于濤 李鵬飛 房國(guó)梁 楊星雅 溫悅萌 李良 郭妍 田野

1國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）2國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后FNDC5和Irisin水平變化特點(diǎn)

于濤1李鵬飛1房國(guó)梁1楊星雅1溫悅萌1李良1郭妍1田野2

1國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）2國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

目的：探討大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后FNDC5和Irisin隨時(shí)間的變化特點(diǎn)及意義。方法：30只8周齡Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=5）和一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)組（n=25）。運(yùn)動(dòng)組大鼠在坡度為－16度的跑臺(tái)上以17米/分的速度跑90分鐘。在運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的1天、3天、5天、7天和14天分別選取5只大鼠采集尾靜脈血和比目魚肌。通過(guò)ELISA檢測(cè)大鼠血清Irisin水平；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)骨骼肌中FNDC5的表達(dá)；應(yīng)用Western Blot檢測(cè)骨骼肌中PGC1-α蛋白水平以及AMPK的磷酸化。結(jié)果：大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)引起CK活性增加（運(yùn)動(dòng)后第5天，P<0.05）和PGC1-α水平顯著增加；FNDC5的mRNA水平在運(yùn)動(dòng)后的第1天和第3天升高（P<0.05），隨后降低；血清Irisin水平在運(yùn)動(dòng)后第1天增加（P<0.05）；同時(shí)，骨骼肌中AMPK激活。結(jié)論：一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)引起PGC1-α表達(dá)增加，并在運(yùn)動(dòng)后初期通過(guò)調(diào)控大鼠骨骼肌表達(dá)FNDC5引起血清中Irisin含量增加，進(jìn)而通過(guò)激活A(yù)MPK在運(yùn)動(dòng)后的骨骼肌能量代謝中發(fā)揮作用。

FNDC5；Irisin；骨骼?。幌缕屡?；AMPK；PGC1-α

Irisin是Bostrom等2012年發(fā)現(xiàn)的骨骼肌因子。由于它可通過(guò)促進(jìn)白色脂肪棕色化在調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)熱以及能量消耗中發(fā)揮重要作用[1-6]，因此受到廣泛的關(guān)注。Bostrom等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明過(guò)氧化物酶體增殖物激活受

體C輔激活因子1α（PGC1-α）與Irisin變化相關(guān)[2]。PGC1-α在運(yùn)動(dòng)后表達(dá)增加，并調(diào)節(jié)多種運(yùn)動(dòng)相關(guān)的肌肉功能，促進(jìn)機(jī)體適應(yīng)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激。在小鼠骨骼肌中過(guò)表達(dá)PGC1-α，可以誘導(dǎo)膜蛋白含III型纖連蛋白域蛋白（FNDC5）表達(dá)增加，而FNDC5的胞外部分通過(guò)剪切形成Irisin，分泌到血清發(fā)揮生物功能。因此，PGC1-α作為上游因子調(diào)控FNDC5和Irisin的表達(dá)和生物學(xué)功能。然而，自Irisin被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，運(yùn)動(dòng)引起Irisin水平變化的研究結(jié)果卻存在爭(zhēng)議。以Bostrom為代表的學(xué)者觀察到運(yùn)動(dòng)引起受試者血漿中Irisin含量升高[2，7-10]；然而，以Czarkowska-Paczek為代表的研究卻指出大鼠血清的Irisin水平在一次性運(yùn)動(dòng)后未見升高[11-13]。同時(shí)，Nygaard等研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后PGC1-α表達(dá)增加，但是FNDC5的表達(dá)卻并未增高[10]。因此，PGC1-α、FNDC5以及Irisin在運(yùn)動(dòng)后的變化特點(diǎn)和相互關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。

除調(diào)節(jié)白色脂肪棕色化外，Irisin還在骨骼肌中發(fā)揮功能。辛超等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Irisin可引起骨骼肌細(xì)胞C2C12的AMPK磷酸化增加，并且引起細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用增加、脂肪酸氧化增加[14]。然而，關(guān)于運(yùn)動(dòng)引起的Irisin水平變化以及骨骼肌組織中AMPK磷酸化的相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)血清Irisin水平，Irisin前體蛋白FNDC5在骨骼肌中的表達(dá)，以及FNDC5的上游調(diào)控蛋白PGC1-α的水平變化和下游信號(hào)通路AMPK的激活情況，了解下坡跑運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期間Irisin的變化特點(diǎn)和意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ELISA試劑盒包括：Irisin ELISA試劑盒（Phoenix Pharmaceuticals）。主要抗體包括抗pAMPK（cell signaling），PGC1α（abcam），actin抗體（中杉金橋），以及羊抗兔IgG－HRP，羊抗小鼠IgG－HRP等。蛋白提取試劑主要包括：Tris-HCl，Triton X-100，BSA，cocktail蛋白酶抑制劑；RNA提取試劑主要包括：DEPC水，氯仿，異丙醇，75%乙醇，Trizol提取試劑盒；溴化乙錠；瓊脂糖。qPCR試劑包括：第一鏈cDNA合成試劑盒（Invitrogen），KAPASYBRRFASTqPCR試劑盒（KapaBiosystems）。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象以及運(yùn)動(dòng)方案

健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，8周齡，體重270±16 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)在符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼養(yǎng)條件的國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所動(dòng)物房。動(dòng)物隨機(jī)分籠，每?jī)商旄鼡Q墊料，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫25± 2℃，相對(duì)濕度為50%~70%，晝夜周期為12/12小時(shí)。

SD大鼠分為安靜對(duì)照組（C組，n=5）和一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)組（n=25）。下坡跑的動(dòng)物模型參照Armstrong[15]的模型建立。具體為SD大鼠在坡度為－16度的跑臺(tái)上以17米/分的速度跑90分鐘。為促進(jìn)大鼠的運(yùn)動(dòng)，在跑步方向的跑臺(tái)盡頭覆上報(bào)紙，產(chǎn)生黑暗環(huán)境，并在大鼠運(yùn)動(dòng)的反方向跑臺(tái)端加以電壓刺激，但同時(shí)盡量用聲音以及機(jī)械刺激，避免過(guò)多電壓刺激給大鼠帶來(lái)的損傷。一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后的第1天、3天、5天、7天以及14天進(jìn)行大鼠尾靜脈血和比目魚肌取材。

1.3 CK活性檢測(cè)

在大鼠對(duì)照組，以及下坡跑運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)后的不同時(shí)間點(diǎn)（第1天、3天、5天、7天以及14天）取大鼠尾靜脈血，離心后獲得血清，并將血清存于－80℃冰箱待用。大鼠血清中的CK活性檢測(cè)采用上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)的肌酸激酶試劑盒（N－乙酰半胱氨酸法）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

將液氮保存的大鼠比目魚肌放入液氮的研缽內(nèi)迅速研磨至粉狀，加入TRIzol按照提取步驟提取RNA，測(cè)量RNA溶液的OD260值，計(jì)算RNA濃度。用1 μg提取的RNA合成cDNA鏈。從Ensemble/NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取大鼠FNDC5和GAPDH基因的cDNA序列，應(yīng)用在線qPCR引物設(shè)計(jì)工具NCBI Primer-Blast設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行定量PCR。實(shí)驗(yàn)所使用的引物序列如下：

GAPDH引物F：5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3'；R：5'-CGCCAGTAGACTCCACGACA-3'

FNDC5引物F：5'-TCCGAAGCAAGATATGAAACC-3'；R：5'-GGAACCGCCATCAGAAAGA-3'

1.5 Western Blot

將液氮中保存的肌肉組織于冰上加入RIPA裂解液研磨提取組織蛋白，離心獲取上清后進(jìn)行BCA法蛋白定量。以RIPA調(diào)整蛋白濃度，樣品終濃度為4.0 μg/ μl，加入5×蛋白樣品緩沖液，95攝氏度5分鐘。根據(jù)目的蛋白的分子量制膠，常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將膜完全浸沒(méi)于5%BSA-TBST中水平搖床室溫孵育1小時(shí)進(jìn)行封閉。用5%BSA-TBST稀釋一抗（PGC1-α 1：1000，p-AMPKα（Thr172）1︰1000，β-actin 1︰1000），4℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次后相應(yīng)二抗室溫孵育40分鐘（1︰10000）。TBST洗膜3次后ECL顯影，膠片曝光。

1.6 ELISA

根據(jù)Irisin ELISA試劑盒（phoenix pharmaceuticals）說(shuō)明書，進(jìn)行血清中的Irisin水平的檢測(cè)。顯色后在酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)（OD450），制作相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本的濃度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)組間分析采用t檢驗(yàn)。Western Blot的結(jié)果采用Image J進(jìn)行條帶灰度分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)血清CK活性水平變化

在大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后第5天，血清CK活性水平達(dá)到最高值（P<0.05），隨后CK活性降低至對(duì)照組水平。說(shuō)明在下坡跑運(yùn)動(dòng)后的第5天，大鼠存在明顯的肌肉損傷。見圖1。

圖1 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后CK活性在不同時(shí)間點(diǎn)的變化

2.2 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌PGC1-α水平變化

如圖2所示，與對(duì)照組相比，大鼠骨骼肌中的PGC1-α蛋白水平在下坡跑運(yùn)動(dòng)后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯增加（P<0.05）。在對(duì)多次WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行條帶灰度分析后發(fā)現(xiàn)，下坡跑運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)大鼠骨骼肌PGC1-α蛋白表達(dá)持續(xù)增加。

圖2 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌PGC1-α水平變化

2.3 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后FNDC5 mRNA水平隨時(shí)間的變化

如圖3所示，與對(duì)照組相比，大鼠下坡跑運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌中FNDC5的表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后的第1天和第3天顯著增加，隨后降低至對(duì)照組水平（第1天P<0.05、第3天P<0.05）。可見，下坡跑運(yùn)動(dòng)對(duì)Irisin前體FNDC5的表達(dá)存在調(diào)節(jié)作用。

圖3 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后骨骼肌中FNDC5 mRNA水平隨時(shí)間的變化

2.4 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后血清Irisin水平隨時(shí)間的變化

圖4顯示，與對(duì)照組相比，大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后血清中Irisin蛋白的水平在第1天顯著升高（P< 0.05），隨后逐漸降低至對(duì)照組水平，說(shuō)明下坡跑運(yùn)動(dòng)后早期大鼠血清Irisin水平增高。

圖4 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后血清Irisin水平隨時(shí)間的變化

2.5 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌中AMPK的磷酸化水平

如圖5所示，一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌中AMPK在運(yùn)動(dòng)后的第1天明顯增強(qiáng)（P<0.05），隨后逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMPK激活的時(shí)間與Irisin水平升高的時(shí)間基本一致。

圖5 大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)比目魚肌中AMPK磷酸化水平

3 分析與討論

為了研究運(yùn)動(dòng)后機(jī)體恢復(fù)期間Irisin的表達(dá)特點(diǎn)以及意義，我們檢測(cè)了大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)骨骼肌FNDC5 mRNA表達(dá)和血清Irisin蛋白水平變化，以及FNDC5/Irisin的上游調(diào)控蛋白PGC1-α在骨骼肌中的變化。此外，我們還觀察了大鼠下坡跑運(yùn)動(dòng)后AMPK在骨骼肌中的激活水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠下坡跑運(yùn)動(dòng)后骨骼肌PGC1-α水平升高，F(xiàn)NDC5/ Irisin的水平升高。在Irisin水平增加的同時(shí)，我們觀察到大鼠骨骼肌組織中AMPK激活。研究結(jié)果提示，下坡跑運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)PGC1-α--FNDC5/Irisin--AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)能量代謝。

3.1 大鼠下坡跑運(yùn)動(dòng)模型以及一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌PGC1-α表達(dá)影響

運(yùn)動(dòng)后骨骼肌的能量代謝恢復(fù)與適應(yīng)是保證運(yùn)動(dòng)效果的重要環(huán)節(jié)。而運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度是影響運(yùn)動(dòng)效果的重要因素，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加會(huì)引起機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)增加。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的不斷增加也會(huì)引起骨骼肌細(xì)胞通透性增強(qiáng)，使細(xì)胞內(nèi)的肌酸激酶CK溢出細(xì)胞外，導(dǎo)致血清中CK活性增加。相比于平臺(tái)跑運(yùn)動(dòng)，下坡跑運(yùn)動(dòng)會(huì)引起骨骼肌更明顯的損傷[16]。為保證大鼠獲得足夠的運(yùn)動(dòng)刺激，我們選取了Armstrong的下坡跑模型[15]。Toft等在對(duì)青年和老年人離心運(yùn)動(dòng)后CK活性的連續(xù)監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)CK峰值出現(xiàn)在離心運(yùn)動(dòng)后的第5天[17]。我們也在大鼠下坡跑運(yùn)動(dòng)后的第5天觀察到CK活性的峰值。延遲峰值的出現(xiàn)與下坡跑運(yùn)動(dòng)（離心性運(yùn)動(dòng)）引起的運(yùn)動(dòng)后遲發(fā)性骨骼肌纖維的損傷有關(guān)[16]。PGC1-α在機(jī)體的能量代謝中起著重要作用，如調(diào)節(jié)棕色脂肪組織的產(chǎn)熱、調(diào)控線粒體的生成和氧化代謝等[18]。骨骼肌特異性過(guò)表達(dá)PGC1-α的小鼠不易發(fā)生老年性肥胖和糖尿病[19]。缺失骨骼肌PGC1-α的小鼠則明顯表現(xiàn)出高脂飲食葡萄糖不耐受[20，21]。而運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)小鼠和人表達(dá)PGC1-α[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到大鼠骨骼肌中PGC1-α水平在一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后明顯增加（圖2），實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，下坡跑運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)大鼠骨骼肌表達(dá)PGC1-α，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝。

3.2 大鼠一次性下坡跑后Irisin水平變化特點(diǎn)及意義

PGC1-α是調(diào)節(jié)Irisin的上游因子。我們?cè)谟^察到大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后PGC1-α的蛋白水平明顯增加后，進(jìn)一步研究FNDC5的表達(dá)情況以及血清Irisin的水平。Nygaard等研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后PGC1-α表達(dá)增加，但是FNDC5的表達(dá)卻并未增高，提示PGC1-α與FNDC5的表達(dá)存在差異性[10]。我們的結(jié)果顯示：大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌中FNDC5的表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后的第1天和第3天顯著增加，隨后降低至對(duì)照組水平（圖3）。這與PGC1-α水平的變化也不相同。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)血清Irisin含量在大鼠下坡跑運(yùn)動(dòng)后第1天升高，隨后逐漸降低至對(duì)照組水平（圖4），與骨骼肌中的FNDC5表達(dá)的時(shí)相和特點(diǎn)（圖3）相似。我們的結(jié)果說(shuō)明，骨骼肌表達(dá)的FNDC5可能是血液循環(huán)中Irisin的主要來(lái)源，而PGC1-α除在運(yùn)動(dòng)后早期調(diào)節(jié)FNDC5以及Irisin外，還可能參與其它的生物學(xué)功能。

作為細(xì)胞的能量感受器，運(yùn)動(dòng)激活的AMPK可通過(guò)下調(diào)能量合成和促進(jìn)生成能量物質(zhì)的分解，增加機(jī)體的能量供給。體外實(shí)驗(yàn)中，在骨骼肌細(xì)胞中加入Irisin可引起AMPK磷酸化增加，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用增加，脂肪酸氧化增加；而通過(guò)siRNA抑制AMPK的活性，則抑制了上述功能[23]。在觀察到大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后的早期Irisin水平增高后，我們進(jìn)一步研究了AMPK信號(hào)的激活情況。我們?cè)诖笫笠淮涡韵缕屡苓\(yùn)動(dòng)后的第1天觀察到骨骼肌AMPK磷酸化增強(qiáng)（圖5），隨后逐步下降。AMPK的激活與骨骼肌FNDC5和血清Irisin時(shí)間變化基本一致。結(jié)果說(shuō)明，大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)后，Irisin可在早期通過(guò)AMPK調(diào)控運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌能量代謝，促進(jìn)骨骼肌的適應(yīng)和恢復(fù)。

4 結(jié)論

（1）大鼠一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)可引起骨骼肌FNDC5 mRNA表達(dá)和血清Irisin水平增加。（2）FNDC5/Irisin水平的增加與上游的PGC1-α和下游的p-AMPK蛋白表達(dá)增加有關(guān)。

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Changes of FNDC5 and Irisin Level in Rats Following a Single Bout of Downhill Running

Yu Tao1，Li Pengfei1，F(xiàn)ang Guoliang1，Yang Xingya1，Wen Yuemeng1，Li Liang1，Guo Yan1，Tian Ye2
1 China Institute of Sport Science，Beijing 100061，China 2 China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China Corresponding Author：Yu Tao，Email：yutao@ciss.cn

Objective To explore the changes of FNDC5 and Irisin in rats following a single bout of downhill running.Methods Thirty 8-week-old male Spraque-Dawley rats were randomly assigned to a control group（n=5）and a downhill running group（n=25）.Animals in the downhill running group were subjected to treadmill running at－16°slope for 90 minutes at 17m/min.Blood from the tail vein and soleus muscles were extracted from the 5 rats 1 day，3，5，7 and 14 days after the running.The irisin level was measured using ELISA kit，the expression of FNDC5 was determined using the real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，while the protein level of PGC1-α and activation of AMPK were measured using Western blotting.Results The increase of CK activity（on the 5th days after exercises，P<0.05）and PGC1-α protein level was found in the rats following a single bout of downhill running.Moreover，F(xiàn)NDC5 mRNA level elevated 1 day and 3 days after downhill running（P<0.05），then decreased；One day after the downhill running，the serum Irisin level was found elevated and AMPK was activated（AMPK）.ConclusionA single bout of downhill running leads to increase of PGC1-α level，F(xiàn)NDC5 expression and serum Irisin level.AMPK pathway is thus activated and regulates the energy metabolism in skeletal muscles.

FNDC5，Irisin，skeletal muscle，downhill running，AMPK，PGC1-α

2016.06.05

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（基本15-15）

于濤，Email：yutao@ciss.cn