郝力力，李 銳，段 玲，賀 亮

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州310021； 3.國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海201203)

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四川紅原縣牦牛隱孢子蟲感染情況分子流行病學(xué)調(diào)查

郝力力1，李 銳2，段 玲1，賀 亮3，*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州310021； 3.國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海201203)

為調(diào)查紅原地區(qū)牦牛隱孢子蟲感染情況，采用巢式PCR對(duì)采自紅原縣的216頭份牦牛糞便進(jìn)行了檢測(cè)(其中包括腹瀉糞便樣本18份)。該地區(qū)牦牛隱孢子蟲總感染率為14.8%，其中Cryptosporidiumbovis感染率為3.7%，C.ryanae感染率為5.1%，C.andersoni感染率為6.0%，而腹瀉樣本并未檢出隱孢子蟲。以上結(jié)果表明，牦牛是隱孢子蟲的天然宿主，但該實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)隱孢子蟲和牦牛腹瀉間存在明顯相關(guān)性，隱孢子蟲和牦牛腹瀉之間的關(guān)系需要后續(xù)研究來(lái)進(jìn)一步闡明。

牦牛；隱孢子蟲；腹瀉

隱孢子蟲是一種能引起人和動(dòng)物腹瀉的重要機(jī)會(huì)性原蟲，由其引起的隱孢子蟲病是一種人獸共患病。它具有廣泛的宿主類型，可以寄生于哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類等240多種動(dòng)物(包括人)，并且可通過(guò)水源、食物、空氣等多種途徑傳播[1]。隱孢子蟲主要感染幼兒、幼畜以及免疫缺陷的人畜，免疫系統(tǒng)發(fā)育正常的人和動(dòng)物也能感染，隱孢子蟲病已被列為人類最常見(jiàn)的6種腹瀉疾病之一[2]，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

我國(guó)是世界擁有牦牛數(shù)量最多的國(guó)家，約有1400多萬(wàn)頭，占世界牦?？倲?shù)的95%以上。四川省是牦牛大省，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)紅原地區(qū)牦牛春夏之際經(jīng)常發(fā)生季節(jié)性腹瀉，并常伴有血便，不僅大大降低了牦牛的生產(chǎn)性能，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致病畜死亡，給牧民造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，本課題擬對(duì)紅原地區(qū)牦牛進(jìn)行隱孢子蟲分子流行病學(xué)調(diào)查，以確定該地區(qū)流行的隱孢子蟲種類，為紅原地區(qū)牦牛隱孢子蟲病的防控和畜牧業(yè)的健康發(fā)展奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備和試劑

糞便DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Kit)，臺(tái)式高速離心機(jī)(eppendorf 5402型)，Bio-Rad伯樂(lè)梯度PCR儀(PTC240型)，水平電泳儀(BG-subMIDI型，北京百晶公司)，2×EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金公司)和2.5%重鉻酸鉀溶液(自制)。

1.1.2 糞便樣本的采集

采集新鮮牦牛糞便30～40g，立即放于80mL離心管中，加體積1.5倍的無(wú)菌蒸餾水配制的2.5%重鉻酸鉀溶液4℃保存。樣本總量為216頭份，其中腹瀉糞便樣本18份。

1.2 方法

1.2.1 改良抗酸染色

將糞樣混合均勻，從中取5～10g置小燒杯中，加少量無(wú)菌蒸餾水浸泡30min，然后搗碎糞便成泥狀，再加適量水充分?jǐn)噭?，銅篩過(guò)濾。濾液置離心管中以1006g離心10min，棄去上清液。取濃集糞樣涂片，按照Lindsay等[1]報(bào)道的方法進(jìn)行染色，于1000倍鏡下觀察拍照。

1.2.2 飽和蔗糖溶液漂浮法富集隱孢子蟲卵囊

取糞樣10g加20倍量的無(wú)菌蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，先后?0目和130目金屬篩過(guò)濾，濾液置于離心管中以1006g離心10min，棄上清，再加入50mL飽和蔗糖溶液，用玻璃棒攪拌均勻，再以1006g離心10min，用自制的鐵絲網(wǎng)吊環(huán)蘸取表層液，然后在裝有約100mL自來(lái)水的燒杯中涮洗，將表層富集的卵囊全部收至燒杯中制成卵囊混懸液，再將卵囊混懸液倒入離心管中以1006g離心10min，棄上清，沉淀用于DNA的提取。

1.2.3 糞便總DNA和富集后卵囊DNA的提取

取混勻后的糞便2g，采用QIAamp DNA Stool Kit大樣本量提取方法提取糞便總DNA;富集后的卵囊按照 QIAamp DNA Stool Mini Kit 說(shuō)明書進(jìn)行操作，取200mg沉淀進(jìn)行提取，提取后電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。

1.2.4 PCR檢測(cè)

先采用彭昊等[2]建立的牛隱孢子蟲的快速檢測(cè)方法，以2g糞便中提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，靶基因?yàn)镮TS-1，片段大小為263bp。PCR陽(yáng)性的樣本采用飽和蔗糖溶液漂浮法富集卵囊后進(jìn)行抗酸染色，觀察是否有卵囊，染色陽(yáng)性則提取富集后含有卵囊的沉淀物總DNA，采用Xiao等[3]方法，根據(jù)隱孢子蟲18S rRNA序列合成2對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR，目的片段長(zhǎng)度大小為570bp左右。PCR反應(yīng)結(jié)束后取2μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳，出現(xiàn)目的條帶的樣本TA克隆后雙向測(cè)序。

1.2.5 進(jìn)化樹(shù)分析

核苷酸序列應(yīng)用Clustal X 1.81進(jìn)行比對(duì)，分子進(jìn)化樹(shù)用MEGA 7構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS-1PCR檢測(cè)結(jié)果

采用彭昊等[2]建立的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，216頭糞便樣本共檢出32頭陽(yáng)性，如圖1所示，在250～500bp間出現(xiàn)目的條帶，目的條帶為263bp?？偢腥韭蕿?4.8%，18份腹瀉樣本均未檢出。

2.2 改良抗酸染色結(jié)果

經(jīng)過(guò)飽和蔗糖溶液漂浮的卵囊直接在顯微鏡下觀察均呈現(xiàn)淡玫瑰紅色(圖2-A，B)，卵囊外圍環(huán)繞有淡綠色的光圈，卵囊形狀為卵圓形。改良抗酸染色后的隱孢子蟲卵囊為卵圓形，卵囊呈深玫瑰紅色(圖2-C，D)，殘?bào)w背景為鮮艷藍(lán)綠色，卵囊對(duì)比分明，32頭ITS-1PCR陽(yáng)性樣本染色后觀測(cè)均為陽(yáng)性。

M，DL 2000marker；1—6，糞便樣本；7，陽(yáng)性對(duì)照；8，陰性對(duì)照M，DL 2000marker; 1-6，F(xiàn)ecal sample; 7，Positive control; 8，Negative control

圖2 飽和蔗糖法分離出的卵囊和改良抗酸法染色后的卵囊Fig.2 Cryptosporidium oocyst under the Shether’s sugar flotation technique and the modified acid-fast stain method

2.3 18s rRNA PCR檢測(cè)結(jié)果

采用Xiao等[3]建立的方法對(duì)染色陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，均擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶為570bp左右，如圖3所示，最右側(cè)為陰性對(duì)照。條帶回收后進(jìn)行TA克隆，對(duì)應(yīng)的每個(gè)回收產(chǎn)物挑選3個(gè)菌落雙向測(cè)序。

2.4 進(jìn)化樹(shù)分析

將32個(gè)18s rRNA PCR陽(yáng)性樣本測(cè)序后，最終得到3個(gè)克隆，采用NCBI blast在線比對(duì)后，分別和牛隱孢子蟲(C.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)和安氏隱孢子蟲(C.andersoni)的同源性較高，均為100%。32個(gè)陽(yáng)性樣本中分別對(duì)應(yīng)牛隱孢子蟲陽(yáng)性樣本8個(gè)，瑞氏隱孢子蟲陽(yáng)性樣本11個(gè)，安氏隱孢子蟲陽(yáng)性樣本13個(gè)，對(duì)應(yīng)216份糞便樣本的感染率分別為3.7%、5.1%和6.0%。將3個(gè)分離株(C.ryanaeHongyuan;C.bovisHongyuan ;C.andersoniHongyuan) 的測(cè)定序列和 GenBank 參考序列(C.parvumAJ493076；C.ryanaeJN40088；C.andersoniJN400881；C.bovisKM873713；C.ubiquitumKT027447；C.suisKJ790244)進(jìn)行種系發(fā)育關(guān)系分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖4所示，3個(gè)分離株均和對(duì)應(yīng)的隱孢子蟲種位于同一分支。實(shí)驗(yàn)中也嘗試了對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，如圖5-A所示。

M，DL 2000marker；1—3，糞便樣本；4，陽(yáng)性對(duì)照；5，陰性對(duì)照M，DL 2000marker; 1-3，F(xiàn)ecal sample; 4，Positive control; 5，Negative control

圖4 三個(gè)分離株在基于18S rRNA 基因構(gòu)建的隱孢子蟲進(jìn)化樹(shù)上的分布Fig.4 Distribution of 3Cryptosporidium spp.isolates in the phylogenetic tree of Cryptosporidium based on 18S rRNA gene

圖5 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序時(shí)出現(xiàn)的雙峰現(xiàn)象(A)及正常的單峰(B)Fig.5 Sequencing results of PCR products with two peaks(A) and single peak(B)

3 討論

隱孢子蟲的檢測(cè)多以18s rRNA基因?yàn)槟康幕?，通過(guò)巢氏PCR擴(kuò)增目的片段[4-5]。和常規(guī)PCR相比，巢式PCR敏感性是常規(guī)PCR方法的40倍以上[6]，在本實(shí)驗(yàn)中，以ITS-1為靶基因，先對(duì)糞便樣本進(jìn)行初步檢測(cè)，由于產(chǎn)物序列較短，只有263bp，PCR擴(kuò)增效率較高，適合對(duì)糞便樣本進(jìn)行隱孢子蟲的快速初篩。初篩后采取飽和蔗糖漂浮法富集蟲體，提取DNA，再對(duì)18s rRNA 進(jìn)行PCR鑒定，條帶較亮(圖3)。曾嘗試直接提取糞便總DNA后進(jìn)行18s rRNA PCR擴(kuò)增，有些目的條帶十分微弱。這一現(xiàn)象說(shuō)明采用飽和蔗糖法富集蟲卵后，一方面提取的沉淀總DNA中蟲卵DNA含量較多，另一方面除去了大部分雜質(zhì)，提取的總DNA中PCR反應(yīng)抑制物相對(duì)減少，這樣無(wú)疑提高了PCR反應(yīng)效率，也同時(shí)提高了檢出率。除此之外，本實(shí)驗(yàn)中部分樣本PCR產(chǎn)物直接測(cè)序時(shí)結(jié)果為雜合雙峰(圖5)，無(wú)法讀出序列，但是PCR產(chǎn)物電泳條帶特異，無(wú)雜帶，這一現(xiàn)象提示可能存在混合感染，也就是說(shuō)，PCR產(chǎn)物可能是至少2個(gè)種的隱孢子蟲18s rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物。針對(duì)此現(xiàn)象，曾嘗試多次TA克隆后進(jìn)行測(cè)序，但只能得到同一個(gè)克隆。

隱孢子蟲已被列為人類最常見(jiàn)的6種腹瀉疾病病原之一，紅原地區(qū)春夏之際牦牛經(jīng)常腹瀉，嚴(yán)重時(shí)甚至產(chǎn)生血便。何美琳等[7]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)來(lái)源于川西北阿壩州8縣的1070份牦牛血清中牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirus，BVDV)、牛冠狀病毒(bovinecoronavirus，BCV)和牛輪狀病毒(bovinerotavirus，BRV)進(jìn)行抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，BVDV、BCV和BRV抗體平均陽(yáng)性率分別為44.3%、84.1%和94.4%，表明牦牛普遍感染導(dǎo)致腹瀉的病毒。通過(guò)檢索PubMed發(fā)現(xiàn)，報(bào)道牦牛感染隱孢子蟲的文章只有5篇[8-12]，這5篇報(bào)道中隱孢子蟲感染率分別為24.2%、30.0%、5.26%、4.0%和28.5%，總共檢出了C.andersoni，C.ryanaecattletype，C.ryanaebuffalotype，C.suis-like，C.ubiquitum，C.xiaoi和一個(gè)新基因型，并且存在混合感染的情況，但檢測(cè)的糞便樣本中都沒(méi)有腹瀉樣本。

而在本研究中，隱孢子蟲總感染率為14.6%，216頭糞便樣本中有18份為腹瀉樣本，但是均未檢出隱孢子蟲，原因可能是由于在高原地區(qū)采集樣本的時(shí)間限制，無(wú)法在短時(shí)期內(nèi)收集到較多的腹瀉樣本，而較少的樣本量則無(wú)法說(shuō)明腹瀉牦牛隱孢子蟲的實(shí)際感染狀況。

綜上所述，本研究一方面初步明確了紅原地區(qū)牦牛是隱孢子蟲的天然宿主，檢出了瑞氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲3個(gè)蟲種；另一方面由于采集到的腹瀉糞便樣本數(shù)量較少并且未檢出隱孢子蟲，因此并不能說(shuō)明隱孢子蟲和牦牛腹瀉間存在明顯相關(guān)性，留待收集較多的腹瀉樣本后再做進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Prevalence and molecular identification of Cryptosporidium spp.in yaks in Hongyuan County of Sichuan Province

HAO Li-li1，LI Rui2，DUAN Ling1，HE Liang3，*

(1.CollegeofLifeScience&Technology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China; 2.InstituteofQualityandStandardforAgro-products，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.NationalShanghaiCenterforNewDrugSafetyEvaluationandResearch，Shanghai201203，China)

In order to investigate prevalence ofCryptosporidiumspp.in yaks in Hongyuan County，in this study，Cryptosporidiumisolates from 216fecal samples were identified by nest-PCR method (including 18diarrhea fecal samples).Total infection rate ofCryptosporidiumwas 14.8%.It showed that prevalence ofCryptosporidiumbovis，C.ryanaeandC.andersoniwas 3.7%，5.1% and 6.0%，respectively.However，noCryptosporidiumspp.was detected in 18diarrhea fecal samples.Above results showed that yaks were natural hosts ofCryptosporidiumspp..But in this study，no obvious correlation existed betweenCryptosporidiumspp.and diarrhea，and the relationship betweenCryptosporidiumspp.and diarrhea in yaks should be further explored.

yaks;Cryptosporidiumspp.; diarrhea

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.06

2016-03-04

西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)青年教師基金項(xiàng)目(2016NZYQN34)；國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2014BAD13B03)

郝力力(1980—)，男，山西長(zhǎng)治人，博士，副研究員，研究方向?yàn)榉肿蛹纳x學(xué)。E-mail： leelee_hao@126.com

*通信作者，賀亮，E-mail： microvet@163.com

S855.9+9

A

1004-1524(2016)11-1842-05

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1842-1846

http://www.zjnyxb.cn

郝力力，李銳，段玲，等.四川紅原縣牦牛隱孢子蟲感染情況分子流行病學(xué)調(diào)查[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(11): 1842-1846.