石曉衛(wèi)++李書粉++鄧傳良++盧龍斗++高武軍

摘要：對石刁柏（Asparagus officinalis）品種UC309及TD818的兩個反轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列進行了PCR擴增并對其在基因組中的異質(zhì)性進行了分析。結(jié)果表明，s101366和s107518兩個轉(zhuǎn)座子序列均屬于Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子，是Ty1-copia反轉(zhuǎn)座酶的部分保守區(qū)序列，其長度分別為636和653 bp。對隨機獲得的兩個反轉(zhuǎn)座子測序表明兩個反轉(zhuǎn)座子存在一定的異質(zhì)性，其突變主要是由于發(fā)生了堿基置換，其中堿基轉(zhuǎn)換分別占到80.4%和80.0%，T？圮C和G？圮A轉(zhuǎn)換的比例差異不顯著。通過對兩個石刁柏品種 （TD818和UC309） 中獲得的序列聚類分析發(fā)現(xiàn)，s101366和s107518均未表現(xiàn)出性別間、品種間及近緣種間的保守性，甚至表現(xiàn)出了種內(nèi)異質(zhì)性大于種間的異質(zhì)性特征。這說明了兩個反轉(zhuǎn)座子處于高度變異的狀態(tài)，是產(chǎn)生染色體不穩(wěn)定的重要因素之一。

關(guān)鍵詞：石刁柏（Asparagus officinalis）；Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子；逆轉(zhuǎn)錄酶；序列分析；異質(zhì)性

中圖分類號：Q754 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）18-4819-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.048

顯花植物中，包括6個雙子葉和5個單子葉亞綱在內(nèi)的75%的科，都存在雌雄單性或者雌雄異株種[1，2]，大約38%（167個）的科和7.1%（959個）的屬中有6%（14 620種）的植物是雌雄異株植物[2]，如石刁柏（Asparagus officianalis）、啤酒花（Humulus lupulus）、番木瓜（Carica papaya）、菠菜（Spinacia oleracea）等[3]。研究表明，雌雄異株植物的性別決定方式多種多樣，其中性染色體決定是最為常見的性別決定方式之一[2]。截至2011年，在陸生開花植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有15個科21個屬40種植物具有同型或者異型性染色體（多為XY或者ZW系統(tǒng)），這些性染色體（XY或ZW）最初起源于一對常染色體[3，4]。但是對于早期性染色體如何從常染色體逐步演化為異型或者同型性染色體的機制仍不清楚。

反轉(zhuǎn)座子是一類廣泛存在于真核細胞中可移動的DNA元件，具有高拷貝數(shù)、高異質(zhì)性和插入位點專一性等特點[5]，又稱反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、逆元件。研究表明，反轉(zhuǎn)座子在植物的基因組中廣泛存在且占有較大的比例，如擬南芥和水稻基因組中反轉(zhuǎn)座子分別占了基因組的10%[6]和22%[7]，小麥基因組中反轉(zhuǎn)座子成分甚至達到49.07%[8]。Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子是廣泛存在于高等植物基因組中的一類反式元件[9]，且能夠通過整合過程中的重組和染色體重排來影響基因組和染色體組的穩(wěn)定[10，11]。因此，Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子的這種誘發(fā)染色體組的不穩(wěn)定作用可能是導致性染色體起源的因素之一[12]。研究表明，番木瓜Yh染色體雄性特異區(qū)的轉(zhuǎn)座子主要為Ty1-copia和Ty3-gypsy，且X染色體上的Ty3-gypsy反轉(zhuǎn)座子是常染色體上的兩倍[13]，進一步暗示了Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子在植物性染色體演化中可能具有重要的作用。

石刁柏是一種較為嚴格的雌雄異株植物，體細胞染色體數(shù)為2n=20，具有一對同型的性染色體[14]。研究發(fā)現(xiàn)石刁柏染色體組存在異型的常染色體對、B染色體數(shù)目不固定等特征[15，16]，說明石刁柏的染色體組處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，但是尚未有報道證明這種不穩(wěn)定狀態(tài)產(chǎn)生的原因。因此，本研究在利用高通量測序技術(shù)對石刁柏基因組重復序列測序的基礎(chǔ)上分析了兩個Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子的序列特征，并對其異質(zhì)性進行了研究，為進一步分析反轉(zhuǎn)座子和石刁柏染色體組的穩(wěn)定性直接關(guān)系及了解性染色體進化早期階段的相關(guān)信息提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 石刁柏（品種UC309和TD818） 種植于河南師范大學生物實驗園地。采用無激素、化肥栽培方式管理，通過花的結(jié)構(gòu)鑒定性別。石刁柏同屬雌雄同株植物文竹（Asparagus setaceus）購自于河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)貿(mào)花卉市場。

1.1.2 載體與引物 克隆載體為pMD？誖19-T，購自于寶生物工程（大連）有限公司。所用兩個反轉(zhuǎn)座子序列引物根據(jù)新鄉(xiāng)醫(yī)學院石刁柏基因組高通量測序結(jié)果[17]設(shè)計，反轉(zhuǎn)座子s101366上游引物序列為5′-GCAATCGTGTTGGTCTAAGT-3′，下游引物序列為5′-CGCCTCTGTAGTTGATAATG-3′，預(yù)期長度為635 bp。s107518上游引物序列為5′-TCATTATC- GCTCTGCTCCT-3′，下游引物序列為5′-CTACACA- CCTTCACATTCTC-3′，預(yù)期長度為658 bp。引物由北京華大基因研究中心合成。

1.2 方法

1.2.1 石刁柏基因組DNA提取 石刁柏基因組DNA的提取參照文獻[18]方法進行改良，分別提取石刁柏2個品種UC309和TD818的雌雄各3個單株基因組DNA。

1.2.2 石刁柏基因組中Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子的擴增及分析 PCR的擴增體系均為：25 μL的反應(yīng)體系中：H2O2 18.9 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL （各2.5 mmol/L），上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L），Taq酶 0.1 μL（5 U/μL），1 μL的基因組DNA（約200 ng）。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，52 ℃復性 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃再延伸 10 min；4 ℃保存。取擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳結(jié)果用OLYMPUS數(shù)碼相機在紫外燈下進行觀察拍照后參照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）的說明書進行擴增產(chǎn)物回收。感受態(tài)細胞的制備、轉(zhuǎn)化、陽性克隆的篩選鑒定參照Sambrook等[19]；樣品送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.2.3 反轉(zhuǎn)座子序列異質(zhì)性及聚類分析 利用DNAStar軟件進行開放閱讀框（Open reading frame，ORF）的查找，分析獲得序列的反轉(zhuǎn)座子序列特征；利用DNAMAN軟件將Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列進行比對，統(tǒng)計并分析序列堿基置換結(jié)果；利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反轉(zhuǎn)座子s101366和s107518的克隆與測序分析

利用已設(shè)計的兩對特異引物分別對提取的石刁柏（UC309、TD818）的雌、雄各3個單株及文竹中的基因組DNA共13個模板進行PCR擴增，分別擴增出大小約為635和658 bp的產(chǎn)物，其大小均分別與預(yù)期條帶大小一致（圖1，圖2）。

將目的條帶分別進行回收測序結(jié)果表明，對石刁柏及文竹中的s101366進行擴增并克隆測序，分別獲得了52條和3條序列，其中雌株序列27條，雄株序列25條，序列長度范圍為630～636 bp；而分別對石刁柏及文竹中的s107518進行擴增并克隆測序，各獲得了57條和2條序列，其中雌株序列27條，雄株序列30條，序列長度范圍為653～661 bp。

通過NCBI中Blast對所獲得的石刁柏的109條序列進行搜索，結(jié)果表明，s101366的52條序列中有42條序列包含Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，有10條序列包含RNA酶保守區(qū)序列；s107518的57條序列中有51條序列包含Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)。因此，進一步證明所獲得的兩個序列屬于Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子序列。

2.2 反轉(zhuǎn)座子s101366和s107518異質(zhì)性分析

利用DNAMAN軟件將克隆出的石刁柏52條s101366序列進行多序列比對并統(tǒng)計分析堿基變異（圖3），結(jié)果表明，序列的一致性為92.44%，該序列中有326個突變位點，有67處發(fā)生了單堿基置換，32處發(fā)生了雙堿基置換，43處發(fā)生了多堿基置換，其中共發(fā)生了2 082次堿基轉(zhuǎn)換、508次堿基顛換、25個T缺失、86個G缺失和46個A缺失，有80%的堿基置換為轉(zhuǎn)換，20%的堿基置換為顛換。堿基轉(zhuǎn)換中T？圮C占51%，G？圮A占49%。

利用DNAMAN軟件將克隆出的石刁柏57條s107518序列進行多序列比對并統(tǒng)計分析堿基變異，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)序列的一致性為92.13%，該序列中有227個突變位點，單堿基置換的有80處，雙堿基置換的有35處，多堿基置換的有23處，其中共發(fā)生了3 039次堿基轉(zhuǎn)換、760次堿基顛換、6個T缺失、2個G缺失、17個A缺失和23個C缺失，有80%的堿基置換為轉(zhuǎn)換，20%的堿基置換為顛換。堿基轉(zhuǎn)換中T？圮C占51%，G？圮A占49%。結(jié)果表明，兩個石刁柏反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列異質(zhì)性主要是由于堿基轉(zhuǎn)換（T？圮C）造成的。

2.3 反轉(zhuǎn)座子s101366和s107518序列聚類分析

通過DNAMAN軟件對s101366和s107518的序列分別進行多序列比對，其序列一致性分別為92.12%和92.08%。利用MEGA軟件對s101366和s107518序列構(gòu)建進化樹（圖5、圖6），從系統(tǒng)進化樹中可以看出，兩個反轉(zhuǎn)座子序列各聚類為兩個大組。據(jù)序列的分布情況可知，反轉(zhuǎn)座子s101366和s107518在石刁柏的品種及的雌、雄株性別之間并未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。石刁柏兩個品種中的s101366和s107518序列分別與其近緣同屬的文竹中的s101366和s107518序列也沒有顯示出明顯差異；文竹的一個單克隆As2和另外兩個單克隆As1和As3分別分在了GroupⅠ和GroupⅡ，說明即使同一植物中相同類型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列也存在一定的差異，且有時種內(nèi)的異質(zhì)性差異會大于種屬之間。

3 小結(jié)與討論

反轉(zhuǎn)座子具有高度異質(zhì)性的特征，其異質(zhì)性主要來源于堿基的缺失、突變、插入和置換，且堿基置換是主要的異質(zhì)性來源。本研究分析的兩個反轉(zhuǎn)座子的異質(zhì)性也主要是來源于堿基置換，其中，堿基轉(zhuǎn)換的頻率要明顯高于堿基顛換的頻率。早期的研究也表明，不論是核內(nèi)還是核外的基因，基因突變中轉(zhuǎn)換的頻率都要遠遠超出顛換的頻率。而且，一般情況下，轉(zhuǎn)換與顛換的概率比為2∶1，這主要是由于密碼子的3個位點所受到的選擇壓力不同，從而造成突變偏向于密碼子的第三位點[20，21]。另外，認為甲基化CG序列是基因突變的一個熱點，因為甲基化的C可經(jīng)過脫氨基的作用轉(zhuǎn)換為T，也提高了堿基轉(zhuǎn)換的頻率[22，23]。

本研究對序列的聚類分析結(jié)果表明，兩個Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子在品種、性別、單克隆及近緣種之間的序列均未發(fā)現(xiàn)明顯的特異性，甚至雌雄同株的近緣種文竹的3個克隆序列也未聚為一組，說明所分析的兩個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的保守性較強，無論是從雌雄同株向雌雄異株的垂直演化還是不同品種間的橫向傳遞過程中，產(chǎn)生了大量的堿基置換、插入和缺失的變異。但是其變異呈現(xiàn)隨機性而均未表現(xiàn)出有規(guī)律的變異，這也反映了相同植物類型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守性較強，同一植物中的相同類型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列變異比較大，甚至種內(nèi)異質(zhì)性差異會大于種間[24]，這種規(guī)律是否在石刁柏整個基因組的反轉(zhuǎn)座子中呈現(xiàn)普遍性還需要進一步分析。

參考文獻：

[1] YAMPOLSKY C，YAMPOLSKY H. Distribution of sex forms in the phanerogamic flora[J].Bibliotbeca Genet，1966，3：1-62.

[2] RENNER S S，RICKLEFS R E. Dioecy and its correlates in the flowering plants[J].Am J Bot，1995，82：596-606.

[3] KUMAR S，KUMARI R，SHARMA V. Genetics of dioecy and causal sex chromosomes in plants[J].J Genet，2014，93（1）：241-77.

[4] BULL J J.Evolution of Sex Determining Mechanism[M].Menlo Park：Benjamin-Cummings，1983.

[5] 徐 玲，楊 靜，劉 林，等.植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2012，24（6）：42-46.

[6] NOMA K，OHTSUBO E，OHTSUBO H. Non-LTR retrotransposons（LINEs） as ubiquitous components of plant genomes[J].Molecular and General Genetics，1999，261（1）：71-79.

[7] YU J，HU S，WANG J，et al. A draft sequence of the rice genome（Oryza sativa L.ssp. indica）[J].Science，2002，296（5565）：79-92.

[8] LING H Q，ZHAO S，LIU D，et al. Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticumurartu[J].Nature，2013，496（7443）： 87-90.

[9] FESCHOTTE C，JIANG N，WESSLER S. Plant transposableelements：Where genetics meets genomics[J].Nat Rev Genet，2002， 3（5）：329-341.

[10] UMEZU K，HIRAOKA M，MORI M，et al. Structural analysis of aberrant chromosomesthat occur spontaneously in diploid Saccharomyces cerevisiae：Retro-transposon Ty1 plays a crucial role in chromosomal rearrangements[J].Genetics，2002，160：97-110.

[11] MORRISH T A，GARCIA-PEREZ J L，STAMATO T D，et al. Endonuclease-independent LINE-1 retrotranspositionatmammaliantelomeres[J].Nature，2007，446：208-212.

[12] 李書粉，李 莎，鄧傳良，等.轉(zhuǎn)座子在植物XY性染色體起源與演化過程中的作用[J].遺傳，2015，37（2）：157-164.

[13] WANG J，NA J K，YU Q，et al. Sequencing papaya X and Yhchromosomes reveals molecular basis of incipient sex chromosome evolution[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（34）：13710-13715.

[14] LPTIEN H. Identification of the sex chromosome pair in asparagus（Asparagus officinalis L.）[J].Zeitschriftfür Pflanzenzü- chtung，1979，82：162-173.

[15] DENG C L，QIN R Y，WANG N N，et al. Karyotype of asparagus by physical mapping of 45S and 5S rDNA by FISH[J].J Genet，2012，91（2）：209.

[16] 高武軍，張小莉，尹為治.蘆筍性染色體的細胞學研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2008（10）：116-120.

[17] LI S F，GAO W J，ZHAO X P，et al. Analysis of transposable elements in the genome of Asparagus officinalis from high coverage sequence data[J].PLoS One，2014，9（5）：e97189.

[18] 鄒喻蘋，葛 頌，王曉東.系統(tǒng)與進化植物學中的分子標記[M].北京：科學出版社，2001.

[19] SAMBROOK J，F(xiàn)RITSCH EF，MANIATIS T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual[J].NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[20] 丁 波，張亞平.人與大猩猩，黑猩猩和猩猩親緣關(guān)系的探討[J].遺傳學報，1999，26（6）：604-609.

[21] DASSANAYAKE M，OH D H，HAAS J S，et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula[J].Nature Genetics，2011，43（9）：913-918.

[22] GREENBERG B D，NEWBOLD J E，SUGINO A. Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA[J].Gene，1983，21（1）：33-49.

[23] HORAI S，HAYASAKA K. Intraspecific nucleotide sequence differences in the major non-coding region of human mitochondrial DNA[J].Am J Human Genetics，1990，46（4）：828-834.

[24] STEINHAUER D A，HOLLAND J J. Direct method for quantitation of extreme polymerase error frequencies at selected single base sites in viral RNA[J].J Virology，1986，57（1）：219-228.