白廣棟，王夢(mèng)竹，王紅巖，楊 雪，李明月，何倩毓

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

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果蠅Cullin 3基因dsRNA設(shè)計(jì)及RNAi效率檢測(cè)

白廣棟，王夢(mèng)竹，王紅巖，楊 雪，李明月，何倩毓*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

Cullin 3作為Cullin蛋白家族的一員對(duì)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白降解有著重要意義。為便于深入研究果蠅中Cullin 3基因的功能，本實(shí)驗(yàn)對(duì)Cullin 3基因進(jìn)行dsRNA設(shè)計(jì)，并通過PCR、體外轉(zhuǎn)錄、RNA干擾以及Real-time PCR等方法，檢測(cè)得到該dsRNA的RNAi效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Cullin 3基因的dsRNA具有RNA干擾效果。該實(shí)驗(yàn)將為今后研究果蠅Cullin 3基因的功能提供一定的技術(shù)支持。

Cullin 3基因；雙鏈RNA(dsRNA)；E3連接酶；RNA干擾；Real-time PCR

泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后重要的一類修飾。蛋白質(zhì)經(jīng)泛素化修飾后最終通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)被降解。靶蛋白的泛素化降解一般是在E1活化酶、E2結(jié)合酶以及E3連接酶的共同作用下完成，其中對(duì)特定蛋白的降解主要是由E3連接酶決定。據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)，高等真核生物體內(nèi)共存在1 000多種E3連接酶[1]，主要?jiǎng)澐譃閮纱蠹易澹謩e為HECT(Homologous to E6-AP C-Terminus)家族和RING(Realy Interesting New Gene)家族。由Cullin蛋白等組成的Cullin-RING E3 Ligases(CRL)復(fù)合體，便是RING家族中一員并占有相當(dāng)大的比例。它通過降解生物體內(nèi)的某些關(guān)鍵蛋白可以精細(xì)調(diào)控細(xì)胞中的許多信號(hào)通路和生理過程，如DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、DNA 損傷修復(fù)、腫瘤抑制、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等[2，3]。

CRL復(fù)合體是由含RING結(jié)構(gòu)域的催化亞基(如ROC1、ROC2)、Cullin骨架蛋白、接頭蛋白(如SKP1，ElongB/C，DDB1等)以及底物識(shí)別亞基(如F box，DCAF等)這4個(gè)部分組成。CRL復(fù)合體中所包含的Cullin骨架蛋白的不同決定了構(gòu)成CRL的RING亞基、接頭蛋白以及底物識(shí)別亞基的不同及特定的功能。在人體中共存在7種Cullin蛋白，分別是Cullin 1、Cullin 2、Cullin 3、Cullin 4A、Cullin 4B、Cullin 5及Cullin 7[4]。與其它Cullin蛋白不同的是，CRL復(fù)合體中的Cullin 3在與底物結(jié)合時(shí)不需要額外橋接蛋白，而是直接與底物識(shí)別亞基 BTB(bric-abrac tramtrack，broad complex)類蛋白相結(jié)合來介導(dǎo)底物的泛素化[5]。有研究表明，Cullin 3的異常變化會(huì)影響腫瘤相關(guān)信號(hào)通路從而影響腫瘤的發(fā)展[6]。Cullin 3的異常表達(dá)會(huì)影響小鼠和果蠅的生殖系統(tǒng)中精子的形成，這也可能是引起雄性個(gè)體不育的原因之一[7]。此外，Cullin 3可以降低引起假性醛固酮減少癥2型綜合征的無賴氨酸激酶蛋白的水平，還在維持血壓、K+和pH的平衡中起著重要作用[6]。本實(shí)驗(yàn)利用果蠅這一成熟的模式動(dòng)物，通過對(duì)其Cullin 3的dsRNA設(shè)計(jì)及RNAi效率檢測(cè)，可為今后研究Cullin 3蛋白參與果蠅相關(guān)信號(hào)通路的研究提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 材料來源

果蠅Kc細(xì)胞由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院鄒傳山老師實(shí)驗(yàn)室提供。使用添加5% 胎牛血清(Fetal bovine serum，South American Origin，Hyclone)的Schneider果蠅細(xì)胞培養(yǎng)基(Schneider’s Drosophila Medium 1X，liquid，Gibco，Invritogen)，在27 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到106/mL時(shí)，以1∶5的比例轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(由普洛麥格生物技術(shù)有限公司提供)；Real-time PCR試劑盒(由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司提供)；其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)所備試劑。

1.3 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀、Real-Time PCR儀、DNA凝膠成像系統(tǒng)、低溫冷凍離心機(jī)。

2 方法

2.1 dsRNA設(shè)計(jì)及引物合成

根據(jù)Flybase上發(fā)布的Cullin 3基因信息(Flybase ID：FBgn0261268)設(shè)計(jì)dsRNA。 dsRNA設(shè)計(jì)的原則：dsRNA長(zhǎng)度在500 bp左右，且通過BLAST比對(duì)不能與果蠅基因組中其他基因有超過19 bp的同源性。根據(jù)確定的dsRNA合成區(qū)域的核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0.軟件設(shè)計(jì)Cullin 3的PCR引物以及對(duì)照基因EGFP的PCR引物，并在每一對(duì)引物的5’末端加上T7啟動(dòng)子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGG，作為最終PCR擴(kuò)增引物。具體引物序列見表1。引物合成委托上海生工公司完成。

2.2 雙鏈DNA的擴(kuò)增

從果蠅Kc細(xì)胞中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，分別進(jìn)行Cullin 3、EGFP雙鏈DNA的PCR擴(kuò)增。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠分析后進(jìn)行膠回收，并測(cè)序鑒定。鑒定成功后，每個(gè)基因的多管PCR膠回收產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，使其濃度達(dá)到合成dsRNA的要求。濃縮方法：將多管PCR膠回收產(chǎn)物合并一管后，加入0.1倍體積3 M 醋酸鈉(pH=5.2)和1倍體積的異丙醇，混勻，置于冰上5 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，棄上清，加500 μL預(yù)冷的75%乙醇，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，干燥5 min后加30 μL無RNA酶污染的水溶解，-20 ℃保存待用。

表1 dsRNA合成引物序列信息及擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 dsRNA的合成

以濃縮后的雙鏈DNA為模板，采用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成Cullin 3和EGFP的dsRNA，具體步驟按說明書操作并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行微調(diào)。

2.4 RNAi干擾實(shí)驗(yàn)

向12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)以2×105密度接種果蠅的Kc細(xì)胞，12 h后，分別加入實(shí)驗(yàn)組Cullin 3和對(duì)照組EGFP的dsRNA，每組dsRNA的加入量均為5 μg/mL，每組3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)，孵育48 h后，收集細(xì)胞。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)RNAi效率

分別收集各dsRNA處理的Kc細(xì)胞，提取RNA后并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍后采用TOYOBO的SYBR Green Realtime Master Mix(TOYOBO，Cat.OPK-201)進(jìn)行Real-time PCR。以果蠅rp49 作為內(nèi)參基因，采用2-△△ct法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行3次，取各組數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成柱形圖。表2為Real-time PCR涉及到的引物。

表2 Real-time PCR引物序列信息及擴(kuò)增產(chǎn)物

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 16.0 “Independent Samples T-Test”分析?！?”表示p<0.05；“**”表示p<0.01。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 雙鏈DNA擴(kuò)增結(jié)果

以Kc細(xì)胞的cDNA為模板，利用表1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增合成雙鏈DNA。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得圖1所示特異性的目的條帶。膠回收產(chǎn)物測(cè)序后BLAST比對(duì)確認(rèn)為目的片段。

圖1 Cullin 3基因以及EGFP基因dsRNA對(duì)應(yīng)的雙鏈DNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3.2 dsRNA合成結(jié)果

以濃縮后的雙鏈DNA為模板，利用T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成Cullin 3-dsRNA以及EGFP-dsRNA，合成后的dsRNA稀釋60倍使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。通過凝膠成像系統(tǒng)分析得到如圖2所示的特異的、與目的大小一致的單一條帶。

圖2 Cullin 3基因以及EGFP基因dsRNA電泳結(jié)果

3.3 Cullin 3基因dsRNA的RNAi效率檢測(cè)及分析

為分析合成的Cullin 3-dsRNA是否有效，將dsRNA轉(zhuǎn)入Kc細(xì)胞中，孵育48 h后收集細(xì)胞，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后利用Real-time PCR檢測(cè)Cullin3基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cullin3-dsRNA處理的Kc細(xì)胞中Cullin 3基因的表達(dá)顯著下降(P<0.01)，與EGFP-dsRNA處理組相比較，其轉(zhuǎn)錄水平下降至15%(圖3)。

圖3 Cullin3 RNAi效率檢測(cè)

EGFP、Cul3分別代表各自對(duì)應(yīng)的dsRNA，柱形圖上“**”表示差異極顯著(P<0.01)

4 討論

廣泛存在于不同物種之間Cullin家族蛋白是保守的，其家族成員之一的Cullin 3蛋白也不例外。Cullin 3蛋白作為CRL復(fù)合體最重要的組成部分，參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)多條重要的信號(hào)通路，與血壓、雄性生殖及腫瘤等疾病有一定的相關(guān)性，這也使其成為近年來諸多學(xué)者研究它的重要原因。目前，發(fā)表的文章認(rèn)為Cullin 3通過參與NF-κB信號(hào)通路和NRF2(nuclear factor erythroid-2-related factor)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)來調(diào)控腫瘤的發(fā)展與發(fā)生。NF -κB 信號(hào)通路有著調(diào)控細(xì)胞生殖、分化和凋亡的功能[8]。Cullin 3和KEAP1接頭蛋白組成的特異結(jié)構(gòu)可與IKKβ(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase B)結(jié)合，并介導(dǎo)IKKβ泛素化降解，從而激活了NF-κB 信號(hào)通路；NRF2信號(hào)通路可以調(diào)控抗氧化應(yīng)激，從而維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，由Culin 3組成的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可以介導(dǎo)NRF2核轉(zhuǎn)錄因子泛素化降解[9]。Lee和Shibata等人發(fā)現(xiàn)這兩條信號(hào)通路影響著腫瘤的發(fā)生，這些發(fā)現(xiàn)為以后腫瘤的研究與治療提供了基礎(chǔ)[6]。

前人通過大量的實(shí)驗(yàn)證明了Cullin 3在腫瘤發(fā)展方面有著重要的意義。同時(shí)Cullin 3還在其它疾病的發(fā)生過程中有著重要的生物學(xué)功能，但具體是通過什么樣的信號(hào)通路參與調(diào)控的，目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用果蠅這一成熟的模式生物，對(duì)它的Cullin 3基因進(jìn)行dsRNA設(shè)計(jì)并利用體外轉(zhuǎn)錄方法獲得對(duì)應(yīng)的dsRNA，通過細(xì)胞RNAi技術(shù)和Real-time PCR方法檢測(cè)其干擾效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Cullin 3基因的dsRNA具有顯著的RNA干擾效果。此實(shí)驗(yàn)為日后研究Cullin 3基因的具體功能提供了一定的技術(shù)支持。

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2016-08-27

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(XC2015018)；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(XYB2015-07)。

白廣棟(1994-)，男，本科。

E-mail：1584853964@qq.com

Q78

A

1005-2739(2016)06-0003-04

作者簡(jiǎn)介：何倩毓(1986-)，女，博士，講師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。

E-mail：heqianyu2005@163.com