楊 敏，黃 巧，陳良標

(上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用省部共建教育部重點實驗室，上海201306)

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南極魚Ⅲ型抗凍基因真核表達質(zhì)粒的構建及其細胞表達

楊 敏，黃 巧，陳良標*

(上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用省部共建教育部重點實驗室，上海201306)

為了探討多聚AFPⅢ的作用機制，從南極魚Lycodichthysdearborni的多聚三型抗凍蛋白基因LD12cDNA中克隆得到AFPⅢ的四聚體，命名為LD4，并構建真核表達質(zhì)粒Tol2-actin-LD4-2A-EGFP。將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到斑馬魚細胞系ZF4中，發(fā)現(xiàn)LD4可以在ZF4中大量表達并且能夠減少斑馬魚細胞在低溫脅迫下的死亡率。通過對不同處理溫度(28、18、10℃)下的WT、EGFP和LD4細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，找出26個表達差異轉(zhuǎn)錄因子，其中I3MB13、ZNF687b等表達上調(diào)，JUN、Cremb等表達下調(diào)，并且通過熒光定量PCR的驗證。通過KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)，這些差異性基因主要參與細胞凋亡、細胞周期、增殖等調(diào)節(jié)通路。采用 Annexin V-PE/7-AAD雙染色法對3種不同溫度下的WT、EGFP和LD4細胞進行細胞凋亡檢測，結(jié)果顯示，LD4在低溫下與對照組相比凋亡率沒有顯著差異，說明LD4可能是通過其他通路而不是通過抑制細胞凋亡來抵御低溫脅迫，這為LD4作用機制的進一步研究提供了理論基礎。

多聚Ⅲ型抗凍蛋白；斑馬魚細胞系；轉(zhuǎn)錄組測序；細胞凋亡

抗凍蛋白(antifreeze proteins，AFPs)存在于很多種生物體中，如魚類、昆蟲、植物、細菌和真菌?？箖龅鞍追肿泳哂袛U展性質(zhì)，立體結(jié)構上有一塊極易與冰晶水分子相互作用的表面區(qū)域，從而阻止冰晶的進一步生長，進而非線性地降低溶液的冰點，但不影響溶液的熔點，這導致熔點與冰點之間出現(xiàn)差值，這一現(xiàn)象被稱為熱滯效應(thermal hysteresis activity，THA)[1]。生活于地球南北兩極的魚類依靠體內(nèi)特殊的抗凍蛋白使體液的冰點降低到環(huán)境溫度以下，從而使它們的體液保持液體狀態(tài)，保護細胞不被冰晶傷害。

目前在極地的魚中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種不同類型的抗凍蛋白[2]，其中Ⅲ型抗凍蛋白(AFPⅢ)起源于唾液酸合成酶。Ⅲ型抗凍蛋白是一個64個氨基酸組成的具有一個球形分子結(jié)構域(AFPⅢ domain)的分子[3]，有5個(Gln9、Asn14、Thr15、Thr18、Gln44)主要的保守親水殘基組成了一個冰晶結(jié)合平面，這一平面可能與水分子形成氫鍵而抑制冰晶的生長。Wang等[4]從南極Lycodichthusdearborni(LD)的血液中發(fā)現(xiàn)了一種135個氨基酸，具有2個AFPⅢ domain的蛋白，命名RD3。研究表明，單位重量的LD2抑制冰晶的能力超過單個結(jié)構域的AFP Ⅲ(RD1和RD2)[5]。Nishimiya等[6]以L.dearborni中自然存在的AFPⅢ二聚體RD3的N端和C端作為單體，按照14ku二聚體抗凍蛋白的組成方式，人工合成含有不同數(shù)量的N端或C端單體的AFPⅢ的二聚體、三聚體和四聚體，通過熱滯后活性和冰晶形態(tài)的測定發(fā)現(xiàn)，同一溶度下分子量大的AFPⅢ抗凍活性明顯得到提高。在這種魚中克隆AFP Ⅲ基因家族發(fā)現(xiàn)，L.dearborni魚內(nèi)的抗凍蛋白基因存在一種多結(jié)構域化的分子進化的現(xiàn)象。除了大部分基因編碼含一個AFPⅢ結(jié)構域的基因外，還有分別編碼2個結(jié)構域[7]和12個結(jié)構域的基因，這種多結(jié)構域化的進化趨勢可能賦予含有該基因的魚類具有更高效的抗凍效果。

本實驗室一直致力于研究在南極酷寒環(huán)境下，南極魚的適應性進化和抗寒的分子機制，并且在2004年發(fā)現(xiàn)了LD12。LD12是一個287kb的cDNA克隆，由12個串聯(lián)重復的片段構成，每一個片段編碼一個61個氨基酸(aa)的Ⅲ型抗凍蛋白分子和一個9aa的連接子[8]。因此，這種獨特的多聚基因結(jié)構可能是魚類基因組在適應極端寒冷的環(huán)境中采取的一種普遍方式。為了闡述AFPⅢ多聚化對動物耐寒性的影響，本試驗從南極魚L.dearborni的多聚三型抗凍蛋白基因LD12cDNA中克隆得到四聚體(LD4)，以斑馬魚細胞ZF4為體系，從存活率、表達差異轉(zhuǎn)錄因子分析和細胞凋亡等方面對LD4基因的作用機制做了初步的探討，以期為以后的研究提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

南極魚綿鳚科(L.dearborni)從南極McMardo海灣通過鐵網(wǎng)誘捕獲得并保存于液氮中運回。

1.1.2 試劑及試劑盒

轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Scientific TurboFect)，細胞培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，胎牛血清(Gibco 公司)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ (NEB公司)，臺酚藍染色試劑盒(生工)，凋亡試劑盒(BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1 構建載體中的引物設計

采用Premier 6.0軟件設計引物，并在引物的5′端添加限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位點。引物序列F: CGAATTCATGAAGTCAGTTGT；R：GGATCCCTCATAGTTTGGATC。

1.2.2 細胞的復蘇、傳代及凍存

從液氮中取出凍存細胞立即放入28℃水浴，快速融解后1000r·min-1離心5min，棄上清，加入5mL含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹吸混勻后移入培養(yǎng)皿于28℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞達到80%融合時以1∶2進行傳代。選3～6代細胞以5×106mL-1進行凍存，凍存前一天更換新鮮培養(yǎng)基，凍存液為10% DMSO+90%完全培養(yǎng)基，凍存過程為4℃(30min)、-20℃(30min)、-80℃過夜后投入液氮長期保存。

1.2.3 ZF4細胞系轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細胞系的獲得

挑取測序正確的單菌落擴大培養(yǎng)后，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒后于-20℃保存。轉(zhuǎn)染前24h，于24孔板中，每孔加入5×104個細胞，放入1mL DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)，吹吸混勻后移入28℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞達到70%～90%匯合度時，將1μg 質(zhì)粒DNA和100μL無血清培養(yǎng)基混勻，然后加入2μL轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻。室溫中放置15～20min，形成轉(zhuǎn)染復合物。然后把轉(zhuǎn)染復合體緩緩加入到每孔的培養(yǎng)液中，輕搖培養(yǎng)板，混勻后，28℃培養(yǎng)箱中置7～9h。更換新鮮的含血清和雙抗的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號。

轉(zhuǎn)染過后的ZF4細胞進行24孔擴大培養(yǎng)，加入G418篩選成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞，方法為：首先要確定G418的致死濃度，本試驗G418致死濃度為1000mg·mL-1，篩選一周后藥量減半，維持濃度500mg·mL-1直到大部分未成功轉(zhuǎn)染細胞死亡，并且轉(zhuǎn)染成功細胞進行了擴大培養(yǎng)，藥物篩選時間大概要2～3周。

1.2.4 臺盼藍測細胞存活率

胰酶消化斑馬魚細胞，制備單細胞懸液，并作適當稀釋。細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9∶1混合混勻(終濃度0.04%)。在2min內(nèi)，用全自動細胞計數(shù)分析儀計算細胞存活率。

1.2.5 低溫處理后RNA sequence分析

把WT、EGFP、LD4細胞設置不同的溫度梯度進行低溫處理。處理溫度為28℃、18℃ 2d，18℃ 2d然后10℃ 2d。低溫處理后分別對細胞進行RNA提取，然后進行建庫和測序分析。

1.2.6 流式細胞儀進行凋亡檢測

把WT、EGFP、LD4細胞分別放在28℃、18℃，2d、18℃2d然后10℃處理2d 后，用流式細胞儀進行檢測分析。方法：(1)用不含EDTA的胰酶消化后于300g，4℃離心5min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性；(2)用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均在300g，4℃離心5min，收集1×105～5×105細胞；(3)加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞；(4)加入5μL PE Annexin V和5μL 7-AAD，輕輕混勻；(5)避光、室溫反應10min；(6)加入400μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻，樣品在1h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達質(zhì)粒的構建及鑒定

以Tol2轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒載體骨架為基礎，構建了斑馬魚細胞系表達載體(圖1-A)。表達載體通過菌液PCR的驗證(圖1-B)，同時通過菌落測序后，確認連接方向正確。經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后出現(xiàn)分子量分別為7.2kb 和0.89kb 的2條帶，正好與質(zhì)粒載體和LD4基因的分子量一致(圖1-C)，證實表達載體Tol2-actin-LD4-2A-EGFP構建成功。

A，斑馬魚細胞系表達載體圖譜；B，菌液PCR鑒定；C，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定A，Zebrafish cell expression vector map; B，Identification of bacteria PCR; C，double enzyme digestion of LD4gene in eukaryotic expression vector

2.2 表達載體轉(zhuǎn)染斑馬魚細胞及蛋白表達

表達載體LD4和EGFP轉(zhuǎn)染到斑馬魚細胞系ZF4中，顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖2-A)。用抗LD4抗體進行Western Blot 檢測(圖2-B)，證明LD4蛋白在ZF4細胞中高效表達。

2.3 臺盼藍測定低溫處理后存活率的結(jié)果

利用臺盼藍技術，把LD4、EGFP、WT在28℃培養(yǎng)箱中放置過夜后，將其放入10℃低溫培養(yǎng)箱2和3d，染色后記錄下存活率。結(jié)果顯示，與EGFP、WT相比，轉(zhuǎn)LD4斑馬魚細胞存活率高(圖3)。

A，熒光顯微鏡下(20×10)觀察表達載體轉(zhuǎn)染斑馬魚細胞圖 (a、b分別為轉(zhuǎn)染LD4細胞明場、熒光，c、d分別為轉(zhuǎn)染EGFP細胞明場、熒光)；B，為斑馬魚細胞系中LD4蛋白的Western Blot 檢測，泳道從左到右分別是轉(zhuǎn)染LD4、EGFP、WT的細胞裂解液A，The expression of LD4gene in zebrafish cell lines(a，b: normal light and green light of LD4cell，c，d: Normal light and green light of EGFP cell); B，The Western Blot detection of LD4，the lanes from left to right were cell lysates of transfected p-LD4-EGFP，the cell lysates of transfected with empty vector and wild type cells，respectively

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析及實時定量PCR鑒定

對不同處理溫度下(28℃、18℃、18℃后10℃)的WT、EGFP和LD4細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，找出了26個表達差異轉(zhuǎn)錄因子，其中I3MBT13、ZNF687b等表達上調(diào)，JUN、Cremb等表達下調(diào)(圖4-A)。并且找出基因表達差異較大，通過熒光定量PCR進行驗證(圖4-B)

2.5 用流式細胞術檢測凋亡的分析結(jié)果

我們通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，低溫的條件下，有大量的與凋亡相關的基因表達下調(diào)，所以我們猜想LD4是通過抑制凋亡的途徑對細胞起到保護的作用。為了驗證我們的猜想，我們用流式細胞儀檢測了低溫條件下的細胞凋亡情況(圖5)。數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，LD4在低溫的條件下沒有明顯的變化。結(jié)果證實，LD4不是通過抑制凋亡的途徑對細胞起到保護作用的。

*表示差異顯著(P<0.05)。下同*represents the significant difference at the level of 0.05.The same as below

A，測序分析熱圖；B，熒光定量PCR鑒定A，Sequencing analysis of heat map; B，F(xiàn)luorescence quantitative PCR identification

圖5 流式細胞儀檢測的不同溫度下細胞凋亡數(shù)量百分比Fig.5 Flow cytometry detection of apoptosis percentage at different temperature

3 討論

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，冬天的寒潮經(jīng)常造成大量成魚的死亡，羅非魚因為不能耐受低于10℃低溫而影響在我國的養(yǎng)殖范圍。因此，有必要深入研究魚類的抗寒機制，其中研究LD4基因抵抗低溫的分子機制，對抗寒機制的深入了解以及揭示抗寒關鍵基因具有重要的理論意義，也可以為LD4基因的改進和利用奠定基礎。

我們構建actin啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染斑馬魚ZF4細胞系，篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞系。用特異抗體對LD4的蛋白表達量進行鑒定，篩選具有高表達量的細胞系。在與對照組WT、EGFP相比，低溫脅迫的條件下LD4的存活率大于對照組，由此鑒定出LD4在斑馬魚細胞中能顯著增強細胞的抗寒能力。對上述低溫處理的細胞系用二代高通量測序進行轉(zhuǎn)錄組的比較研究，鑒定LD4轉(zhuǎn)基因細胞系與非轉(zhuǎn)化細胞之間在低溫誘導基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，鑒定LD4基因引起的基因表達譜的改變，推測可能的信號通路，并對信號通路進行驗證?，F(xiàn)在我們初步排除LD4是通過凋亡途徑抵御低溫脅迫。下一步試驗我們將用LD4抗體對低溫誘導的和非低溫誘導的LD4細胞系進行免疫共沉淀，用蛋白質(zhì)譜LC-MS/MS初步測定與LD4相互作用的蛋白。用熒光共定位或酵母雙雜交等方法驗證與LD4相互作用的蛋白；在此基礎上確定抑制低溫下細胞凋亡的信號通路，明確揭示其作用通路后可作用于漁業(yè)或是其他農(nóng)作物的育種實踐。

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[4] WANG X, DEVRIES A L, CHENG C H C.Antifreeze peptide heterogeneity in an antarctic eel pout includes an unusually large major variant comprised of two 7kD a type Ⅲ AFPs linked in tandem[J].BiochimicaetBiophysicaActa, 1995, 1247(2): 163-172.

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YU J, CHENG C H C, DEVRIES A L, et al.Characterization of a multmier type Ⅲ antifreeze protein gene from the antarctic eel pout(Lycodichthysdearborni)[J].JournalofGenetics&Genomics, 2004, 32(8):789-794.(in Chinese with English abstract)

(責任編輯 張 韻)

Construction of type Ⅲ antifreeze protein eukaryotic expression plasmid and expression in zebrafish cell line

YANG Min，HUANG Qiao，CHEN Liang-biao*

(CollegeofFisheriesandLifeSciences，KeyLaboratoryofAquacultureResourcesandUtilization，MinistryofEducation，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)

To elucidate the AFPⅢ multimerization molecular mechanisms on cold tolerance，we cloned tetramer (LD4) of the type Ⅲ AFP from a multimer type Ⅲ antifreeze protein geneLD12cDNA which was characterized from the Antarctic eelpout (Lycodichthysdearborni).The eukaryotic expression plasmid Tol2-actin-LD4-2A-EGFP was constructed and transfected into zebrafish cells (ZF4).It was found thatLD4was abundantly expressed in ZF4cell line and reduced mortality of zebrafish cells under low temperature stress.Transcriptome sequencing and gene expression analysis were carried out at WT，EGFP andLD4cells under different processing temperatures (28℃，18℃ for 2days，18℃ for 2days and 10℃ for 2days)，the results indicated 26differentially expressed transcription factors，in which I3MB13and ZNF687b were up-regulated and JUN and Cremb were down-regulated.The expression patterns of 26selected genes were verified by qRT-PCR (quantitative real-time PCR).Based on the KEGG pathway analysis，the transcription factors were suggested to be involved in apoptosis，cell cycle and proliferation regulation.So，AnnexinV-PE/7-AAD double staining was used to detect the effect ofLD4on apoptosis.Unfortunately，apoptosis rate was not significantly decreased inLD4cells compared with the control group (EGFP and WT).That is，LD4might be involved in another channel rather than inhibiting apoptosis to resist low temperature，which provides a certain theoretical basis for further research on the mechanism ofLD4.

multimer type Ⅲ antifreeze protein; zebrafish cell line; transcriptome sequencing; cell apoptosis

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.09

2016-02-29

國家自然科學基金 (31572611)

楊敏(1989—)，女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事南極魚抗凍蛋白機制研究。E-mail: ymcassie@foxmail.com

*通信作者，陳良標，E-mail: lbchen@shou.edu.cn

S931.5;Q786

A

1004-1524(2016)11-1862-05

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1862-1866

http://www.zjnyxb.cn

楊敏，黃巧，陳良標.南極魚Ⅲ型抗凍基因真核表達質(zhì)粒的構建及其細胞表達[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28(11)： 1862-1866.