屠鵬飛　曾克武　廖理曦　宋小敏

[摘要]藥物靶標(biāo)是指人體內(nèi)與藥物相互作用并賦予藥物效應(yīng)的特定分子。作為傳統(tǒng)中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，天然活性小分子的作用機(jī)制闡明，特別是作用靶標(biāo)的鑒定一直是藥學(xué)研究者關(guān)注的重要課題，然而目前該領(lǐng)域一直未取得長(zhǎng)足的進(jìn)展。作者針對(duì)近年來(lái)在天然活性小分子靶標(biāo)蛋白識(shí)別鑒定方面出現(xiàn)的新技術(shù)、新方法進(jìn)行了總結(jié)，系統(tǒng)介紹了目前該領(lǐng)域的主流研究方法，原理以及成功案例，同時(shí)還探討了每種方法的適用性及不同方法之間的優(yōu)劣。相信該文對(duì)從事天然藥物化學(xué)、藥理學(xué)以及化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的研究人員有一定的啟發(fā)和借鑒作用。

[關(guān)鍵詞]天然活性小分子；靶標(biāo)蛋白；方法學(xué)；分子親和色譜；活性蛋白質(zhì)譜

天然活性小分子是新藥研發(fā)的重要來(lái)源，目前有相當(dāng)比例的臨床用藥都直接或間接來(lái)源于天然藥物。然而，以往針對(duì)天然活性分子的活性研究大多集中在細(xì)胞表型變化的觀測(cè)及初步的藥效學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)上，即使是分子機(jī)制研究也大多僅關(guān)注一些經(jīng)典的藥理信號(hào)通路，往往忽略這些活性分子直接作用靶標(biāo)的鑒定。主要原因可能在于天然活性分子的結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性。例如不同科屬、不同地域生長(zhǎng)的藥用植物性狀差別很大，導(dǎo)致其所含有的活性化學(xué)成分多種多樣，結(jié)構(gòu)更是千差萬(wàn)別。由于化合物的結(jié)構(gòu)直接決定著其藥理活性作用，而天然活性分子的結(jié)構(gòu)如此復(fù)雜，因此其可能作用的蛋白靶標(biāo)非常繁多，即使是一個(gè)活性分子也可能同時(shí)作用于多個(gè)蛋白靶標(biāo)，鑒定工作非常具有挑戰(zhàn)性。另外一個(gè)原因就是天然活性分子中很大一部分化合物的結(jié)構(gòu)含有多個(gè)活性位點(diǎn)，也就是說(shuō)其中包含了多個(gè)可以成為藥效團(tuán)的亞結(jié)構(gòu)，因此到底是哪一部分發(fā)揮了藥效，其與靶標(biāo)蛋白是如何作用的？這些問題均難以得到解答，或至少在技術(shù)上存在相當(dāng)?shù)碾y度，因此這也是制約天然活性分子靶標(biāo)蛋白闡明工作的一個(gè)障礙。

目前，在探索天然活性分子的靶標(biāo)蛋白方面，前人已經(jīng)積累了一些經(jīng)驗(yàn)，在此該文就當(dāng)前主流的天然活性分子靶標(biāo)蛋白鑒定工作進(jìn)行了總結(jié)和分類，旨在為今后該領(lǐng)域的研究提供一些技術(shù)和方法上的借鑒。就目前的研究進(jìn)展來(lái)看，天然活性小分子的靶標(biāo)蛋白識(shí)別主要采用如下一些方法，各種方法互有優(yōu)劣，可相互借鑒，也可綜合運(yùn)用。①基于分子親和色譜技術(shù)識(shí)別天然活性小分子靶標(biāo)蛋白（化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)）；②基于活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)識(shí)別天然活性小分子靶標(biāo)蛋白；③基于活性小分子結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助反向?qū)ぐ屑夹g(shù)；④基于生物物理學(xué)方法推測(cè)天然活性小分子靶標(biāo)蛋白；⑤基于關(guān)鍵疾病信號(hào)通路識(shí)別天然活性小分子靶標(biāo)蛋白；⑥其他新方法。

下面就分別對(duì)這些方法的原理和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的論述和分析

1基于分子親和色譜技術(shù)識(shí)別天然活性小分子靶標(biāo)蛋白（化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)）

在目前所采用的各種靶標(biāo)蛋白識(shí)別技術(shù)中，小分子親和色譜法（small molecule affinity chromatography）是應(yīng)用最為廣泛的一種。目前應(yīng)用該法已經(jīng)識(shí)別并鑒定了包括天然活性分子在內(nèi)的大量藥物分子的靶標(biāo)蛋白。目前的小分子親和色譜法一般需要對(duì)活性小分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，通過化學(xué)手段引入標(biāo)簽分子進(jìn)而將其連接到免疫親和載體上，并進(jìn)行靶標(biāo)蛋白的富集和識(shí)別。標(biāo)簽分子主要是biotin，此外還包括熒光基團(tuán)、化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)、光反應(yīng)基團(tuán)、放射性同位素等。下面分別進(jìn)行具體的介紹。

1.1通過引入biotin標(biāo)簽分子構(gòu)建天然活性小分子免疫親和載體biotin是一種相對(duì)分子質(zhì)量為244的生物小分子，廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)。在生物學(xué)研究中，人們常利用hio-tin與avidin（親和素）之間的穩(wěn)定結(jié)合能力，對(duì)蛋白質(zhì)及其他生物大分子進(jìn)行標(biāo)記和純化富集等操作。目前已經(jīng)發(fā)展出了一套十分成熟的biotin-avidin系統(tǒng)（BAS）用于活性小分子的靶標(biāo)蛋白富集和識(shí)別。即通過將biotin與活性小分子進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵連接進(jìn)而構(gòu)建一種biotin修飾的活性小分子探針，并用于后續(xù)的靶標(biāo)蛋白識(shí)別研究。該方法的優(yōu)勢(shì)在于，biotin與avidin之間存在天然的特異性強(qiáng)相互作用，因此利用avidin包被的瓊脂糖（agarose）固相載體與biotin修飾的天然活性小分子之間進(jìn)行反應(yīng)，利用biotin與avidin的相互作用將活性小分子固定并包被在固相載體上，進(jìn)而再通過活性小分子與蛋白之間的相互作用，富集和純化到相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白（圖1）。

由于該法易于操作、適用面廣，因此研究人員采用該法已經(jīng)富集并識(shí)別到了一批新穎的藥物靶標(biāo)蛋白。陳國(guó)強(qiáng)教授課題組針對(duì)天然活性分子腺花素（adenanthin）治療早幼粒白血病的靶標(biāo)蛋白開展了深入研究，其利用腺花素分子結(jié)構(gòu)中的活性羥基基團(tuán)作為把手，通過在其上連接長(zhǎng)鏈的biotin分子基團(tuán)進(jìn)而構(gòu)建了biotin化腺花素探針分子（bio-adenan-thin），并據(jù)此富集到了相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白為過氧化物酶（perox-iredoxin Ⅰ和peroxiredoxinⅡ，圖2a）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腺花素可以通過靶向作用于peroxiredoxin Ⅰ和peroxiredoxinⅡ進(jìn)而抑制其氧化活性，提升細(xì)胞內(nèi)過氧化氫水平，激活ERK-C/EBPB信號(hào)通路并最終促進(jìn)白血病細(xì)胞的分化，實(shí)現(xiàn)治療作用。此外，腺花素還可以通過靶向作用于peroxiredoxinⅠ和peroxiredoxinⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗肝癌的治療作用。雷曉光課題組通過對(duì)天然抗炎活性分子ain-sliadimer A的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，在其羥基基礎(chǔ)上引入biotin長(zhǎng)鏈分子，構(gòu)建了抗炎活性分子探針bio-ainsliadimer A（圖2b），進(jìn)而富集到了其抗炎靶標(biāo)蛋白為IKB激酶（IKKa/β）。Ainsliadimer A能夠選擇性作用于46位半胱氨酸并與其形成共價(jià)鍵，進(jìn)而抑制IKKα/β的活性并下調(diào)NF-κB炎癥信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)抗炎作用。此外，通過構(gòu)建biotin修飾的ainsliatri-mer A分子探針，該課題組還探索了其具有抗腫瘤作用的靶標(biāo)蛋白PPARγ。天然產(chǎn)物withaferin A（WFA）具有明顯的抗腫瘤和抗血管增殖活性，Mohan研究組針對(duì)WFA的分子結(jié)構(gòu)合成了biotin修飾的抗腫瘤分子探針WFA--B（圖2c）。通過靶標(biāo)蛋白的富集和鑒定，發(fā)現(xiàn)WFA可以特異性結(jié)合于中間絲狀體蛋白（intermediate filament protein）并共價(jià)結(jié)合于其半胱氨酸殘基，進(jìn)而抑制細(xì)胞微管生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。再有，從沙雷氏菌Serratia liquefaciens中提取得到的天然產(chǎn)物FRl77391具有良好的降血脂作用，能夠降低體內(nèi)甘油三酯的水平，但是其作用靶標(biāo)尚不明確。研究人員通過結(jié)構(gòu)改造，在其分子中引入biotin標(biāo)簽分子，進(jìn)而構(gòu)建了分子探針Biotin-FR177391（圖2d），并將其包被在固相樹脂上，然后通過小分子親和色譜技術(shù)，富集并純化到該小分子的靶標(biāo)為蛋白質(zhì)磷酸酶2A（phosphatase 2A，PP2A）。即FR177391可以通過抑制PP2A的活性進(jìn)而調(diào)控下游的ERK信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)降血脂作用。

1.2通過與環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)構(gòu)建天然活性小分子免疫親和載體環(huán)氧活性基團(tuán)是一種以環(huán)氧乙烷為基本結(jié)構(gòu)的反應(yīng)基團(tuán)，其可以在堿性條件下與化合物分子中的羥基進(jìn)行共價(jià)鍵結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子的結(jié)構(gòu)修飾。Epoxy-activated Sepha-rose 6B beads是目前使用較為流行的一種環(huán)氧活性基團(tuán)修飾的固相載體，其可以與含有羥基結(jié)構(gòu)的化學(xué)小分子進(jìn)行反應(yīng)并將小分子鍵合到固相載體表面，并用于小分子靶標(biāo)蛋白的富集研究.張衛(wèi)東教授課題組研究了天然倍半萜內(nèi)酯TJ-5的抗炎作用及靶標(biāo)蛋白，其通過利用TJ-5分子結(jié)構(gòu)中的活性羥基，將其與Epoxy-activated Sepharose 6B beads進(jìn)行反應(yīng)，形成共價(jià)鍵連接，進(jìn)而將TJ-5分子鍵合到了該固相載體表面。隨后利用TJ-5與靶標(biāo)蛋白之間的相互作用富集并識(shí)別到了相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白為泛素連接酶UbcH5（圖2e）。隨后研究發(fā)現(xiàn)，TJ-5可以通過與UbcH5的半胱氨酸活性位點(diǎn)之間形成共價(jià)鍵連接，進(jìn)而抑制泛素分子與UbcH5的結(jié)合，從而抑制NV+R炎癥信號(hào)通路的激活，實(shí)現(xiàn)抗炎作用。另外，還有學(xué)者將姜黃素（curcumin）與Epoxy-activated Sepharose 6Bheads進(jìn)行反應(yīng)進(jìn)而得到姜黃素包被的固相載體，然后富集和純化相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。經(jīng)二維凝膠分離和MALDI/TOF/TOF質(zhì)譜鑒定后發(fā)現(xiàn)了若干種結(jié)合蛋白，包括結(jié)構(gòu)性蛋白（tubulin，actin），細(xì)胞代謝相關(guān)酶（烯醇化酶，磷酸甘油酸變位酶，果糖-1，6-二磷酸醛縮酶），以及細(xì)胞凋亡相關(guān)酶（熱休克蛋白71，過氧化物酶2）

但是這些蛋白是否是姜黃素分子的特異性結(jié)合靶標(biāo)蛋白還有待進(jìn)一步研究。

1.3通過與其他類型基團(tuán)反應(yīng)構(gòu)建天然活性小分子免疫親和載體秦皮乙素（esculetin）具有較好的抗結(jié)腸癌作用，但是其作用靶標(biāo)尚不明確，研究人員利用該化合物的結(jié)構(gòu)中含有酚羥基的特點(diǎn)，使之與溴化氰活化的CNBr-Sepharose 4B發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而構(gòu)建esculetin修飾的固相親和載體。研究人員利用該載體富集到了相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白為β-耳關(guān)蛋白（β-cate-nin），esculetin可能與蛋白序列中的Lys312，Gly307，Lys345和Ash387等氨基酸基團(tuán)發(fā)生直接相互作用，抑制β-eatenin-Tcf絡(luò)合物的形成，降低細(xì)胞存活率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。除此之外，還有多種其他類型的親和基質(zhì)可供使用，如AffiGel，Toyopearl，AQUAFIRMUS，SG beads等，對(duì)此已有專門的文獻(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和比較。

這里值得一提的是，在應(yīng)用分子親和色譜技術(shù)富集到相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白后，目前主要通過液相質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)序列的鑒定，也就是將富集到的蛋白樣品經(jīng)過凝膠電泳后進(jìn)而染色，并將相應(yīng)的蛋白條帶切割下來(lái)進(jìn)行分析。一般來(lái)講，凝膠電泳后的蛋白樣品的性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，可在4℃避光條件下保存1個(gè)月左右。

2基于活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)識(shí)別天然活性小分子靶標(biāo)蛋白

活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)（activity-based protein profiling，AB-pp）主要是利用化學(xué)合成的帶有不同功能標(biāo)簽（熒光疊氮炔基等）的小分子探針與靶標(biāo)蛋白形成共價(jià)鍵，進(jìn)而能夠在高度復(fù)雜的生物樣品中標(biāo)記檢測(cè)分離靶標(biāo)蛋白的新技術(shù)。一般來(lái)講，ARPP中使用的小分子探針包含有一個(gè)親電基團(tuán)，其能夠與靶標(biāo)蛋白活性口袋附近的親核氨基酸發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而將該蛋白從復(fù)雜的蛋白混合體系中識(shí)別并分離出來(lái)因此，小分子探針一般在結(jié)構(gòu)上要包含反應(yīng)基團(tuán)（疊氮，炔基等），作用是使得該分子探針與蛋白結(jié)合后能夠被后續(xù)加入的熒光染料固相基質(zhì)等特異性的識(shí)別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記和純化分離的目的（圖3）。ARPP是目前最受關(guān)注，應(yīng)用范圍最廣的蛋白靶標(biāo)識(shí)別技術(shù)之一該技術(shù)特別適合于小分子與靶蛋白之間能形成共價(jià)鍵結(jié)合的情況，因此需要小分子在結(jié)構(gòu)上含有能夠與靶蛋白發(fā)生反應(yīng)的功能性結(jié)構(gòu)基團(tuán)，以便于與靶蛋白之間發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)鍵其中，典型的親電基團(tuán)包括：環(huán)氧基，內(nèi)酯，β-內(nèi)酰胺，醌類，Michael受體等。這里的Michael受體是烯鍵或炔鍵與吸電子基團(tuán)共軛相連形成的官能團(tuán)，該結(jié)構(gòu)易于與生物活性分子中的強(qiáng)親核基團(tuán)（半胱氨酸的巰基）發(fā)生加成反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

2.1活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)（ABPP）用于活性小分子的靶標(biāo)蛋白識(shí)別案例 從明日草Angelica keiskei中分離出的活性查爾酮小分子4-bydroxyderricin（4-HD）具有廣泛的抗菌作用，能夠明顯抑制金黃色葡球菌的增殖，但是其作用機(jī)制和靶標(biāo)蛋白仍不清楚。因此研究人員在其原有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過化學(xué)合成引入炔基結(jié)構(gòu)，進(jìn)而構(gòu)建了小分子探針（圖3a）。并通過活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)捕捉并鑒定到了4-HD的靶標(biāo)蛋白為絲氨酰tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，STS）。由于4-HD可以共價(jià)結(jié)合于細(xì)菌的STS上并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而抑制了其催化氨?；磻?yīng)的活性，干擾細(xì)菌的正常生長(zhǎng)和復(fù)制過程，實(shí)現(xiàn)抗菌作用。研究人員通過在淺藍(lán)菌素（cerule-nin）結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入長(zhǎng)鏈炔基進(jìn)而構(gòu)建活性分子探針，用于特異性標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（palmitoyl acvltrans-ferasePATs）。結(jié)果顯示，構(gòu)建的分子探針能夠很好的標(biāo)記PATs，并用于后續(xù)的質(zhì)譜研究（圖3h）。該研究不僅解釋了天然產(chǎn)物cerulenin的生物靶標(biāo)，也為后續(xù)關(guān)于PATs的生物功能學(xué)研究提供了一種可靠的分子探針。寄端霉素（hy-pothemycin）是一種真菌來(lái)源的天然聚酮類化合物，其可以通過抑制體內(nèi)的多種激酶進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤抗寄生蟲病的作用研究人員通過在其分子結(jié)構(gòu)中引入炔基進(jìn)而構(gòu)建分子探針（圖3c），以此富集和捕捉其結(jié)合的靶標(biāo)蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，該蛋白為含有Cys-Asp-Xaa-Gly序列的錐蟲（trypanosome kinase）系列激酶（CDXG kinases）。特別是其中的T.brucei cdc2-like kinas。1（TbCLK1）激酶，是該活性分子治療非洲錐蟲病的關(guān)鍵作用蛋白靶標(biāo)。

2.2光親和基團(tuán)活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)（PAL-ABPP）用于分子靶標(biāo)尋找案例 拉二烯內(nèi)酯（pladienolide）是一種具有天然抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，研究人員通過對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，在其結(jié)構(gòu)中同時(shí)引入biotin標(biāo)簽分子和光親和基團(tuán)偶氮丙啶，構(gòu)建了一種抗腫瘤光親和分子探針（圖3d）。該研究組通過光交聯(lián)親和純化技術(shù)，讓構(gòu)建的光親和分子探針與細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行交聯(lián)，并通過hiotin標(biāo)簽富集到了相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白經(jīng)液相質(zhì)譜鑒定，該靶標(biāo)蛋白為剪切因子3b（splicing factor 3b，SF3b）中的3型亞基（SAP130）。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，Pladienolide可以直接作用于SAP130，進(jìn)而抑制SF3b蛋白復(fù)合物的功能，降低其在細(xì)胞內(nèi)對(duì)特定核酸的剪切能力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。另外一個(gè)比較特殊的案例是天然產(chǎn)物槲皮素（quercetin）的靶標(biāo)蛋白識(shí)別由于槲皮素自身就具有光反應(yīng)活性，因此可以自身結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)構(gòu)建光親和反應(yīng)探針，研究人員在其酚羥基基礎(chǔ)上通過酯化反應(yīng)引入biotin標(biāo)簽分子，進(jìn)而構(gòu)建光親和分子探針（圖3e）。由于quercetin與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后，在紫外光照射下可以對(duì)蛋白進(jìn)行光標(biāo)記，進(jìn)而捕捉靶標(biāo)蛋白然后再利用quercetin上的biotin標(biāo)簽富集和純化靶標(biāo)蛋白，經(jīng)液相質(zhì)譜鑒定后共分析出多個(gè)特異性結(jié)合的靶標(biāo)蛋白，包括熱休克蛋白HSP70/HSP90、酪蛋白激酶2（CK2）線粒體ATP酶泛素激活酶等。

2.3基于同位素標(biāo)記STLAC方法的活性小分子尋靶案例細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的重要方法其特別適合于分析復(fù)雜生物樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化RTT Ar技術(shù)的原理就是用天然同位素（輕型）及穩(wěn)定同位素（重型）標(biāo)記的氨基酸取代原有培養(yǎng)基中的氨基酸，細(xì)胞經(jīng)6-8次傳代后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中，代替原有氨基酸最后再將具有不同標(biāo)記的細(xì)胞蛋白裂解液等比例混合，經(jīng)凝膠電泳分離后做質(zhì)譜鑒定，從而分析不同處理組細(xì)胞中蛋白表達(dá)量的變化?；诖思夹g(shù)，人們發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物雷帕霉素（rapamycin）可以穩(wěn)定5′-terminal oligopyrimidine（TOP）mRNAs編碼的蛋白質(zhì)，包括核糖體蛋白和延伸因子等，進(jìn)而影響整個(gè)細(xì)胞的生命過程。此外基于STLAC的研究發(fā)現(xiàn)，（_）-aR，11S-楊梅醇（Myricanol）可以通過特異性誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬通路從而促進(jìn)tau蛋白的降解，清除細(xì)胞內(nèi)的tau。

2.4其他方法

熒光染料轉(zhuǎn)移法：天然產(chǎn)物marinopyr-role A具有較好的抗腫瘤活性，研究人員在其分子結(jié)構(gòu)中引入帶有酰基結(jié)構(gòu)的熒光基團(tuán)，構(gòu)建了熒光親和分子探針（圖3f）。當(dāng)該分子探針與靶標(biāo)蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，熒光基團(tuán)中的酰基能夠與蛋白中的氨基發(fā)生連接，將熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移并共價(jià)連接到蛋白上，進(jìn)而對(duì)該蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，同時(shí)釋放小分子由于標(biāo)記的蛋白具有熒光效應(yīng)，因而可以通過凝膠電泳及熒光顯色方式分離純化該蛋白。經(jīng)過鑒定，marinopy-rrole A的靶標(biāo)蛋白為細(xì)胞骨架蛋白actin。

活細(xì)胞在體標(biāo)記技術(shù)，即通過小分子探針對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行動(dòng)態(tài)標(biāo)記和成像的技術(shù)，目前已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)其基本原理是，通過在小分子結(jié)構(gòu)中引入疊氮基，使小分子探針首先與靶標(biāo)蛋白發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而加入具有環(huán)辛炔（cyclooctyne）基團(tuán)的熒光報(bào)告分子，在活細(xì)胞內(nèi)，探針上的疊氮基團(tuán)與熒光報(bào)告分子上的環(huán)辛炔發(fā)生偶極環(huán)加成反應(yīng)，成共價(jià)鍵連接，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)蛋白的動(dòng)態(tài)標(biāo)記和成像。

1基于活性小分子結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)反向?qū)ぐ屑夹g(shù)

計(jì)算機(jī)反向?qū)ぐ屑夹g(shù)是一種基于小分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行反向靶標(biāo)蛋白預(yù)測(cè)的方法。Pharm Mapper是一個(gè)可自由訪問的在線服務(wù)器，其主要通過藥效團(tuán)匹配法鑒定藥物分子的作用靶標(biāo)。通過藥效團(tuán)搜尋策略，Pharm Mapper可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)潛在藥物靶標(biāo)的搜尋。在Pharm Mapper的數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)了超過7000個(gè)基于受體的藥效團(tuán)模型（覆蓋了1 627個(gè)藥物靶標(biāo)信息，包括459人體靶標(biāo)蛋白）。Chem Mapper是另一種基于計(jì)算機(jī)的藥物分子靶標(biāo)識(shí)別軟件，其識(shí)別靶標(biāo)的理論基礎(chǔ)是具有相似結(jié)構(gòu)的化合物可能具有相似的靶標(biāo)作用方式。Chem Mapper整合了大約30萬(wàn)具有藥理學(xué)功能注釋的化合物結(jié)構(gòu)以及超過300萬(wàn)個(gè)結(jié)構(gòu)明確的化合物。Chem Mapper可用于各種化合物的藥理學(xué)活性預(yù)測(cè)、藥物分子_靶標(biāo)相關(guān)性探索計(jì)算機(jī)虛擬篩選研究等領(lǐng)域。目前，我國(guó)的多家研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)開展了大量的此類研究。比如北京計(jì)算中心以內(nèi)部開發(fā)的靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)為核心，分子對(duì)接方法為基礎(chǔ)，研發(fā)了一套較為完整的計(jì)算機(jī)反向?qū)ぐ邢到y(tǒng)，能提供在線服務(wù)（http：∥reversedock.vslead.com/）。其靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)包含了600多個(gè)靶標(biāo)的7000多個(gè)活性位點(diǎn)信息用戶只需提交小分子結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)即可通過小分子與活性位點(diǎn)的一一對(duì)接匹配，給出排名靠前的活性位點(diǎn)，預(yù)測(cè)小分子的潛在作用靶標(biāo)。此平臺(tái)的關(guān)鍵在于數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性，數(shù)據(jù)庫(kù)靶標(biāo)為疾病靶標(biāo)，三維結(jié)構(gòu)完整（無(wú)殘基缺失），靶標(biāo)的生物信息全面，包括靶標(biāo)的PubMed，EC，UniProt，CAS，Drug-Rank等信息，方便用戶進(jìn)行后續(xù)結(jié)果分析據(jù)報(bào)道，有研究人員綜合利用2種反向虛擬靶點(diǎn)篩選系統(tǒng)（idTarget和PharmMapper）對(duì)中藥藏紅花的抗腫瘤活性成分開展了計(jì)算機(jī)反向?qū)ぐ醒芯?通過虛擬對(duì)接結(jié)合能計(jì)算和打分，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了苦藏花素（picrocrocin）與熱休克蛋白Hsp90 alpha可發(fā)生特異性結(jié)合，其分子機(jī)制可能是苦藏花素與Hsp90-alpha ATPase的催化結(jié)構(gòu)域中的若干個(gè)帶電氨基酸基團(tuán)發(fā)生親核反應(yīng)，從而調(diào)控了該蛋白酶的活性所致。此外，黃芩素（baicalein）具有較好的抗帕金森作用，但是其靶標(biāo)蛋白不明確，研究人員利用計(jì)算機(jī)虛擬靶標(biāo)篩選平臺(tái)，通過數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘分子對(duì)接基于結(jié)構(gòu)的藥效團(tuán)搜索（structure-based pharmacophore searching）以及化學(xué)相似性搜索（chemical similarity searching）等技術(shù)，找到了黃芩素的作用靶標(biāo)蛋白為兒茶酚對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶（cate-chol-O-methyltransferase，COMT）和單胺氧化酶（monoamine oxidase B，MAO-B）。研究人員進(jìn)而還在NMDA誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞模型上驗(yàn)證了黃芩素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，以及對(duì)一氧化氮和活性氧自由基的調(diào)控作用。

4基于生物物理學(xué)方法推測(cè)天然活性小分子靶標(biāo)蛋白

蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)是生物物理學(xué)中比較常見的一種鑒定活性小分子結(jié)合靶標(biāo)蛋白的方法，其理論依據(jù)是如果活性小分子和大分子蛋白發(fā)生結(jié)合，那么由于蛋白與活性小分子結(jié)合后的絡(luò)合物變得更加牢固，進(jìn)而增加了蛋白的穩(wěn)定性，與游離的非結(jié)合蛋白相比降解速度更慢。因此可通過測(cè)定非藥物處理組與藥物處理組的全蛋白譜變化，然后進(jìn)行比較，從而甄別出那些藥物處理前后蛋白表達(dá)量發(fā)生顯著變化的蛋白，由此可初步判斷其為潛在的小分子結(jié)合靶蛋白，該技術(shù)也被稱為藥物親和靶標(biāo)穩(wěn)定性分析（drug affinity responsivetarget stability，DARTS）。最近還有一種更新穎的方法報(bào)道出來(lái)，即基于氧化速率的蛋白穩(wěn)定性分析（stability of pro-teins from rates of oxidation，SPROX）。該方法是通過測(cè)定被氧化的蛋氨酸殘基水平進(jìn)而評(píng)估可能與小分子發(fā)生結(jié)合的潛在蛋白，如果活性小分子與某一個(gè)蛋白發(fā)生結(jié)合，則將會(huì)改變?cè)摰鞍椎恼郫B狀態(tài)，進(jìn)而改變?cè)摰鞍仔蛄兄械鞍彼嵘系奶禺愋匝趸磻?yīng)進(jìn)程，最終通過質(zhì)譜得以鑒定。此類方法的一個(gè)問題是，實(shí)驗(yàn)中需要使用高于生理濃度的小分子化合物，有的甚至高達(dá)mmol·L^-1級(jí)別，因此其分析結(jié)果是否能夠真正反映生理狀態(tài)下的靶蛋白和小分子間相互作用還有待進(jìn)一步考察

5基于關(guān)鍵疾病信號(hào)通路識(shí)別天然活性小分子靶標(biāo)蛋白

很多天然活性產(chǎn)物的作用機(jī)制研究是源于對(duì)其藥用植物本身的傳統(tǒng)應(yīng)用而開展的，即古代醫(yī)書中對(duì)某個(gè)植物的藥用功效記載很可能在其提取物中有所體現(xiàn)這樣可以根據(jù)目前已知的針對(duì)該類疾病的分子信號(hào)通路入手，逐步探索該活性成分可能的作用靶標(biāo)蛋白

雷公藤的傳統(tǒng)功效包括祛風(fēng)除濕通絡(luò)止痛消腫止痛等，臨床上用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等癥。雷公藤內(nèi)酯（triptolide）是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的二萜類天然活性分子，具有抗炎免疫抑制抗腫瘤等活性：但是其具體的作用靶標(biāo)目前尚不清楚由于上述抗炎生物活性作用一般多與炎癥轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控密切相關(guān)，因此基于此類猜測(cè)，約翰·霍普金斯大學(xué)的研究人員系統(tǒng)地研究了triptol-ide對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的不同階段和參與每個(gè)階段的不同功能性蛋白的調(diào)控作用。最終發(fā)現(xiàn)triptolide的抗炎作用分子靶標(biāo)是轉(zhuǎn)錄因子TFIIH的XPB/ERCC3亞基。從而為triptolide的抗炎分子機(jī)制闡明提供了重要的實(shí)驗(yàn)信息。

6其他新方法

葡糖基殺粉蝶菌素A（ducopiericidin A，GPA）是一種由放線菌產(chǎn)生的能夠抑制微生物的絲狀偽足突起（filopodia protrusion）的天然活性成分，日本學(xué)者利用代謝組學(xué)方法研究了GPA的作用靶標(biāo)蛋白。通過毛細(xì)管電泳_飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-TOF-MS），該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)GPA能夠靶向作用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)而抑制糖酵解過程，因此GPA可以作為一種糖酵解的分子探針加以使用。這是一個(gè)利用代謝組學(xué)分析方法鑒定分子靶標(biāo)蛋白的優(yōu)秀案例。海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物Xvloketal B（XKB）具有顯著的抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)作用，但是其作用的蛋白靶標(biāo)及代謝調(diào)控作用尚不清楚。研究人員將咪達(dá)唑侖（midazolam）作為模型分子探針，利用生物信息學(xué)軟件平臺(tái)DDI-CPI（predicting drug-drug interaction via chemical-protein interactome）預(yù)測(cè)XKB的作用靶標(biāo)蛋白為Cyp3a2，并采用同源建模和分子對(duì)接技術(shù)研究了XKB與靶標(biāo)蛋白Cyp3a2之間的相互作用，進(jìn)而通過DAVID軟件（database for annotation，visualization and integrated dis-covery）分析了基于該靶標(biāo)蛋白的XKB信號(hào)調(diào)控通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了324個(gè)潛在的靶標(biāo)蛋白以及62條信號(hào)通路可能被XKB所調(diào)控，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)XKB可以顯著下調(diào)P450 3a（Cyp3a）亞家族成員的活性和表達(dá)水平。

7總結(jié)

天然活性小分子的靶標(biāo)蛋白識(shí)別是天然藥物學(xué)和新藥研發(fā)領(lǐng)域的重要課題。基于天然活性小分子可以探索并發(fā)現(xiàn)很多結(jié)構(gòu)和功能獨(dú)特的藥物靶標(biāo)蛋白，從而為后續(xù)基于靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新藥物設(shè)計(jì)提供關(guān)鍵的理論信息指導(dǎo)。由于天然活性小分子的結(jié)構(gòu)十分多樣，因此在進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別的過程中無(wú)法采用固定的一種方法，一般是綜合考慮各種因素，比如：分子結(jié)構(gòu)的新穎性分子的化學(xué)可修飾性分子溶解性生物活性大小等多種指標(biāo)，選取一種最為合適的方法因此本文也對(duì)前述的幾種方法的優(yōu)劣進(jìn)行了綜合比較，見表1。

天然活性小分子的靶標(biāo)識(shí)別可以為后續(xù)深入探索這些小分子與靶標(biāo)蛋白的相互作用方式作用位點(diǎn)，以及分子機(jī)制研究提供關(guān)鍵性的指導(dǎo)信息，避免以往盲目地僅針對(duì)少數(shù)經(jīng)典疾病信號(hào)通路開展藥理研究的弊病。真正做到對(duì)活性小分子量體裁衣、無(wú)偏向性的藥理機(jī)制研究。同時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)可與小分子作用的蛋白不止一個(gè)，因此也可以通過這些技術(shù)識(shí)別與小分子發(fā)生相互作用的多個(gè)蛋白，進(jìn)而評(píng)估可能的藥物毒性靶標(biāo)及副作用，進(jìn)而全面了解藥物分子的藥理及毒理學(xué)機(jī)制總之，天然活性小分子的作用靶標(biāo)識(shí)別是一項(xiàng)十分具有挑戰(zhàn)性的工作，相關(guān)研究技術(shù)較難掌握，需要研究者的經(jīng)驗(yàn)較為豐富，希望今后能夠出現(xiàn)更多更加成熟且易于掌握的方法，從而使得該項(xiàng)研究能夠在更廣的范圍內(nèi)開展，大大推動(dòng)天然藥物學(xué)及新藥研制的前進(jìn)步伐。