唐金明　王文祥★

缺氧對肺癌細胞BMPR-1A的表達及其運動侵襲能力的影響

唐金明王文祥★

目的 檢測肺癌細胞A549中BMPR-1A在常氧和缺氧條件下的表達； 探討兩種不同培養(yǎng)條件下BMPR-1A的不同表達情況及對肺癌細胞運動侵襲能力的影響。方法 缺氧條件下培養(yǎng)人肺癌細胞A549，Western blot檢測HIF-1α、BMPR-1A的表達情況；同時，劃痕實驗及Transwell實驗檢測在常氧和缺氧條件下由于BMPR-1A 的差異性表達對肺癌細胞運動侵襲能力的影響。結果 缺氧條件下刺激肺癌細胞24h后，HIF-1α蛋白表達明顯上升，BMPR-1A蛋白表達明顯下降； 劃痕實驗及Transwell 實驗結果也顯示肺癌細胞接受缺氧刺激后其運動侵襲能力顯著增強。結論 缺氧增加肺癌細胞運動侵襲的能力，該作用機制可能與缺氧導致BMPR-1A的表達下降有關。

缺氧 肺癌 BMPR-1A 運動 侵襲

骨成型蛋白家族（BMPs）是轉化生長因子（TGF）家族的成員之一，BMPs作為保守蛋白在動物及人類胚胎各系統(tǒng)的發(fā)育過程、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1］。BMPs作為一種分泌型蛋白，其家族受體分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型受體包括BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A，Ⅱ型受體包括ACVRIIA、ACVRIIB、BMPR2，不同受體介導特異性的信號通路［2］。BMPR1A在膽囊癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并且其表達水平受缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)［3-5］；研究證明BMPR1A在肺癌的發(fā)生中起重要作用，但是其在肺癌的侵襲轉移中的作用鮮有報道［6-7］。本研究檢測常氧與缺氧條件下肺癌細胞中BMPR1A的差異表達情況，通過劃痕及Transwell實驗觀察其差異表達與肺癌細胞的運動及侵襲能力的關系。

1　材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞A549 購自湘雅學院細胞中心，BMPR1A抗體（ab38560），HIF-1α抗體（ab51608），β-actin抗體（ab8229）購自Abcam公司，乏氧培養(yǎng)箱購自Thermo公司，Transwell小室購自Corning 公司，Matrigel生物膠購自BD公司。

1.2實驗方法 （1）細胞培養(yǎng)液：含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液，常氧培養(yǎng)條件：37℃、20% 氧氣、5%二氧化碳、75% 氮氣；缺氧培養(yǎng)條件：37℃、1% 氧氣、5%二氧化碳、94%氮氣（乏氧培養(yǎng)箱提供缺氧細胞培養(yǎng)的條件），常氧和缺氧條件下分別同時培養(yǎng)人肺癌細胞A549 24h。（2）蛋白印跡法（Western blot）：采用強裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，總上樣量為50μg，采用流程為：電泳（恒壓100V，90min）、轉膜（濕轉，恒壓120V，90min）、封閉（5%脫脂奶粉的TBST，常溫2h）、孵育一抗（4℃，過夜）、洗膜（5min×3次）、孵育二抗（常溫，2h）、洗膜（10min×3次）、ECL顯色。（3）劃痕試驗：上述常氧及乏氧條件下培養(yǎng)細胞，重懸細胞，計數(shù)，六孔板內(nèi)加入約5×105個細胞，過夜鋪滿。用20μl槍頭劃痕，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，分別放入常氧及乏氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、12、24h取樣，攝照，計算細胞爬行的距離。（4）Transwell 侵襲試驗：常氧和缺氧條件下將A549培養(yǎng)24h，消化細胞，PBS洗2遍，無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至1×105個/ ml。取細胞懸液200μl加入至已鋪Matrigel膠的8μm孔徑Transwell小室上室，將600μl含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基加入下室，分別于常氧和缺氧條件下培養(yǎng)24h后，取出小室，棉簽小心擦去室內(nèi)未轉移細胞，4%多聚甲醛固定12min，結晶紫溶液染色15min，PBS 洗3 遍，顯微鏡下隨機取5個視野，細胞計數(shù)。（5）Transwell 遷移試驗：Transwell 小室不進行Matrigel膠包被，其余步驟同（4）。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1Western blot檢測缺氧對A549的MPR1A及HIF-1α蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，在A549缺氧24h培養(yǎng)后，HIF-1α蛋白的表達水平明顯上升（P＜0.05），相反，MPR1A蛋白的表達水平明顯下降（P＜0.05）；見圖1。

圖1　常氧及乏氧條件培養(yǎng)下HIF-1α及MPR1A蛋白的表達水平（★P=0.0074，★★P=0.0060）

2.2劃痕試驗檢測不同培養(yǎng)條件下細胞的運動能力 劃痕實驗檢測常氧及乏氧細胞24h后劃痕的寬度，以0h的寬度減24h的寬度作為爬行的距離，A549在24h乏氧培養(yǎng)條件下爬行的寬度大于常氧培養(yǎng)條件下爬行的寬度（P＜0.05），見圖2。

圖2　常氧及乏氧條件下細胞遷徙運動的寬度（★P=0.0008）

2.3Transwell 侵襲試驗檢測不同培養(yǎng)條件下細胞遷徙能力 常氧及乏氧條件下細胞遷徙運動的能力（*P=0.0011），見圖3（×400）。

圖3　Transwell 侵襲試驗檢測不同培養(yǎng)條件下細胞遷徙能力

2.4Transwell 遷移試驗檢測不同培養(yǎng)條件下細胞侵襲能力 常氧及乏氧條件下細胞遷徙運動的能力（*P=0.0006），見圖4（×400）。

圖4　Transwell 遷移試驗檢測不同培養(yǎng)條件下細胞侵襲能力

3　討論

侵襲轉移是導致非小細胞肺癌患者死亡的主要原因，而腫瘤周圍微環(huán)境在腫瘤細胞的侵襲轉移中扮演著重要角色［8］。腫瘤細胞周圍的低氧環(huán)境是腫瘤細胞微環(huán)境的重要組成部分之一，其能通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、凋亡、侵襲、轉移及耐藥等促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。

骨形成蛋白受體1A是BMP家族受體之一，最早研究發(fā)現(xiàn)BMPR-1A通過與BMP家族蛋白結合，主要參與胚胎發(fā)育及骨形成，隨后發(fā)現(xiàn)其調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化以及遷移。研究發(fā)現(xiàn)，降低BMPR-1A的表達可促進非小細胞肺癌的增殖及阻礙凋亡［6-7］，缺氧環(huán)境中可下調(diào)胃癌細胞BMPR-1A的表達而促進細胞的侵襲轉移［5］，在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)可介導腫瘤細胞的發(fā)生及侵襲與轉移，并且其表達與轉移程度及浸潤深度成負相關［10］。但缺氧與肺癌細胞中的表達及其與肺癌細胞運動侵襲能力的關系仍未見報道。

本研究通過乏氧培養(yǎng)非小細胞肺癌A549，檢測HIF-ɑ蛋白的表達驗證成功構建乏氧細胞模型。HIF-1是1992年Semenza等在研究紅細胞生成素（EPO）基因表達時發(fā)現(xiàn)的核轉錄因子，由HIF-1α及HIF-1β亞單位構成［11］，HIF-1α只在缺氧細胞核中表達且與多種腫瘤發(fā)展密切相關，故可作為缺氧細胞模型構建成功的標志物［12］。Ei Bizri N等［13］報道，其在缺氧的血管壁中表達明顯下調(diào)的，可促進肺動脈壓力增高及其他變化。在腫瘤中，BMPR-1的表達與HIF-1α表達的關系不明確，本資料結果顯示BMPR-1的表達水平隨HIF-1α表達水平的升高而降低，具體機制需要進一步探討。進一步觀察缺氧條件下BMPR-1A低表達對肺癌細胞運動侵襲過程的影響，劃痕實驗及Transwell遷移實驗證明缺氧條件下肺癌細胞的運動及遷移能力明顯強于常氧條件下的肺癌細胞，同時，Transwell侵襲實驗也證明缺氧培養(yǎng)下的肺癌細胞侵襲能力顯著增強。

綜上所述，缺氧條件下BMPR-1A的下降可能促進肺癌細胞的運動和侵襲。分析缺氧條件下BMPR-1A調(diào)節(jié)肺癌細胞運動及侵襲的分子機制，可作為肺癌侵襲轉移的標志及靶向治療的依據(jù)。缺氧作為腫瘤生長的微環(huán)境，受復雜的分子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)，缺氧導致腫瘤的侵襲和遷移能力增強不僅是BMPR-1A單一個分子所決定的，需要進一步研究闡明BMPR-1A在缺氧條件下促進肺癌細胞遷移侵襲過程中與其他因子的關系，為肺癌的防治提供進一步的理論依據(jù)。

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Objective To explore the expression of BMPR-1A in the human lung cancer cells A549 under normoxia and hypoxia，and investigate the infl uence of the different expression of BMPR-1A under normoxia and hypoxia on the migration and invasion in human lung cancer cells. Methods The lung cancer cells A549 was cultured in normoxic condition and hypoxic condition，The protein levels of HIF-1αand BMPR-1A were determined by Western blot. Infl uence of different expression of BMPR-1A under normoxia and hypoxia on the migration and invasion of A549 was detected via using Wound-repair and Transwell. Results The results of Western blot showed that BMPR-1A was expressed down-regulated and HIF-1α was expressed up-regulated after A549 exposed to hypoxia for 24h； Wound-repair and Transwell assay showed that the migratory and invasive ability were enhanced when the lung cancer cells were exposed to hypoxia for 24h. Conclusions Hypoxia could enhance the migratory and invasive ability of lung cancer cells via down-regulating BMPR-1A.

Hypoxia Lung cancer BMPR-1A migration Invasion

410006湖南省腫瘤醫(yī)院（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院）