劉麗莉，王 煥，李 丹，尹光俊，康懷彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

雞蛋清卵白蛋白酶解工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)

劉麗莉，王 煥，李 丹，尹光俊，康懷彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

研究雞蛋清卵白蛋白的酶解工藝及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)，以水解度為指標(biāo)，確定最佳酶源為堿性蛋白酶，其水解度為26.55%，顯著優(yōu)于其他蛋白酶（P＜0.05）。以堿性蛋白酶酶解雞蛋清卵白蛋白，采用單因素和五元二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)研究酶解工藝；針對(duì)酶解前后卵白蛋白的功能特性進(jìn)行分析，并采用紫外掃描、傅里葉紅外變換光譜、差示掃描量熱針對(duì)卵白蛋白及其酶解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶酶解雞蛋清卵白蛋白最佳工藝條件為反應(yīng)溫度52.5 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、pH 8.25、酶用量5 500 U/g、底物添加量5%，此條件下水解度為27.88%。酶解后產(chǎn)物表面巰基含量降低了3.6 mol/（L·g），溶解度大幅度提高，起泡性降低了18.18%，泡沫穩(wěn)定性降低了20.24%，乳化活性指數(shù)升高了13.56 m2/g，乳化穩(wěn)定性提高了10.46%。同時(shí)，酶解后的卵白蛋白肽鏈發(fā)生了裂解，有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出更多氨基酸殘基，α-螺旋略有減少，β-轉(zhuǎn)角相應(yīng)增加，親水基團(tuán)也相應(yīng)的增加。

雞蛋清卵白蛋白；酶解物；結(jié)構(gòu)表征；功能特性

卵白蛋白是一種含糖蛋白質(zhì)，大約含有3%的糖基，其中乙酰葡萄糖胺占1.3%，甘露糖為1.7%。卵白蛋白由385 個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為4.5，每一個(gè)分子有一根糖鏈，N-端和C-端的氨基酸分別為乙酰甘氨酸和脯氨酸，有1 個(gè)雙硫鍵和4個(gè)巰基，分子質(zhì)量約為45 kD[1]。卵白蛋白可以大批量獲得，但分子不耐酶解，用鏈霉蛋白酶水解其晶體，可以生成5 個(gè)含天冬酞胺糖基的組分[2]。卵白蛋白電泳性質(zhì)稍有不同的3 組分Al、A2和A3的混合物。A1含2 個(gè)磷酸基，A2含1 個(gè)磷酸基，A3不含磷酸基，它們之間的比例為85∶12∶3[3-4]。

蛋清粉黏度大、腥味重、受熱易凝固、溶解性差，這些性質(zhì)限制了它在食品加工中的應(yīng)用。蛋白酶解技術(shù)可使蛋白質(zhì)部分降解，從而使其溶解性提高、黏度和熱凝固性降低，并可促使呈味氨基酸或小肽釋放，改善其風(fēng)味[5]。此外，蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的小肽比大分子蛋白質(zhì)更易吸收，并能產(chǎn)生具有一定功能特性的小分子肽[6]。因此，利用酶解技術(shù)對(duì)蛋清粉進(jìn)行部分降解，可制備出既可滿(mǎn)足食品加工業(yè)需求，又具有有益生理活性的蛋清蛋白肽。卵白蛋白的多肽鏈中含有一些特殊的肽，選擇適宜的蛋白酶水解可以得到一些具有特異生理調(diào)節(jié)功能的活性肽[7]。Fujita等[8]分別用胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解卵白蛋白，堿性蛋白酶解物用反相高效液相色譜分離出具有血管舒張活性的物質(zhì)OA358.365，在胰凝乳蛋白酶酶解物中也分離出Ovokinin（2.7）和OA359.364，這二種肽對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠具有降壓作用[9]。Xu Mingsheng等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，卵白蛋白酶解物具有強(qiáng)抗氧化活性。

目前我國(guó)針對(duì)禽蛋高附加值的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用有限，尤其在專(zhuān)用蛋清粉的開(kāi)發(fā)方面一直是疑難問(wèn)題。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和功能特性直接相關(guān)，改性就是基于結(jié)構(gòu)決定功能的這一基本原理，用物理因素或生化因素使其氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生變化，引起蛋白大分子空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的改變，在不影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基礎(chǔ)上，來(lái)獲得較好的功能特性。在這種形式下，應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)蛋清粉的特性進(jìn)行改造開(kāi)發(fā)出功能性的蛋清粉，研究酶解雞蛋清卵白蛋白的最佳工藝，并對(duì)酶解前后的卵白蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋購(gòu)買(mǎi)于河南省洛陽(yáng)市南昌路丹尼斯超市。

木瓜蛋白酶（1.0×104U/g）、中性蛋白酶（5.0×104U/g）、堿性蛋白酶（1.0×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（1.6×104U/g） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；甲醛、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）試劑 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-E超速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；Beta2.8LD型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；UV1800紫外分光光度儀 美國(guó)Mapada公司；470FT-IR紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；204F1差示掃描量熱儀德國(guó)Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 卵白蛋白的提取工藝流程

鮮雞蛋→清洗→分離得到蛋清→雙層紗布過(guò)濾→0.9%的生理鹽水5 倍稀釋→3 000 r/min離心15 min（去除卵黏蛋白）→取上清液鹽析（pH 4.5）→4 500 r/min離心15 min→去除上清液→粗蛋白→透析法脫鹽→卵白蛋白→真空冷凍干燥[11]（卵白蛋白純度為89.34%）

1.3.2 卵白蛋白的酶解工藝流程

配制5%卵白蛋白粉溶液作為底物溶液，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)底物溶液的pH值，在設(shè)定溫度的水浴鍋中溫育10 min后，加入設(shè)定量的酶進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為所設(shè)計(jì)時(shí)間。水解過(guò)程中水浴控溫，每30 min振蕩混勻1 次，酶解反應(yīng)期間用pH計(jì)監(jiān)測(cè)卵白蛋白溶液的pH值，并通過(guò)滴加NaOH溶液來(lái)調(diào)節(jié)pH值，使pH值保持在一定的值。

1.3.2.1 蛋白酶的篩選

針對(duì)堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶進(jìn)行初步篩選，通過(guò)單個(gè)酶解卵白蛋白實(shí)驗(yàn)，分析比較各酶的水解能力。

1.3.2.2 酶解工藝條件單因素試驗(yàn)

分別考察反應(yīng)溫度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）、反應(yīng)時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7 h）、反應(yīng)pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）、酶用量（3 000、4 000、5 000、6000、7 000、8 000 U/g）、底物添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）對(duì)酶解反應(yīng)水解度的影響。

1.3.2.3 酶解工藝條件優(yōu)化正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用DPS版軟件進(jìn)行五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)。以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值、酶用量、底物添加量5 個(gè)因素為自變量，以水解度為響應(yīng)值，設(shè)立了36 個(gè)處理組，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their coded levels used in quadratic general rotary unitized desiiggnn

1.3.3 水解度的測(cè)定

水解后生成的—NH2的量由甲醛滴定法[12]測(cè)得，樣品總含N量由凱氏定氮法測(cè)定[13]。

1.3.4 卵白蛋白功能特性的測(cè)定

1.3.4.1 巰基含量的測(cè)定

取4 mL 0.1 mol/L pH 8.5 Tris-甘氨酸緩沖液（含0.01 mol/L乙二胺四乙酸）加入到1 mL 5%卵白蛋白溶液中，40 ℃保溫30 min，加入125 μL DTNB試劑（20 mg），再在25 ℃顯色10 min，測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處的吸光度[14]。以半胱氨酸作為參比溶液。巰基含量按公式（2）計(jì)算：

式中：A412nm為樣品在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度；ρ為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.4.2 溶解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)的溶解性采用蛋白質(zhì)的溶解度來(lái)表示，即水溶性氮含量占樣品中總氮含量的百分?jǐn)?shù)。水溶性氫氧化鉀溶解法[15]，稱(chēng)取樣品1 g于100 mL燒杯中，取50 mL 2%氫氧化鉀溶液與之混合，磁力攪拌120 min，以2 700 r/min離心10 min，靜置數(shù)分鐘取上清液15 mL，用凱氏定氮法測(cè)定其中的氮含量，總氮含量同樣采用凱氏定氮法測(cè)定。蛋白質(zhì)溶解度按公式（3）計(jì)算：

1.3.4.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

采用攪打發(fā)泡法[16]測(cè)定起泡性：分別將酶解前后的卵白蛋白粉溶于pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，配成5%的卵白蛋白溶液。取40 mL蛋白溶液，記錄起始高度H0。在高速分散機(jī)中，以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪打2 min，記錄泡沫高度H1，按公式（4）計(jì)算卵白蛋白的起泡性：

蛋清蛋白泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定：靜置30 min后，測(cè)定泡沫高度H2，按式（5）計(jì)算泡沫穩(wěn)定性：

1.3.4.4 乳化特性及乳化穩(wěn)定性

參照Pearce等[17]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。分別取酶解前后的2 種蛋白干燥樣，用Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.4）配制成1%的蛋白溶液，即谷蛋白和面筋蛋白懸浮液，取該懸浮液15 mL，加入5 mL植物油，用均質(zhì)機(jī)10 000 r/min均質(zhì)1 min，分別于均質(zhì)后0、10 min取均質(zhì)樣的最底層乳化液0.1 mL加入到100 mL 0.1%的SDS溶液中，以0.1% SDS液為空白，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A500nm）。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性見(jiàn)式（6）、（7）：

式中：C為蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度/（g/mL）；?為油相所占分?jǐn)?shù)/%；L為比色池光徑/cm。

式中：Δt為乳化液放置時(shí)間/min；A0為0 min時(shí)樣品在500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；?A為10 min后吸光度A10與開(kāi)始時(shí)吸光度A0差值。

1.3.5 卵白蛋白結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 酶解前后卵白蛋白的紫外光譜分析

分別將酶解前后的卵白蛋白溶于50 mmol/L、pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，配制成0.01 mg/mL蛋白溶液，樣品分別在200～400 nm波長(zhǎng)處用紫外分光光度計(jì)掃描[18]。

1.3.5.2 酶解前后卵白蛋白紅外光譜分析

將一定量干燥后的 KBr和冷凍干燥后的卵白蛋白樣品置于瑪瑙研缽中，研磨均勻，盡量呈粉末狀，裝樣，手動(dòng)壓片，取出樣品小心輕放入樣品室。采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品在400～4 000 cm-1區(qū)間掃描[18]。

1.3.5.3 差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）分析

稱(chēng)量10 mg左右的樣品放入鋁坩鍋中，將蛋白分別從30 ℃加熱升溫至150 ℃，加熱速率為10 ℃/min。同時(shí)做空白對(duì)照[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Pro 8.5軟件對(duì)單因素、巰基含量、溶解性數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；采用DPS V7.0專(zhuān)業(yè)版和設(shè)計(jì)專(zhuān)家Design-Expert 8.0程序進(jìn)行分析，作響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶的選擇

圖1 不同蛋白酶的水解度的比較Fig. 1 Comparison of DH values among different proteases

由圖1可知，堿性蛋白酶的水解度達(dá)到26.55%，水解能力顯著優(yōu)于其他3 種蛋白酶（P＜0.05），原因可能是堿性蛋白酶的酶活力高于其他3 種蛋白酶，同時(shí)堿性蛋白的最適pH值是在8.5左右，而在堿性條件下又能使蛋白質(zhì)自身裂解。因此選用堿性蛋白酶為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的水解酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)溫度和時(shí)間的確定

圖2 反應(yīng)溫度（a）和時(shí)間（b）對(duì)水解度的影響Fig. 2 Inf luence of reaction temperature and time on the hydrolysis degree

由圖2a可知，開(kāi)始時(shí)雞蛋清卵白蛋白水解度隨反應(yīng)溫度的升高而增大，在反應(yīng)溫度55 ℃左右卵白蛋白的水解度達(dá)到最大值，隨后水解度開(kāi)始下降。隨著反應(yīng)溫度的升高，堿性蛋白酶失活，水解度降低，因此最佳酶解溫度為55 ℃。

由圖2b可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)雞蛋清卵白蛋白水解度增加，在反應(yīng)5 h左右卵白蛋白的水解度達(dá)到最大值，隨后水解度開(kāi)始緩慢下降，6 h后基本保持不變。因此，堿性蛋白酶水解雞蛋清卵白蛋白的最佳時(shí)間為5 h。

2.2.2 反應(yīng)pH值、酶用量、底物添加量的確定

圖3 反應(yīng)pH值（a）、酶用量（b）、底物添加量（c）對(duì)水解度的影響Fig. 3 Infl uence of pH, enzyme concentration and substrate concentration on the hydrolysis degree

由圖3a可知，在其他反應(yīng)條件確定下，改變反應(yīng)pH值，開(kāi)始時(shí)雞蛋清卵白蛋白水解度隨反應(yīng)pH值的升高而增大，在pH值達(dá)到8.5左右，卵白蛋白的水解度達(dá)到最大值，隨后水解度開(kāi)始下降。隨著pH值升高，堿性蛋白酶失活，水解度降低，因此最佳酶解pH值為8.5。

由圖3b可知，在其他反應(yīng)條件確定下，改變酶用量，開(kāi)始時(shí)雞蛋清卵白蛋白水解度隨著堿性蛋白酶用量的增加而增大，當(dāng)酶用量達(dá)到5 000 U/g時(shí)，水解度達(dá)到最大值。隨后，可能是因?yàn)殡S著酶用量的增加反應(yīng)體系發(fā)生酶抑制反應(yīng)，水解度開(kāi)始緩慢下降，當(dāng)酶用量達(dá)到6 000 U/g時(shí)，水解度基本趨于穩(wěn)定。因此最佳酶用量為5 000 U/g。

由圖3c可知，在其他反應(yīng)條件確定下，改變底物添加量，開(kāi)始時(shí)水解度隨卵白蛋白添加量的增加而增大，當(dāng)?shù)孜锾砑恿窟_(dá)到5%時(shí)，水解度達(dá)到最大值。繼續(xù)增大卵白蛋白的添加量，卵白蛋白的水解度隨卵白蛋白添加量增大而減小。為此，選取底物添加量為5%進(jìn)行酶解反應(yīng)條件的研究。

2.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)五元二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，根據(jù)表1的因素和水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的回歸方程如下：

Y=26.43+0.364 2X1+2.086 7X2+1.059 1X3-0.432 5X4+0.475 0X5-1.008 7X12-0.835 0X22-1.575 0X32-0.046 3X42+0.233 8X52-1.525X1X2+ 0.226 3X1X3-0.385 0X1X4-0.141 3X1X5-0.531 3X2X3-0.482 5X2X4-0.063 8X2X5+0.078 8X3X4-0.01X3X5+ 0.311 3X4X5

由方差分析可知，回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F1=10.77（F0.05（6,9）=4.06）不顯著，可以認(rèn)為所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?。?duì)回歸系數(shù)檢驗(yàn)可知方程的決定系數(shù)R2=0.898 5，說(shuō)明該模型能解釋89.85%的數(shù)據(jù)，表明該模型擬合結(jié)果好，試驗(yàn)誤差小，能夠正確反映各因素與水解度的數(shù)量關(guān)系，以此數(shù)學(xué)模型來(lái)模擬酶解反應(yīng)的得率有效。

表2 五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果（n==33）Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimental design in terms of coded values of fi ve variables and corresponding experimental resulttss ((n = 3)

2.3.1 方差分析和顯著性檢驗(yàn)

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of the response surface regression moddeell

續(xù)表3

2.3.2 雙因素交互效應(yīng)分析

圖4 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間的交互影響水解度的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the degree of hydrolysis as a function of hydrolysis temperature and time

由回歸方程偏回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，只有X1（反應(yīng)溫度）和X2（反應(yīng)時(shí)間）兩因素間存在著顯著的交互作用，其他因素間的交互作用差異均不顯著。由于二次項(xiàng)系數(shù)之間具有相關(guān)性，因此這些微弱的交互項(xiàng)不能刪除，因此只分析X1和X2之間的交互作用。同樣采用降維法[20]，固定另外2 個(gè)因素取零水平。交互作用方程為：Y12=26.43+0.364 2X1+2.086 7X2-1.008 7X12-0.835 0X22-1.525 0X1X2

等高線(xiàn)的形狀可以反映因素間交互作用的大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[21]。由圖4可知，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間存在一定的交互作用。

當(dāng)反應(yīng)溫度一定時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)時(shí)間先升高后降低，水解度在編碼值4～8 h達(dá)到最大值；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間一定時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，水解度也是先升高后降低，在編碼值為40～55 ℃時(shí)達(dá)到最大值。由此可知，X1、X2在編碼為0～1時(shí)交互作用最明顯。

2.4 利用回歸方程確定最佳作用參數(shù)和模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用DPS V7.5專(zhuān)業(yè)版和設(shè)計(jì)專(zhuān)家Design-Expert.8.0分析，得到各因素的最佳酶解條件組合為反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、pH 8.25、酶用量5 500 U/g、底物添加量5%，最高水解度預(yù)測(cè)值為28.73%，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得水解度平均為（27.88±0.27）%，偏差絕對(duì)值小于1.0%，表明通過(guò)優(yōu)化的水解條件可信。

2.5 酶解前后的雞蛋清卵白蛋白功能特性的變化

2.5.1 巰基含量分析

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間表面巰基含量的變化Fig. 5 Changes surface hydrosulfuryl content at different reaction time

由圖5可以看出，蛋白質(zhì)分子表面巰基含量與反應(yīng)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，即水解程度越大，巰基含量越少，蛋白的疏水性越弱。一方面因?yàn)槊刚T導(dǎo)破壞了卵白蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域；另一方面在酶產(chǎn)物制備過(guò)程中一些疏水性多肽或片段在離心過(guò)程中被去除[22-23]。

2.5.2 溶解性分析

圖6 雞蛋清卵白蛋白及其水解物的溶解度比較Fig. 6 Protein solubility profi les of OVA and its hydrolysate

由圖6可得出，在pH 2.5～8.5條件下酶解后的雞蛋清卵白蛋白溶解度顯著高于卵白蛋白（P＜0.05），這是因?yàn)樵诿附膺^(guò)程中使蛋白分子斷裂，破壞了其巰基，暴露出更多的親水基團(tuán)，從而使其溶解度增加。酶解后卵白蛋白的等電點(diǎn)也發(fā)生了顯著性的變化，卵白蛋白的在其等電點(diǎn)4.5的溶解度最小，而酶解后的卵白蛋白在pH 5.5時(shí)溶解度最低，說(shuō)明水解改變了蛋白的等電點(diǎn)。

2.5.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性分析

表4 雞蛋清卵白蛋白及其水解物的起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性Table 4 Foaming capacity, foam stability, emulsifying capacity and emulsion stability of OVA and its hydrolysate

由表4可知，雞蛋清卵白蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性值分別為52.67%和60.63%。但酶解處理導(dǎo)致了起泡性和穩(wěn)定性明顯降低，且起泡性比穩(wěn)定性下降趨勢(shì)更為顯著。由此表明，酶解導(dǎo)致了雞蛋清卵白蛋白起泡性的下降，原因可能是：酶解使得分子間作用力降低，包圍泡沫的黏彈性膜難以形成；另外酶解使得雞蛋清卵白蛋白的親水性增強(qiáng)疏水性減弱，在攪打和起泡過(guò)程中，雞蛋清卵白蛋白分子在氣液界面上的快速吸附能力降低。

2.5.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性分析

乳化性是指蛋白質(zhì)溶液從油包水變成水包油的形成穩(wěn)定乳化液的能力，乳化性越強(qiáng)，形成的乳化液越穩(wěn)定，不易形成沉淀[24]。蛋白質(zhì)的乳化性主要受蛋白的溫度、濃度、pH值、離子強(qiáng)度影響，由表4可以看出，酶解后的卵白蛋白乳化活性指數(shù)提高了13.56 m2/g，乳化穩(wěn)定性提高了10.46%，這表明酶解后的蛋清卵白蛋白親水基團(tuán)伸展到水相中，增加了親水性，從而增加了蛋白質(zhì)分子的親水親油平衡值，提高了乳化性和乳化穩(wěn)定性。

2.6 酶解前后雞蛋清卵白蛋白結(jié)構(gòu)表征

2.6.1 酶解前后卵白蛋白紫外光譜分析

圖7 雞蛋清卵白蛋白及其水解物紫外掃描圖Fig. 7 UV scanning spectra of OVA and its hydrolysate

由圖7可看出，酶解前后的雞蛋清卵白蛋白在波長(zhǎng)280 nm附近都有強(qiáng)烈的吸收峰，這是由于卵白蛋白所特有的吸收峰一般在280 nm左右。因?yàn)樯彼幔═rp）、酪氨酸（Tyr）殘基的側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)光的優(yōu)先吸收，其次是苯

丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）殘基的側(cè)鏈和肽鍵對(duì)光的吸收，其中Trp和Tyr在280 nm波長(zhǎng)附近有一個(gè)吸收峰，因此蛋白質(zhì)能夠吸收一定波長(zhǎng)范圍的紫外光[25]。酶解后的卵白蛋白肽紫外吸收峰發(fā)生了藍(lán)移，說(shuō)明卵白蛋白Trp、Tyr殘基的側(cè)鏈基團(tuán)分布發(fā)生了變化。且最大吸收峰在一定程度上增強(qiáng)了，酶解后的卵白蛋白分子的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)減少，具有紫外吸收的芳香氨基酸殘基由分子暴露出來(lái)，使分子表面具有紫外吸收的氨基酸殘基增多，從而導(dǎo)致紫外吸光度增加[26]。

2.6.2 酶解前后雞蛋清卵白蛋白的傅里葉紅外光譜分析

圖8 雞蛋清卵白蛋白及其水解物紅外光譜圖Fig. 8 FT-IR spectra of OVA and its hydrolysate

由圖8可知，雞蛋清卵白蛋白和酶解后的卵白蛋白紅外圖譜存在一定的差異，說(shuō)明兩者的微觀結(jié)構(gòu)有很大的不同，由此可以基本確定酶解作用使卵白蛋白肽鏈裂解，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此其紅外圖譜呈現(xiàn)出很大的差異。蛋白質(zhì)在紅外區(qū)有若干特征吸收帶，其中酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm-1）對(duì)于研究二級(jí)結(jié)構(gòu)最有價(jià)值。游離羥基在3 700～3 200 cm-1處有伸縮振動(dòng)吸收，極性的C-O鍵伸縮振動(dòng)在1 200～1 000 cm-1內(nèi)有強(qiáng)吸收峰。由圖8可知，Ⅰ和Ⅱ在1 220～1 245 cm-1都有蛋白質(zhì)的特征吸收峰，但Ⅱ的吸收峰比Ⅰ明顯較弱，說(shuō)明酶解作用破壞卵白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致特征吸收峰減弱。α-螺旋特征吸收頻率為1 330～1 290 cm-1，Ⅰ在1 330 cm-1出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的特征吸收峰，α-螺旋是肽鏈骨架上由n位氨基酸殘基上的—C=O與n+4位殘基上的—NH之間形成的氫鍵起著穩(wěn)定的作用，因此這個(gè)吸收峰的形成是N—H鍵變形振動(dòng)的結(jié)果，Ⅱ在此階段并沒(méi)明顯的特征吸收峰，表明酶解作用破壞了其α-螺旋結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)裂解成小分子肽，更利于人體需要。1 265～1 290 cm-1為β-轉(zhuǎn)角伸縮振動(dòng)，β-轉(zhuǎn)角的特定構(gòu)象在一定程度上取決于它的氨基酸序列。Ⅱ在1270 cm-1出現(xiàn)了其特征吸收峰，說(shuō)明卵白蛋白與酶發(fā)生反應(yīng)破壞了其原來(lái)的肽鏈結(jié)構(gòu)，暴露出更多的氨基酸的殘基，而脯氨酸具有換裝結(jié)構(gòu)和固定角的作用，因此在一定程度上迫使β-轉(zhuǎn)角形成。

2.6.3 酶解前后雞蛋清卵白蛋白熱收縮溫度分析

圖9 雞蛋清卵白蛋白及其水解物熱收縮溫度的分析Fig. 9 DSC of OVA and its hydrolysate

由圖9可知，酶解前后雞蛋清卵白蛋白的差示掃描量熱曲線(xiàn)變化很明顯。曲線(xiàn)出現(xiàn)了明顯的吸熱峰，這是蛋白質(zhì)在加熱處理時(shí)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常變化，即發(fā)生變性所致。在天然狀態(tài)下卵白蛋白成橢圓狀，幾乎所有的肽鏈都有二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，且疏水中心內(nèi)部含有1 個(gè)二硫鍵、4 個(gè)自由巰基，與卵白蛋白分子的聚集行為息息相關(guān)[27-28]。而蛋白質(zhì)的氨基酸組成影響蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，含有高比例的疏水性氨基酸殘基比親水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)一般更為穩(wěn)定，酶解后的卵白蛋白溶解性增加暴露出的親水基團(tuán)增加，所以酶解后蛋白的熱變形溫度變低。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)雞蛋清卵白蛋白的酶解工藝進(jìn)行研究，確定了酶解蛋清蛋白的最佳酶源為堿性蛋白酶，最佳工藝條件為反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、pH 8.25、酶用量5 500 U/g、底物添加量5%，在此條件下水解度可高達(dá)27.88%。

通對(duì)酶解前后雞蛋清卵白蛋白的功能特性進(jìn)行分析，得出酶解后產(chǎn)物巰基含量降低了3.6 mol/（L·g），溶解度大幅度提高，起泡性降低了18.18%，泡沫穩(wěn)定性降低了20.24%，乳化活性指數(shù)升高了13.56 m2/g，乳化穩(wěn)定性提高了10.46%。

通過(guò)采用紫外掃描、傅里葉紅外光譜、差示掃描量熱針對(duì)雞蛋清卵白蛋白及其酶解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果表明，酶解后的卵白蛋白肽鏈發(fā)生了裂解，有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出更多氨基酸殘基，α-螺旋略有減少，β-轉(zhuǎn)角相應(yīng)增加，親水基團(tuán)也相應(yīng)的增加。

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Enzymatic Hydrolysis and Structural Properties of Egg White Ovalbumin

LIU Lili, WANG Huan, LI Dan, YIN Guangjun, KANG Huaibin
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The enzymatic hydrolysis of egg white albumin and changes in its structural properties were studied. As evaluated in terms of degree of hydrolysis (DH), alkaline protease was determined as the bes t enzyme to hydrolyze egg white albumin, which was signifi cantly superior to other proteases tested, providing a DH value of 26.55% (P ＜ 0.05). The enzymatic hydrolysis process was studied through single factor and quadratic general rotary unitized design experiments. The structural properties of egg white albumin and its hydrolysate were characterized by ultraviolet (UV), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and differential scanning calorimetry (DSC). The results showed that the optimum hydrolysis conditions were as follows: hydrolysis temperature, 52.5 ℃; hydrolysis time, 5 h; pH, 8.25; enzyme dosage, 5 500 U/g; and substrate concentration, 5%. Under these conditions, the maximum DH value of 27.88% was obtained. The resulting hydrosulfuryl content showed a decrease of 3.6 mol/(L·g) in surface hydrosulfuryl, a signifi cant increase in solubility, a decrease of 18.18% in foaming ability, and a reduction of 20.24% in foam stability as compared to egg white albumin. Moreover, the emulsifying index and emulsion stability of the hydrolysate increased by 13.56 m2/g and 10.46%, respectively. At the same time, the enzymatic hydrolysis led to peptide chain cleavage of egg albumin, damage to the ordered secondary structure, exposure of more amino acid residues, slight decrease in α-helix, and corresponding increases in β-turns and hydrophilic groups.

egg white ovalbumin (OVA); hydrolysate; structure characterization; functional property

10.7506/spkx1002-6630-201610010

TS253.1

A

1002-6630（2016）10-0054-08

劉麗莉, 王煥, 李丹, 等. 雞蛋清卵白蛋白酶解工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 54-61. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201610010. http://www.spkx.net.cn

LIU Lili, WANG Huan, LI Dan, et al. Enzymatic hydrolysis and structural properties of egg white ovalbumin[J]. Food Science, 2016, 37(10): 54-61. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610010. http://www.spkx.net.cn

2015-08-19

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303084）；河南省重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（152102110080）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401622）；河南科技大學(xué)高級(jí)別項(xiàng)目培育基金項(xiàng)目（2013ZCX012）；河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13A550255）

劉麗莉（1974—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：yangliuyilang@ 126.com