葉俏　嚴(yán)婷婷　史向輝　沈潔　李紅勝

熒光定量PCR測(cè)定原發(fā)性干燥綜合征患者血漿循環(huán)DNA及其臨床意義

葉俏嚴(yán)婷婷史向輝沈潔李紅勝

目的 熒光定量PCR測(cè)定原發(fā)性干燥綜合征（pSS）患者血漿循環(huán)游離DNA（cfDNA），分析其在疾病中的意義。方法 選用人類基因組管家基因TaqMan? GeneExpression Assays：ABI 4331182，ID：Hs02758991-g1，采用PCR水解探針模式（Taqman探針）測(cè)定pSS及正常對(duì)照組中血漿cfDNA的值，同時(shí)測(cè)定pSS患者血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），并評(píng)定pSS的活動(dòng)指數(shù)（SSDAI）和損害指數(shù)（SSDDI），分析cfDNA與疾病活動(dòng)之間的關(guān)系。結(jié)果 pSS組cf DNA濃度值為（380.64±259.10）μg/L，正常對(duì)照組cfDNA濃度值為（32.02±16.39）μg/L，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；pSS組中：cfDNA濃度與SSDAI呈正相關(guān)（r=0.533，P＜0.01），與SSDDI無(wú)相關(guān)性（r=0.051，P＞0.05），SSDAI與SSDDI呈正相關(guān)（r=0.412，P＜0.01），pSS組以SSDAI值中位數(shù)4分為2組，31例pSS（SSDAI≥4）的cfDNA濃度值（509.70±215.57）μg/L，35例pSS（SSDAI＜4）的cfDNA濃度值（262.65±186.35）μg/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 血漿cfDNA在pSS患者中升高，與干燥綜合征疾病活動(dòng)性相關(guān)，血漿cfDNA可作為PSS疾病活動(dòng)的觀察指標(biāo)。

血漿循環(huán)游離DNA 原發(fā)性干燥綜合征 原發(fā)性干燥綜合征活動(dòng)指數(shù) 原發(fā)性干燥綜合征損害指數(shù)

原發(fā)性干燥綜合征（primary Sj?gren's syndrome，pSS）是一種以侵犯外分泌腺，尤其是唾液腺及淚腺為主的慢性自身免疫性疾病，以灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為病理特點(diǎn)，臨床上主要表現(xiàn)為干燥性角結(jié)膜炎、口腔干燥癥，還可累及其他多個(gè)器官及系統(tǒng)。目前診斷pSS應(yīng)用最廣的是2002年修訂的國(guó)際分類標(biāo)準(zhǔn)［1］。血漿DNA（plasma DNA）存在于循環(huán)血液中的細(xì)胞外，其能反映機(jī)體循環(huán)游離DNA（cfDNA）的真實(shí)水平。熒光定量RCR因其檢測(cè)精確且能克服檢測(cè)中的低敏感度，常用于病毒的測(cè)定［3］。本研究通過(guò)TAGMAN熒光標(biāo)記探針定量PCR測(cè)定pSS患者血漿cfDNA，分析其與血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白、干燥綜合征活動(dòng)指數(shù)（SSDAI）、干燥綜合征損害指數(shù)（SSDDI）等指標(biāo)相關(guān)性，研究cfDNA在pSS中的應(yīng)用價(jià)值，以期更好地指導(dǎo)臨床工作。

1　臨床資料

1.1一般資料 2010年8月至2014年8月本院住院與門診pSS患者66例（觀察組）均符合2002年干燥綜合征國(guó)際分類標(biāo)準(zhǔn)［1］，其中男5例，女61例；年齡23～77歲，平均年齡（52.3±13.1）歲；初發(fā)37例，非初發(fā)29例，平均病程（57.1±74.5）個(gè)月。正常對(duì)照組35例，其中男9例，女26例；年齡22～66歲，平均年齡（28.9±6.1）歲。以上入組人員均排除感染、肝炎、結(jié)核、創(chuàng)傷、應(yīng)激、嚴(yán)重的心血管及腦血管疾病急性期等因素。

1.2主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒：DNeasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN德國(guó)），TaqMan? Universal PCR Master Mix：ABI 4304437（美國(guó)羅氏），TapMan Control Genomoc DNA（Human）10ng/ul：ABI 4312660（美國(guó)），TaqMan? GeneExpression Assays：ABI 4331182，ID：Hs02758991_g1，PCR儀器ABI stepone plus：ABI（美國(guó)），日立7060/70C70型生化儀（日本）。

1.3觀察指標(biāo) ESR、CRP、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），SSDAI與SSDDI［2］。

2　結(jié)果

2.1兩組cfDNA值比較 見表1。

表1　兩組cfDNA值比較［μg/L，（±s）］

表1　兩組cfDNA值比較［μg/L，（±s）］

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別濃度值觀察組（n=66）380.64±259.10*對(duì)照組（n=35）32.02±16.39

2.2觀察組cfDNA濃度值與SSDDI、SSDAI、ESR、CRP、免疫球蛋白相關(guān)性分析 cfDNA濃度值與SSDAI呈正相關(guān)（r=0.533，P＜0.01），cfDNA濃度值與SSDDI無(wú)相關(guān)性（r=0.051，P＞0.05），SSDAI與IgG呈正相關(guān)（r=0.385，P＜0.01），SSDAI與SSDDI呈正相關(guān)（r=0.412，P＜0.01），其他指標(biāo)之間無(wú)相關(guān)性。

2.3觀察組不同cfDNA濃度值患者比較 觀察組以SSDAI值=4中位數(shù)分為2組，SSDAI≥4共31例cfDNA濃度值（509.70±215.57）μg/L，＜4共35例cfDNA濃度值（262.65±186.35）μg/L，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

本研究所選取樣本均排除腫瘤、感染、創(chuàng)傷、心腦血管慢性病等情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：觀察組cfDNA濃度值為（380.64±259.10）μg/L，正常對(duì)照組cfDNA濃度值為（32.02±16.39）μg/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與E Bartoloni等［4］相關(guān)報(bào)道及本課題組在以往相關(guān)研究［5］中所得結(jié)果一致，再次驗(yàn)證cfDNA在pSS中升高的事實(shí)。且研究［4-5］發(fā)現(xiàn)cfDNA在pSS患者中升高程度高于SLE，說(shuō)明cfDNA與pSS患者相關(guān)性更具特異性。關(guān)于pSS患者cfDNA濃度值升高原因目前尚無(wú)明確的研究結(jié)論，一些文獻(xiàn)報(bào)道［6］提出與自身免疫性疾病活動(dòng)中淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體、炎癥因子致病理生理紊亂及活化淋巴細(xì)胞分泌核酸及染色體外DNA有關(guān)。但是核酸分子的起源仍不清楚，目前認(rèn)為循環(huán)DNA可能是游離的活細(xì)胞主動(dòng)釋放的［7］，然而其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)，本研究觀察到cfDNA濃度值與pSS患者的SSDAI呈正相關(guān)（r=0.533，P＜0.01），與SSDDI無(wú)相關(guān)性（r=0.051，P＞0.05），與ESR、CRP、IgG等其他指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明cfDNA濃度值可作為pSS患者疾病活動(dòng)觀察指標(biāo)。在其他自身免疫性疾病中，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者（SLE）［5-6，8］，抗心磷脂抗體綜合征患者（APS）［9］相關(guān)報(bào)道顯示相應(yīng)患者cfDNA濃度值升高，但與疾病活動(dòng)并無(wú)相關(guān)性，這也說(shuō)明cfDNA濃度作為pSS患者疾病活動(dòng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)的特異性。

此外，本研究不同于其他研究之處在于，將pSS患者組以SSDAI中位數(shù)4為界點(diǎn)分為兩組，得出結(jié)果：SSDAI≥4組共31例cfDNA濃度值（509.70±215.57）μg/L，＜4組共35例cfDNA濃度值（262.65±186.35）μg/L，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。此結(jié)果更進(jìn)一步深入說(shuō)明cfDNA濃度值可反應(yīng)pSS患者疾病活動(dòng)，而關(guān)于cfDNA濃度值下降能否說(shuō)明pSS患者疾病活動(dòng)度降低并將其作為預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，仍有待于擴(kuò)大樣本量和延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，而本研究不足之處在于疾病病程選擇及分級(jí)方面未作詳細(xì)區(qū)分，仍需進(jìn)一步細(xì)化研究。

綜上所述，血漿cfDNA濃度值在pSS患者升高，且與SSDAI相關(guān)，與SSDDI無(wú)關(guān)，可能成為PSS疾病活動(dòng)度判斷指標(biāo)。

［1］Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, et al. For european Study group on classification criteria for Sj?gren's Syndrome. Classification criteria for Sj?gren's syndrome:a revised version of the european criteria proposed by the American-European Consensus Group. Ann Rheum Dis, 2002, 61:554-558.

［2］Vitali C, Palombi G, Baldini C, et al. Sj?gren's Syndrome Disease Damage Index and disease activity index:scoring systems for the assessment of disease damage and disease activity in Sj?gren's syndrome, derived from an analysis of a cohort of Italian patients. Arthritis Rheum, 2007, 56:2223-2231.

［3］Coudray-Meunier C, Fraisse A, Martin-Latil S, et al. A novel high-throughout method for molecular detection of human pathogenic viruses using a nanofluidic real-time PCR system. PLoS One, 2015, 11(1):e0147832.

［4］E Bartoloni, V Ludovini, A Alunno, et al. Increased levels of circulating DNA in patients with systemic autoimmune diseases:A possible marker of disease activity in Sj?gren's syndrome. Lupus, 2011, 20(9):928-935.

［5］葉俏,沈潔,李紅勝.血漿循環(huán)DNA的濃度在原發(fā)性干燥綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中診治中的意義.浙江醫(yī)學(xué),2013, 35(18):1637-1639, 1691.

［6］Chen JS, Chen MCt. Possible origin of extra chromosomal DNA from human lymphocytes following in vitro treatment by phytohemagglutinin. Ann NY Acad Sci, 2001, 945(1):289-291.

［7］Van der Vaart M, Pretorius PJ. Circulating DNA:its origin and fluctuation. Ann N Y Acad Sci, 2008, 1137:18-26.

［8］Chen J, Meister S, Urbonaviciute V, et al. Sensitive detection of plasma/serum DNA in patients with systemic lupus erythematosus. Autoimmunity, 2009, 40(4):307-310.

［9］Korabecna M, Ulcova-Gallova Z, Horinek A. Quantification of circulating fetal DNA as a tool for potential monitoring of pregnant patients with antiphospholipid antibodies. Autoimmunity, 2014, 47(7):473-477.

s】 Objective To detect plasma circulating cell-free DNA levels of patients with primary Sj?gren's syndrome with real-time fluorescent quantitative PCR，and investigate its clinical significance in groups of primary Sj?gren's syndrome（pSS）and disease activity. Methods The primer was designed by human genome housekeeper gene TaqMan? GeneExpression Assays：ABI 4331182，ID：Hs02758991_g1，Levels of cfDNA，erythrocyte sedimentation rate（ESR），C-reaction protein（CRP）and immunoglobulin（IgA，IgG and IgM）in pSS group were detected. Meanwhile，the pSS activity index and damage index of diseases were assessed，and the relations between cfDNA and disease activity were analyzed. Results The levels of plasma cfDNA in pSS group（380.64±259.10）μg/L were apparently higher than those in normal control group（32.02±16.39）μg/L，and the differences were significant statistically（P＜0.05）. In pSS group：cfDNA level was positively correlation with SSDAI（r=0.533，P＜0.01）.But there was no correlation between cfDNA concentration and SSDDI（r=0.051，P＞0.05）；pSS group were divided into 2 groups by SSDAI median value of 4，the cfDNA level of 31 cases of pSS（SSDAI≥4）was（509.70±215.57）μg/L，the cfDNA level of 35 cases of pSS（SSDAI ＜4）was（262.65±186.35）μg/L，and the difference was statistically significant（P＜0.01）. Conclusions The cfDNA is increased in group of pSS，and it is positively correlated with SSDAI；It can be used as one of the disease activity indices of pSS.

Plasma circulating cell-free DNA Primary Sj?gren's syndrome Sj?gren's syndrome disease activity index Sj?gren's syndrome disease damage index

浙江省嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013AY21043-11）

314000 嘉興學(xué)院附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

1.4方法 觀察組及對(duì)照組取靜脈血5ml置于EDTA抗凝管中，以800g離心力離心10min后將上清血漿吸置清潔離心管，再離心10min，取上清血漿，繼續(xù)離心10min，使血漿中的不容物沉淀，完全去除血細(xì)胞成分置于干燥潔凈凍存管中，-70℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z，統(tǒng)一檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增定量管家基因，擴(kuò)增反應(yīng)采用三步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的人類基因組DNA（PE Biosystems，CA）倍比稀釋后擴(kuò)增所得。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析定量資料采用Pearson相關(guān)分析；等級(jí)資料采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。