophylla using a pseudo-testcross: mapping strategy and RAPD markers.,1994, 137: 1121-1137.

[5] Lodhi M A, Ye G N, Weeden N F, Reisch B I, Daly M J.A molecular marker based linkage map of vitis., 1995, 38(4): 786-794.

[6] Van Ooijen J W, Voorrips R E. JoinMap 4.0, Software for the calculation of genetic linkage maps. Plant Research International, Wageningen,TheNetherlands, 2006: 2-63.

[7] Arthur Q V, La Bonte D R. Variation in randomly amplified DNA markers and root yield in “Jewel” sweetpotato clones., 1995, 120(5): 734-740.

[8] ARhur Q V, La Bonte D R. Genetic variation among sweet potatoes propagated through nodal and adventitious sprouts., 1996, 121(2): 170-174.

[9] Thompson P G, Hong L L, Ukoskit K, Zhu Z. Genetic linkage of randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in sweet potato., 1997, 122: 79-82.

[10] Ukoskit K T, Thompson P G, Watson J C E, LAWRENCE G W. Identifying a randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) marker linked to a gene for root knot nematode resistance in sweet potato., 1997, 122: 818-821.

[11] Kriegner A, Cervantes J C, Burg K, MWANGA ROM, ZHANG D P. A genetic linkage map of sweetpotato ((L.) based on AFLP markers., 2003, 11: 169-185.

[12] Lander E S, Bostein D. Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps.,1989, 121: 185-199.

[13] Cervantes-Flores J C, Yencho G C, Kriegner A, Pecota K V, Faulk M A, Mwanga R O M, Sosinski B R. Development of a genetic linkage map and identification of homologous linkage groups in sweetpotato using multipledose AFLP markers., 2008, 21: 511-532.

[14] Li A X, Liu Q C, Wang Q M, Zhang L M, Zhai H, Liu S Z. Establishment of molecular linkage maps using SRAP markers in sweetpotato., 2010, 36: 1286-1295.

[15] Zhao N, Yu X X, Jie Q, Li H, Li H, Hu J, Zhai H, He S Z, Liu Q C. A genetic linkage map based on AFLP and SSR markers and mapping of QTL for dry-matter content in sweet potato.,2013, 32: 807-820.

[16] 吳潔, 譚文芳, 何俊蓉, 蒲志剛, 王大一, 張正圣, 詹付鳳, 閻文昭. 甘薯SRAP連鎖圖構(gòu)建淀粉含量QTL檢測. 分子植物育種, 2005, 3(6): 841-845.

Wu J, Tan W F, Yan W Z, He J R, PU Z G, WANG D Y, ZHANG Z S, ZHAN F F, YAN W Z. Construct on of SRAP linkage map and qtl mapping for starch content in sweet potato.,2005, 3(6): 841-845. (in Chinese)

[17] 蒲志剛, 王大一, 譚文芳, 吳潔, 閻文昭. 利用AFLP構(gòu)建甘薯連鎖圖及淀粉含量QTL定位. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010, 23(4): 1047-1050.

Pu Z G, Wang D Y, Tan W f, Wu J, Yan W Z. AFLP maps and QTL analysis of starch content of sweet potato.,2010, 23(4): 1047-1050. (in Chinese)

[18] 唐茜, 何鳳發(fā), 王季春, 王瑞娜. 甘薯SRAP遺傳圖譜構(gòu)建及淀粉含量QTL初步定位, 西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 32(6): 40-45.

Tang Q, He F F, Wang J C, Wang R N. Construction of a linkage map using SRAP markers and QTL mapping for starch content in sweet potato., 2010, 32(6): 40-45. (in Chinese)

[19] Cervantes-Flores J C, Sosinski B, Pecota K V, Mwanga R O M, Catignani G L, Truong V D, Watkins R H, Ulmer M R, Yencho G C. Identification of quantitative trait loci for dry-matter, starch, and b-carotene content in sweet potato., 2011, 28: 201-216.

[20] Yu X X, Zhao N, Jie Q, Zhai H, He S Z, Li Q, Liu Q C. Identifition of QTL for starch content in sweetpotato ((L.) Lam.)., 2014, 13(2): 310-315.

[21] Ukoskit K, Thompson P G, Watson J C E, LAWRENCE G W. Identifying a randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) marker linked to a gene for root knot nematode resistance in sweetpotato., 1997, 122: 818- 821.

[22] Hu J J, Nakatani M, Mizuno K, Fujimura T. Development and characterization of microsatellite markers in sweet potato., 2004, 54: 177-188.

[23] Wang Z Y, Fang B P, Chen J Y, Zhang X J, Luo Z X, Huang L F, Chen X L, Li Y J. De novo assembly and characterization of root transcriptome using illumina paired-end sequencing and development of cSSR markers in sweet potato ()., 2010, 11: 726-739.

[24] Wang Z Y, Li j, Luo Z X, Huang L F, Chen X L, Fang B P, Li Y J, Chen J y, Zhang X J. Characterization and development of EST-derived SSR markers in cultivated sweetpotato ()., 2011, 11: 139.

[25] Schafleitner R, Tincopa L, Palomino O, Rossel G, Robles R F, Alagon R, RIVERA C, QUISPE C, ROJAS L, PACHECO J A, GERMA D, KIM J Y, HOU J, SIMON R. A sweet potato gene index established by de novo assembly of pyrosequencing and Sanger sequences and mining for gene-based microsatellite markers., 2010, 11: 604.

[26] Zhang K, Wu Z D, Tang D B, Lv C W, Luo K, Zhao Y, Liu X, Huang Y X, Wang J C. Development and identification of SSR markers associated with starch properties and β-carotene content in the storage root of sweet potato ((L.)., 2016, 7: 223.

[27] Van Ooijen J W. Joinmap?4.0, Software for the calculation of genetic linkage maps in experimental populations.Wageningen, The Netherlands, 2006: 2-63.

[28] Van Ooijen J W. MapQTL?5.0, Software for the mapping quantitative trait loci in experimental populations. Wageningen, TheNetherlands, 2004: 2-63.

[29] Voorrips R E. MapChart 2.2, Software for the graphical presentation of linkage maps and QTL., 2006, 93(1): 77-78.

[30] Jie Q, Li H, Zhai H, Wang YP, Li Q, Ma D F, Xie Y P, Liu Q Q. Development of AFLP markers linked to stem nematode resistance gene in sweet potato ((L.) Lam.).,2009,6: 97-101.

[31] Li H, Zhao N, Yu X X, Liu Y X, Zhai H, He S H, Li Q, Ma D F, Liu Q C. Identification of QTLs for storage root yield in sweet potato., 2014, 170: 182-188.

（責(zé)任編輯 李莉）

Genetic Linkage Map Construction Based on EST-SSR and Analysis of QTLs for Starch Content in Sweetpotato ((L.) lam.)

TANG Dao-bin1,2, ZHANG Kai2, LüChang-wen2, XIE De-bin2, FU Ti-hua1, WANG Ji-chun2

（1College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;2College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University/Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Southwest University/Sweetpotato Engineering and Technology Research Center, Chongqing 400716）

【Objective】To provide a theoretical and practical basis for utilization of germplasm resources of sweetpotato with high starch content and molecular marker-assisted selection in sweetpotato, a genetic linkage map was constructed by using molecular markers, and quantitative trait loci (QTLs) associated with starch content were identified. 【Method】 A F1hybrid population was developed from a cross between Wanshu 5, a sweetpotato cultivar with high starch content, as the female parent, and Shangqiu 52-7, a cultivar with low starch content, as the male parent. By using EST-SSR markers and the software of JoinMap4.0, the molecular genetic linkage maps of both parents were constructed based on the “double pseudo testcross” strategy, respectively. And QTLs for starch content trait were identified using composite interval mapping method based on the phenotypic data of F1population in two years (2012 and 2013).【Result】Among the 1 679 EST-SSR primer pairs primarily tested in F1lines, 1 045 polymorphic primer pairs were selected to screen in the population lines, and 1 418 polymorphic loci were obtained. The genetic linkage relationship of polymorphic loci were analyzed with the LOD≥5.0 as a threshold, and the genetic linkage map of female and male parents were constructed respectively. A total of 74 linkage groups for female parent were constructed based on 642 polymorphic loci, of which 215 (33.5%) loci were placed on the genetic linkage map. The number of markers in each linkage group ranged from 2 to 11. The length of linkage groups ranged from 2.0 to 156.8 cM, and the linkage map covered a total length of 3 826.07 cM, with an average distance between markers of 17.80 cM. A genetic linkage map for male Shangqiu52-7 was constructed by using 776 polymorphic loci, of which 250 (32.5%) loci distributed on 80 linkage groups. The number of markers in each linkage group ranged from 2 to 24. The length of linkage groups ranged from 2.0 to 156.8 cM, and the linkage map covered a whole length of 3 955.0 cM with an average interval of 15.7 cM between markers. Using QTL analysis software Map QTL 5.0 and Interval Mapping method, QTLs for starch content were identified based on the starch content measured in two years (2012 and 2013) and two environments. Seventeen QTLs for starch content were detected, explaining 8.4%-40.5% of the phenotypic variation. Three QTLs,, andmapped on the linkage group of female Wanshu 5 were detected under two environments. Fourteen QTLs were detected on the linkage group of male Shangqiu52-7, of which,,,,,,,were detected under two environments, and,,,,,were only detected under one environment. Mark GDAAS 0603 was detected simultaneously on the linkage groups of both parents and two environments. Those QTLs for starch content could be used in molecular marker-assisted selection of sweetpotato. 【Conclusion】Two genetic linkage map were constructed based on EST-SSR markers, and 17 QTLs for starch content of sweetpotato were identified. Results of the study has enriched the types of molecular markers used for genetic linkage map construction in sweetpotato.

sweetpotato; starch content; EST-SSR; genetic linkage map; QTL

2016-04-15；接受日期：2016-09-14

國家自然科學(xué)基金（31101192）、重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項重大項目（cstc2015shms-ztzx80002，cstc2015shms-ztzx80003，cstc2015shms-ztzx80004）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（XDJK2012C102）

唐道彬，Tel：023-68250469；E-mail：tdbin741023@163.com。通信作者傅體華，E-mail：futihua@sina.com。通信作者王季春，E-mail：wchun1963@163.com