許海林，吳小勇*，聶少平，黃延盛，唐青濤

（1.廣東藥科大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510310；2.廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528453；3.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；4.無限極（中國）有限公司，廣東 新會 529156）

黑木耳多糖提取工藝優(yōu)化及其對小鼠巨噬細胞功能的影響

許海林1，吳小勇2,*，聶少平3，黃延盛4，唐青濤4

（1.廣東藥科大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510310；2.廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528453；3.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；4.無限極（中國）有限公司，廣東 新會 529156）

采用單因素試驗及正交試驗，考察液料比、攪拌轉(zhuǎn)速、提取時間、提取溫度和原料顆粒大?。繑?shù)）對黑木耳多糖提取得率的影響，并對黑木耳多糖提取工藝進行優(yōu)化。通過灌胃法給藥，采用小鼠碳廓清實驗和小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光標記微球?qū)嶒灉y定黑木耳多糖對小鼠巨噬細胞功能的影響。結果表明：影響黑木耳多糖提取得率的因素排序為，原料顆粒大?。咎崛r間＞攪拌轉(zhuǎn)速＞液料比。優(yōu)化得到的黑木耳多糖提取最佳工藝條件為原料顆粒大小80 目、液料比30∶1（mL/g）、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、提取時間70 min、提取溫度100 ℃（沸水浴加熱），此條件下黑木耳多糖提取得率可達8.46%。同時，黑木耳多糖對小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)無顯著影響，但能明顯提高小鼠單核-巨噬細胞的吞噬能力，說明黑木耳多糖具有提高動物非特異性免疫能力的作用。

黑木耳；多糖；提取工藝；巨噬細胞

多糖具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、抗凝血、降血脂等，在功能食品和醫(yī)藥領域具有廣泛的應用前景[1-5]。黑木耳（Auricularia auricular）隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、木耳目、木耳科和木耳屬，是一種藥食同源的真菌；多糖是黑木耳的主要生物活性成分[6]。研究[7-11]報道顯示，黑木耳多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇、降血糖等功能。

近年來，在黑木耳多糖提取方法及工藝優(yōu)化方面有大量研究[12-17]報道。從文獻報道可以看出，目前研究大多集中于液料比、提取溫度、提取時間等因素對多糖提取效果的影響；而關于原料顆粒大?。繑?shù)）、體系攪拌狀況等因素對黑木耳多糖提取得率影響的研究報道不多。本實驗考察了液料比、提取溫度、提取時間及原料顆粒大?。繑?shù)）、攪拌機轉(zhuǎn)速等因素對黑木耳多糖提取得率的影響，對提升黑木耳多糖提取效率具有一定的指導意義。

真菌多糖通過影響免疫細胞如造血干細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞，產(chǎn)生相應的生物學效應，以增強和激活機體免疫[18-20]。本研究采用小鼠碳廓清實驗和小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光標記微球?qū)嶒?，觀察黑木耳多糖對單核-巨噬細胞功能的影響，初步考察黑木耳多糖的免疫調(diào)節(jié)功能，為黑木耳多糖的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、實驗動物與試劑

黑木耳：產(chǎn)自浙江龍泉，由無限極（中國）有限公司提供。

近交系BALB/c小鼠，雌性，18～22 g，合格證號：SCXK（粵）2012-0125，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

Dextran T-40葡聚糖 美國Pharmacia公司；苯酚（分析純） 上海強順化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸（分析純） 廣州化學試劑廠；印度墨汁（批號：6003182） 上海億欣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JJ600型精密電子天平 美國雙杰兄弟有限公司；AEY-220型電子分析天平 湘儀天平儀器設備有限公司；JB-SH數(shù)顯恒速強力電動攪拌機 上海標本模型廠；721N型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；371系列二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Calibur型流式細胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖的提取

準確稱取一定量經(jīng)粉碎、過篩的黑木耳顆粒，置于提取容器中，按照一定的液料比加入相應量的蒸餾水，在一定的溫度和攪拌轉(zhuǎn)速條件下加熱提取一定的時間（具體提取工藝條件見相應的實驗設計），然后用100 目的濾布將提取液過濾出來，加熱濃縮（濃縮比為10左右），得黑木耳多糖提取濃縮液，準確稱質(zhì)量，留樣待測。

1.3.2 濃縮液多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定濃縮液多糖含量。每次測定時，先制作標準曲線（以葡聚糖為標準），同時采用同樣的操作方法測定黑木耳多糖提取濃縮液的多糖含量，需要注意測定前通過醇沉操作將濃縮液中的多糖分離出來，然后再根據(jù)測定結果，按下式計算出樣品的多糖提取得率：

1.3.3 黑木耳多糖提取單因素試驗

選取經(jīng)粉碎后顆粒大小為40～60 目的黑木耳粉，固定提取液的總體積為600 mL（置于大小為1 L的燒杯中），設定液料比分別為25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g），沸水浴加熱，攪拌（攪拌機轉(zhuǎn)速均設定為150 r/min）提取50 min，研究液料比對黑木耳多糖得率的影響。隨后選擇優(yōu)選出的最佳條件，研究攪拌機轉(zhuǎn)速（100、150、200、250、300 r/min）、提取時間（30、40、50、60、70 min）、水浴加熱溫度（80、85、90、95、100 ℃）、黑木耳原料顆粒大?。?0～40、40～60、60～80、80～100、100 目）對黑木耳多糖得率的影響。

1.3.4 黑木耳多糖提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選取黑木耳原料顆粒大小、液料比、攪拌轉(zhuǎn)速和提取時間這4 個因素為考察因素，每個因素3 個水平，進行L9（34）正交試驗，因素與水平見表1。以多糖提取得率為指標，優(yōu)化出黑木耳多糖提取的最佳工藝條件。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 最佳工藝條件驗證實驗

以正交試驗所確定的最佳工藝條件對黑木耳進行多糖提取，驗證比較多糖提取得率。

1.3.6 黑木耳多糖的精制

按黎云龍等[21]的方法對黑木耳多糖進行脫色、脫蛋白處理，然后用蒸餾水溶解，再用無水乙醇醇沉，重復3 次，冷凍干燥，得到精制黑木耳多糖，用于動物實驗。

1.3.7 動物實驗

每天分別灌胃不同劑量（50、100、200 μL）0.5 g/100 mL的黑木耳多糖溶液，連續(xù)灌胃30 d，按《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）的方法進行測定，并計算臟器指數(shù)；參照文獻[22]的方法進行小鼠碳廓清實驗及小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?，計算吞噬率及吞噬指?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 黑木耳多糖提取單因素試驗結果

2.1.1 液料比對黑木耳多糖得率的影響

圖1 液料比對黑木耳多糖得率的影響Fig. 1 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

圖1 顯示，隨著液料比的升高，黑木耳多糖得率先逐漸升高，在液料比為35∶1（mL/g）時，升至最高，此后，隨提取液用量的進一步增加，多糖得率反而有所下降，不同液料比之間的差異有統(tǒng)計學意義（F=72.7，P＜0.05）；說明液料比升高對多糖溶出效果的促進作用有一定的限度，到達極限后再升高液料比，反而會使多糖得率降低。本單因素試驗得出的最佳液料比為35∶1（mL /g），低于陳艷秋等[12]的50∶1（mL/g）及魏紅等[13]的70∶1（mL/g）；這可能是由于本研究在進行多糖提取時，采用的是攪拌提取，而在上述文獻中，多糖的提取采用浸提而導致。

2.1.2 攪拌轉(zhuǎn)速對黑木耳多糖得率的影響

圖2 攪拌轉(zhuǎn)速對黑木耳多糖得率的影響Fig. 2 Effect of stirring speed on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

選擇最佳液料比35∶1（mL/g），改變攪拌機轉(zhuǎn)速，其他提取工藝條件不變，研究攪拌轉(zhuǎn)速對黑木耳多糖得率的影響，結果見圖2。結果顯示，在攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min時的黑木耳多糖得率明顯高于轉(zhuǎn)速為100 r/min（P＜0.05）；但進一步提高攪拌轉(zhuǎn)速，對多糖得率的影響不大，各組多糖得率差異不顯著（F=3.14，P=0.046）。加快攪拌轉(zhuǎn)速可以在一定程度上提高體系的傳質(zhì)速率，從而促進黑木耳原料中多糖的溶出；但是，如果攪拌轉(zhuǎn)速太快，原料與提取液（水）之間處于一種相對靜止的層狀運動狀態(tài)，將使它們之間的傳質(zhì)效果大大下降，從而導致多糖得率下降；因此攪拌轉(zhuǎn)速并非越快越好。

2.1.3 提取時間對黑木耳多糖得率的影響

圖3 提取時間對黑木耳多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

選擇液料比為35∶1（mL /g）、攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，其他提取工藝條件不變，研究提取時間對黑木耳多糖得

率的影響，結果見圖3。結果顯示，在提取初期，隨著提取時間的延長，黑木耳多糖得率逐步提高，方差分析結果表明各組多糖得率有顯著差異（F=16，P＜0.05）；當提取時間達到50 min時，多糖得率達到最高；此后，繼續(xù)延長提取時間，多糖得率差別不大（P＞0.05）；說明進一步延長提取時間，并不能提高多糖得率。本單因素試驗得出的最佳提取時間為50 min，大大低于陳艷秋等[12]的3.5 h及魏紅等[13]的4 h，與本研究采用了攪拌提取有關；因為攪拌可以提升體系的傳質(zhì)速率，從而縮短提取時間。

2.1.4 提取溫度對黑木耳多糖得率的影響

圖4 提取溫度對黑木耳多糖得率的影響Fig. 4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

選擇液料比35∶1（mL /g）、攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min、提取時間50 min，其他工藝條件不變，研究提取溫度對黑木耳多糖得率的影響，結果見圖4。結果顯示，隨著提取溫度上升，黑木耳多糖得率緩慢上升，方差分析結果表明各組多糖得率差異顯著（F=23.66，P＜0.05），沸水浴加熱（100 ℃）組的多糖得率明顯高于其他溫度稍低的各組（P＜0.05）；這與魏紅等[13]的實驗結果一致。

2.1.5 原料顆粒大小對黑木耳多糖得率的影響

圖5 原料顆粒大小對黑木耳多糖得率的影響Fig. 5 Effect of raw material particle size on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

選擇液料比35∶1（mL g）、攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min、提取時間50 min、提取溫度100 ℃，研究原料顆粒大小對黑木耳多糖得率的影響，結果見圖5。結果顯示，隨著原料顆粒大小的升高，黑木耳多糖得率逐步升高，且各組多糖得率有顯著差異（F=44.62，P＜0.05）；說明原料顆粒越細小，其中的多糖越容易提取出來。朱麗云等[23]采用超微粉碎法和普通機械法兩種不同工藝獲得粗粉、中粉、細粉及極細粉黑木耳，并研究了不同粒徑粉末對黑木耳多糖溶出效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)粉體粒度越小，細胞表面破裂程度越大，黑木耳多糖的溶出量越多。本研究發(fā)現(xiàn)顆粒大小為80 目粗多糖得率與100 目差異不大（P＞0.05）；因此選取原料顆粒大小為80 目。

2.2 黑木耳多糖提取工藝正交試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，以黑木耳多糖得率為指標，選取原料顆粒大小、液料比、攪拌轉(zhuǎn)速、提取時間4 個因素為考察因素（提取溫度均為沸水浴加熱提?。?，每個設置因素3 個水平，進行L9（34）正交試驗設計，結果見表2。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可知，極差分析結果為RA＞RD＞RC＞RB，說明影響黑木耳多糖得率的因素中，因素A（顆粒大小）的影響最大，其次是提取時間和攪拌轉(zhuǎn)速，液料比的影響最小。優(yōu)化得到的最佳提取工藝組合是A2B1C2D3，即：原料顆粒大小80 目、液料比30∶1（mL/g）、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、提取時間70 min。

2.3 最佳工藝條件驗證實驗結果

按照正交試驗優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件，即：液料比30∶1（mL/g）、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、提取時間70 min、原料顆粒大小80 目，沸水浴加熱提取，平行做了5 次實驗，多糖得率均在8%以上，平均得率為8.46%，高于正交試驗表中各試驗的結果；說明按照正交試驗優(yōu)化得到的最佳工藝條件進行提取，確實能夠進一步提高黑木耳多糖得率。

2.4 黑木耳多糖對免疫器官臟器指數(shù)的影響

表3 黑木耳多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 3 Effect of A. auricular crude polysaccharide on mouse immune organs

從表3可以看出，與正常對照組相比，黑木耳多糖低、中和高劑量組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)都有一定程度升高，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.5 黑木耳多糖對巨噬細胞功能的影響

表4 黑木耳多糖對小鼠單核-巨噬細胞和腹腔巨噬細胞功能的影響Table 4 Effect of activity of mouse mononuclear macrophages and peritoneal macrophages

從表4可以看出，與正常對照組相比，除黑木耳多糖高劑量組單核-巨噬細胞的吞噬指數(shù)顯著升高外（P＜0.05），中劑量、低劑量組小鼠單核-巨噬細胞的吞噬指數(shù)均極顯著性升高（P＜0.01）；單核-巨噬細胞的吞噬系數(shù)結果顯示，各劑量組吞噬系數(shù)均有升高，但僅中劑量組有顯著性升高（P＜0.05）。

表4結果顯示，與正常對照組相比，黑木耳多糖各劑量組均顯著地增強了小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力（P＜0.05，P＜0.01），且最佳處理為中劑量組。結果說明黑木耳多糖能夠活化小鼠腹腔巨噬細胞的功能，增加吞噬能力，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，這與文獻[24]報道一致。

3 結 論

本研究采用水提法進行黑木耳多糖提取，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗，優(yōu)化得到黑木耳多糖提取的最佳工藝條件為：原料顆粒大小80 目、液料比30∶1（mL/g）、沸水浴加熱、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、提取70 min。在此最佳工藝條件下，黑木耳的粗多糖提取得率均在8%以上，平均得率為8.46%。

動物實驗結果表明，每天分別灌胃不同劑量（50、100、200 μL）0.5 g/100 mL的黑木耳多糖溶液，連續(xù)灌胃30 d，對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)無顯著影響，但可明顯提高單核-巨噬細胞的吞噬能力，說明黑木耳多糖具有提高動物非特異性免疫能力的作用。

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Optimization of Extraction Conditions of Crude Polysaccharide from Auricularia auricular and Its Effects on the Functions of Mouse Peritoneal Macrophages

XU Hailin1, WU Xiaoyong2,*, NIE Shaoping3, HUANG Yansheng4, TANG Qingtao4
(1. School of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510310, China; 2. School of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528453, China; 3. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 4. Infi nitus (China) Co. Ltd., Xinhui 529156, China)

In this study, the extraction conditions of water-soluble polysaccharide from dried fruiting bodies of Auricularia auricular were investigated by single-factor and orthogonal array design methods. The infl uence of liquid-to-solid ratio, stirring speed, extraction time, extraction temperature and the particle size of the dried material on extraction effi ciency was analyzed. The optimal extraction conditions were established based on the extraction yield of polysaccharide. Results showed that the most important factor was the particle size of the dried material, followed by extraction time, stirring speed and liquid-to-solid ratio. The optimal parameters determined in this study were as follows: the particle size, 80 mesh; liquidto-solid ratio, 30:1(mL/g); stirring speed, 200 r/min, extraction temperature, 100 ℃; and extraction time, 70 min. Under these conditions, the polysaccharide yield from A. auricular was 8.46%. The effects of the crude polysaccharide extracted from A. auricular on the immunologic functions of mouse macrophages were also investigated through carbon clearance test and peritoneal macrophage phagocytosis function test using fl uorescence labeled microspheres. Additionally, the effects of the crude polysaccharide on immune organs were also examined. Results indicated that while the crude polysaccharide had no signifi cant infl uences on the body weight, thymus index or spleen index of the animals, it signifi cantly improved the phagocytosis of mononuclear macrophage. In conclusion, the crude polysaccharide extracted from A. auricular can enhance animal nonspecifi c immunity.

Auricularia auricular; polysaccharide; extraction process; macrophage

10.7506/spkx1002-6630-201610017

TS201.2

A

1002-6630（2016）10-0100-05

許海林, 吳小勇, 聶少平, 等. 黑木耳多糖提取工藝優(yōu)化及其對小鼠巨噬細胞功能的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 100-104. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610017. http://www.spkx.net.cn

XU Hailin, WU Xiaoyong, NIE Shaoping, et al. Optimization of extraction conditions of crude polysaccharide from Auricularia auricular and its effects on the functions of mouse peritoneal macrophages[J]. Food Science, 2016, 37(10): 100-104. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610017. http://www.spkx.net.cn

2015-08-10

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室開放基金項目（SKLF-KF-201408）

許海林（1984—），女，碩士研究生，主要從事多糖結構與功能研究。E-mail：xuhailin505@163.com

*通信作者：吳小勇（1972—），男，副教授，博士，主要從事功能性食品的研究與開發(fā)。E-mail：perryfe@163.com