樓煒　姚婉　樓敏銘　劉斌　宋宜

電離輻射反應(yīng)中PML調(diào)控CXCR4的表達(dá)

樓煒姚婉樓敏銘劉斌宋宜

目的 觀察電離輻射反應(yīng)中，肺癌細(xì)胞中受輻射感應(yīng)分子早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（PML）表達(dá)影響的信號分子，探討PML是否參與調(diào)控輻射誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移過程。方法 本實驗采用特異性靶向PML的siRNA構(gòu)建PML敲低表達(dá)細(xì)胞模型，鈷-60輻照，而后用康成公司的基因表達(dá)譜芯片檢測獲得差異表達(dá)基因，經(jīng)聚類分析挖掘與細(xì)胞間通訊、腫瘤轉(zhuǎn)移有重要相關(guān)性的基因，進一步用反轉(zhuǎn)錄實時定量多聚酶鏈反應(yīng)法（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印記法（WB）進行驗證。結(jié)果 應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片比較檢測電離輻射反應(yīng)中受PML影響的基因，篩選獲得在非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用的C-X-C細(xì)胞因子受體4（CXCR4）在PML敲低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)；RT-qPCR和WB進一步在mRNA和蛋白水平驗證PML敲低細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)增高。結(jié)論 在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功能的CXCR4基因的表達(dá)受輻射感應(yīng)分子PML的調(diào)控。

早幼粒白血病蛋白 C-X-C細(xì)胞因子受體4 電離輻射 轉(zhuǎn)移

肺癌是當(dāng)前世界范圍內(nèi)發(fā)生率和致死率最高的惡性腫瘤［1］。臨床上除部分Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者采用單純手術(shù)治療外，其余各期NSCLC和小細(xì)胞肺癌（SCLC）患者多采取綜合治療策略。放射治療是肺癌治療的重要手段之一［2］，但近年的臨床及實驗室研究數(shù)據(jù)顯示當(dāng)前采用的放射治療策略尚存在一些不足［3］。細(xì)胞在長期進化過程中形成的DNA損傷反應(yīng)防御機制通過激活細(xì)胞周期檢查點、損傷修復(fù)、凋亡及非凋亡性死亡等細(xì)胞學(xué)反應(yīng)維護細(xì)胞基因組穩(wěn)定性，防止腫瘤發(fā)生［4］。早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（PML）是細(xì)胞中的亞核多蛋白復(fù)合體PML核體的核心分子［5-6］。作者借助分子生物學(xué)研究方法，采用基因芯片技術(shù)，探討PML是否參與調(diào)控輻射誘發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及輻射條件 A549細(xì)胞系（人非小細(xì)胞肺腺癌）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所邵寧生實驗室提供。細(xì)胞培養(yǎng)采用RPMI Medium 1640完全培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清），于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1d（約18h）將細(xì)胞計數(shù)后接種于六孔板內(nèi)，控制細(xì)胞密度使其轉(zhuǎn)染時的匯合率為70%～80%。將干涉序列1.5μl（20μmol/L）與轉(zhuǎn)染試劑（Polyplus）4.5μl置于100μl不含血清和抗生素的RPMI Medium 1640培養(yǎng)液中，輕柔混勻后室溫靜置20min，而后加入用雙無培養(yǎng)液預(yù)洗過的細(xì)胞共孵育，此時干涉序列的終濃度為30nmol/L，6h后更換含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染使用的干涉序列合成自吉瑪公司，具體如下：非特異序列轉(zhuǎn)染對照組：siNC ense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT antisense：ACGUGACACGUUCGGAGAATT；特異性靶向PML序列組：siPML sense：GCAUCUACUGCCGAGGAUGTT antisense：CAUCCUCGGCAGUAGAUGCTT；輻射條件：鈷-60（Cobalt 60） 放射源，輻射劑量率為100.96 cGy/ min，輻射劑量10Gy。

1.2基因芯片檢測試劑及儀器 芯片檢測均交上海康成生物芯片有限公司備制實施。具體包括采用NanoDrop ND-1000進行樣本RNA定量、變性瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測RNA完整性，而后用Invitrogen公司的雙鏈DNA合成試劑盒（Superscript ds-cDNA synthesis kit）將RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA，采用NimbleGen公司的DNA標(biāo)記試劑盒（one-color DNA labeling kit）完成DNA的標(biāo)記，繼而使用NimbleGen公司的芯片雜交和洗脫緩沖液試劑盒（NimbleGen Hybridization System and NimbleGen wash buffer kit）進行芯片的雜交并洗脫非特異結(jié)合，最后通過Axon GenePix 4000B芯片掃描裝置（Molecular Devices Corporation）掃描芯片雜交結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1建立PML敲低表達(dá)A549細(xì)胞模型 為研究DNA損傷感應(yīng)分子PML是否參與調(diào)控電離輻射誘發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移機制，首先通過轉(zhuǎn)染特異性靶向PML基因的siRNA序列構(gòu)建PML敲低表達(dá)A549人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞模型。通過反轉(zhuǎn)錄定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法分別在mRNA和蛋白水平驗證了PML敲低表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

2.2基因芯片檢測及數(shù)據(jù)分析 在干涉序列轉(zhuǎn)染后48h，以放射性同位素鈷-60輻照對照組（NCsi）和PML敲低組（PMLsi）細(xì)胞，輻照后24h收集細(xì)胞，提取總RNA進行質(zhì)量檢測（見圖1），繼而送康成公司完成mRNA芯片檢測和數(shù)據(jù)分析。其中，差異表達(dá)基因的GO數(shù)據(jù)庫聚類分析依據(jù)相關(guān)生物學(xué)過程（biological-process）、細(xì)胞組分（cellular-component）以及分子功能（molecular-function）對基因進行功能描述及分類。結(jié)果顯示：輻照后，大量參與細(xì)胞間通訊及信號傳遞的分子的表達(dá)在PML敲低的細(xì)胞中出現(xiàn)上調(diào)。共篩選發(fā)現(xiàn)有939個基因的mRNAs增高＞2倍，按GO數(shù)據(jù)庫聚類分析后依據(jù)分子功能（MF）對基因進行分類。表1中列出的為基因富集度最高的前5類功能及其代表基因?？梢娚险{(diào)數(shù)量最多的前幾類分子功能均為具有細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的基因。而能夠正調(diào)控肺癌細(xì)胞輻射后增殖、遷移能力的重要細(xì)胞趨化因子受體CXCR4基因反復(fù)出現(xiàn)其中（見表1）。

圖1　PML基因敲低細(xì)胞表達(dá)譜的基因芯片檢測分析。樣本RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳（1 Ncsi組，2 Ncsi+IR組，3 PMLsi組，4 PMLsi+IR組）

表1　輻照后PML敲低表達(dá)肺癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)上調(diào)高于對照細(xì)胞的基因功能分類表

2.3PML敲低表達(dá)的A549細(xì)胞在電離輻射后CXCR4的表達(dá) 分析表達(dá)組芯片數(shù)據(jù)，CXCR4在輻照后的PML敲低組細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。重新轉(zhuǎn)染、輻照、收集細(xì)胞，通過RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄定量PCR（見圖2）和蛋白質(zhì)免疫印跡（見圖3）檢測在mRNA和蛋白水平證實A549細(xì)胞中，PML的敲低表達(dá)導(dǎo)致趨化因子受體CXCR4表達(dá)上調(diào)。

圖2　qRT-PCR檢測細(xì)胞中的CXCR4基因mRNA表達(dá)情況圖3　蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞中的CXCR4蛋白表達(dá)情況

圖2　qRT-PCR檢測細(xì)胞中的CXCR4基因mRNA表達(dá)情況圖3　蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞中的CXCR4蛋白表達(dá)情況

3　討論

手術(shù)、放療、化療是當(dāng)前治療惡性腫瘤的三大主要手段。隨著放射生物學(xué)和精準(zhǔn)放療設(shè)備的不斷發(fā)展，放射治療在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用越來越廣泛，大約有60%的腫瘤患者會在不同治療階段接受放療。但近年來研究報道顯示電離輻射在抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡性或非凋亡性死亡的同時，還能夠激活細(xì)胞內(nèi)的其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，其會直接或間接地改變存活細(xì)胞的活性及所處微環(huán)境，使得存活腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力發(fā)生改變，并有可能導(dǎo)致放療誘發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移，影響腫瘤放療的預(yù)后［7］。有關(guān)電離輻射誘發(fā)肺癌細(xì)胞侵襲遷移能力增強的現(xiàn)象國內(nèi)外均已有大量研究報道，提示該過程的分子調(diào)控機制對臨床放療策略選擇及優(yōu)化具有重要價值［8］。

CXCR4是已知的腫瘤組織中表達(dá)最普遍的趨化因子受體，在二十余種不同類型的腫瘤組織中的表達(dá)均異常增高。更重要的是，CXCR4的表達(dá)量還與患者的預(yù)后密切關(guān)聯(lián)。CXCR4及其配體的激活既能促進腫瘤細(xì)胞增殖抗凋亡，又能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)和活性誘導(dǎo)促進腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。本資料結(jié)果顯示，PML負(fù)調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)趨化因子CXCR4的表達(dá)，在通過分子生物學(xué)手段使得PML表達(dá)功能不足的情況下，受照后存活肺癌細(xì)胞中CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高。由于條件所限，本研究采用的腫瘤細(xì)胞輻照模型為單次輻照模型，盡管其引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)與臨床放療類似（誘發(fā)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、災(zāi)變、凋亡），但照射劑量及形式與臨床多次分割輻照不同。因此，在今后的研究中還需進一步結(jié)合臨床樣本對PML與CXCR4的相關(guān)性進行更深入的研究討論。

本研究對PML的功能進行研究時采用的是敲低表達(dá)細(xì)胞中全部PML基因的A549細(xì)胞輻照模型。通過此模型發(fā)現(xiàn)PML參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞輻射反應(yīng)中CXCR4的表達(dá)。由于人類細(xì)胞中PML基因存在＞7個的變體，遠(yuǎn)多于其他種屬的細(xì)胞，且各PML變體的功能各有不同，故今后的研究中還需進一步構(gòu)建各個PML變體的表達(dá)載體，進一步開展針對不同變體的深入功能研究。

PML在發(fā)現(xiàn)之初即被歸為抑癌分子，能及時感應(yīng)細(xì)胞中發(fā)生的DNA損傷，而后通過p53依賴和p53非依賴的途徑激活細(xì)胞周期檢查點、激活損傷修復(fù)，維持細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性，從而抗腫瘤發(fā)生。本資料結(jié)果表明PML還能夠抑制腫瘤細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CXCR4的表達(dá)，進一步擴展了對PML抗腫瘤功能的認(rèn)識。PML作為胞內(nèi)亞核結(jié)構(gòu)-PML核體（PML-NBs）的核心分子，其對CXCR4的調(diào)控有多種可能。PML既可能通過其下游的明星分子p53影響CXCR4的轉(zhuǎn)錄［9］，也可能通過與HDAC等遺傳調(diào)控蛋白的結(jié)合而調(diào)節(jié)CXCR4基因表達(dá)［10］?，F(xiàn)有研究已證實特異性的CXCR4抑制劑具有抗腫瘤作用［11］，故進一步深入研究PML調(diào)控CXCR4表達(dá)的分子機制及和受PML調(diào)控的其他細(xì)胞間通訊及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子將有望為研發(fā)腫瘤治療新靶標(biāo)提供指導(dǎo)。

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Objective To explore the role of PML in irradiation-induced tumor metastasis，and its down-stream targets involved in this process. Methods PML-knock-down cells were obtained by transfection of specific siRNAs. Total RNAs were isolated from cells after irradiation，and gene expression profiles were analyzed by DNA microarray（NimbleGen Human Gene Expression Microarrays）. We evaluated the mRNA expression of PML and CXCR4 with reverse transcription real-time polymerase chain reaction（RT-qPCR）. Western-blot examination to examine PML and CXCR4 protein expression was also carried out. Results DNA microarray analysis showed that CXCR4 gene expression was increased in PML-knock-down cells. The microarray data of CXCR4 mRNA levels were further validated using RT-qPCR. Increased CXCR4 protein levels in PML-knock-down cells were successfully confirmed correspondingly. Conclusions Decreased CXCR4 expression may be one of the mechanisms in PML-mediated irradiation-induced tumor metastasis.

PML CXCR4 Irradiation Metastasis

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2014ZB059），北京市自然科學(xué)基金課題（7152134）

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院（樓煒）100850軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（姚婉樓敏銘 劉斌 宋宜）

1.3芯片數(shù)據(jù)處理及分析 芯片掃描圖像導(dǎo)入NimbleScan軟件（版本2.6）進行數(shù)據(jù)分析。該軟件對導(dǎo)入數(shù)據(jù)行均一化處理后分別生成探針文件和檢測基因文件，而后將檢測基因文件導(dǎo)入Agilent GeneSpring GX軟件（version 11.5.1）分析，選取表達(dá)水平改變＞2倍的基因進行進一步的信號途徑分析和GO分析。

1.4反轉(zhuǎn)錄實時定量多聚酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 在A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72h（其中一組48h 10Gy照射）提取細(xì)胞中的總RNA。步驟按照Trizol reagent總RNA提取試劑（康為世紀(jì)公司）說明進行。取1μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑（ToYoBo公司）公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作過程反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA模板的定量PCR擴增采用Agilent Technologies Stratagene M×3000p系統(tǒng)，以SYBR Green dye為熒光染料。為確保各處理組間mRNA的等量性，實驗以GAPDH為內(nèi)參。取1μl的cDNA作模板，混合10μl 2×UltraSYBR Mixture（with ROX）（康為世紀(jì)公司）及1 μl的引物（5μM）使總反應(yīng)體系為20μl。QPCR擴增第一步95℃，10min，第二步95℃，15s和60℃，1min，共設(shè)定45個循環(huán)。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-blot） RIPA全細(xì)胞裂解液（分子克?。┝呀饧?xì)胞、蛋白定量，取適量蛋白樣品進行電泳（SDS-PAGE）。電泳后凝膠中的蛋白以180 mA恒流轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉/TBST緩沖液室溫封閉1h或4℃過夜；一抗PML（購自Santa公司）、CXCR4（購自NOVUS公司）均以1∶500稀釋，Actin（購自Bioworld公司）以1∶2000稀釋，室溫孵育2h或4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10min；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（購自三箭生物公司）以1∶2000稀釋，室溫反應(yīng)1h，TBST洗膜3次，10min/次。加入顯色底物（Millipore）室溫孵育2min，暗室顯影。