楊申明，范樹國，文美瓊，王振吉*，謝 靖

（楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000）

微波輔助提取澳洲堅果殼多糖的工藝優(yōu)化及抗氧化性評價

楊申明，范樹國，文美瓊，王振吉*，謝 靖

（楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000）

優(yōu)化微波輔助提取澳洲堅果殼多糖的提取工藝，并測定其多糖的抗氧化性。在單因素試驗的基礎上，以多糖提取率為指標，通過L9（33）正交試驗優(yōu)化其多糖的提取工藝參數(shù)，并通過澳洲堅果殼多糖對?OH、1,1-苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和O2-?的清除來評價其抗氧化能力。結果表明，最佳提取工藝參數(shù)為微波功率200 W、微波時間2.5 min、料液比1∶50 （g/mL），在該條件下多糖的平均提取率為0.70%；多糖質量濃度為0.027 5 mg/mL時，對? OH、DPPH自由基和O2-?的清除率可分別達到63.11%、61.90%和80.09%，說明提取的澳洲堅果殼多糖對? OH、DPPH自由基和O2-?有較好的清除能力。

澳洲堅果殼；微波提取；多糖；抗氧化性

澳洲堅果屬山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅果屬（Macadamia F. Muell.）多年生常綠果樹[1-2]。在我國主要栽培地區(qū)是云南、廣西，其中云南省是全國澳洲堅果栽培大省[3-4]。澳洲堅果營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值很高，果仁

含有豐富的不飽和脂肪酸[5]，同時還富含人體所需的可溶性總糖、淀粉、蛋白質、氨基酸和對人體有保健作用的Ca、Zn、Mg、Fe、Cu、Mn等礦物質，長期食用澳洲堅果可預防動脈粥樣硬化、心血管疾病、降血糖、抗腫瘤、防癌癥、抗衰老等多種疾病的發(fā)生[6-7]。

目前，國內外對澳洲堅果的研究多數(shù)集中在種植、病蟲防治、生理生化、果仁成分營養(yǎng)、加工工藝等方面[6,8]，而對澳洲堅果殼的研究相對較少。蘆燕玲等[8]建立了微波萃取和頂空直接進樣氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對澳洲堅果殼的揮發(fā)性成分進行了分析研究，劉曉芳等[9-10]對澳洲堅果殼制備活性炭的工藝和澳洲堅果殼活性炭對重金屬離子Cr（Ⅵ）的吸附特性進行研究，寧平等[11]對澳洲堅果殼活性炭制備的熱解特性進行研究，石柳等[12]對澳洲堅果殼中纖維素和木質素成分進行了分析研究。其他有關澳洲堅果殼的研究鮮見報道，大部分澳洲堅果殼被當成燃料燃燒，甚至丟棄，既浪費了資源又給環(huán)境造成一定的污染。如果從果殼中提取其有效成分，既綜合利用了資源，增加了澳洲堅果的附加值，又減少了環(huán)境的污染，具有一定的經(jīng)濟意義和價值。

近年來，植物多糖作為一種重要的功效成分，其應用范圍正不斷擴大，而對澳洲堅果殼中多糖類物質的提取和抗氧化性研究鮮見相關報道。本研究以澳洲堅果殼為材料，采用微波輔助提取澳洲堅果殼多糖，通過顯色反應進行鑒定，并利用苯酚-濃硫酸比色法測定其含量，通過正交試驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并對所提取的多糖從清除?OH、1,1-苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和O2-?的能力3 個方面評價其抗氧化性，這為更好地開發(fā)和利用澳洲堅果殼中多糖類物質提供了科學依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲堅果殼：澳洲堅果產(chǎn)于云南德宏，手工剝殼后得澳洲堅果殼，備用。

葡萄糖標準品 天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司；DPPH 上海藍季科技發(fā)展有限公司；抗壞血酸 昆山譜森實驗室用品科技有限公司；其他所用試劑均為分析純 天津市化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外分光光度計 上海譜元儀器有限公司；G80F23CN3P-Q5（QO）型微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；CP224C電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司；HH-S2型電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠；102型電熱鼓風干燥箱 威瑞科教儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

將澳洲堅果殼置于60 ℃烘箱中烘干后，用粉碎機粉碎過60 目，得澳洲堅果殼干粉。將澳洲堅果殼干粉用濾紙包好，置索氏提取中，加入適量石油醚冷浸24 h，然后將其置于水浴中索氏提取，直到充分除去樣品中脂類和脂溶性色素后，取出樣品濾紙包風干至石油醚全部揮發(fā)，再將濾紙包置于60 ℃烘箱中烘干，得去除色素和油脂的澳洲堅果殼干粉，備用。

1.3.2 供試品溶液制備

準確稱取1.00 g去除色素和油脂的澳洲堅果殼干粉，置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，在功率200 W的微波爐中提取2.5 min，減壓抽濾，取上層清液，用Sevag法脫蛋白（氯仿與正丁醇的體積比為4∶1），激烈振蕩10 min，轉入分液漏斗中，靜止至分層去除交界處的變性蛋白質和下層有機相，保留上層水相以4 000 r/min離心5 min，把脫蛋白處理液轉移至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，得供試品溶液。

1.3.3 澳洲堅果殼多糖成分的鑒定

取1 mL供試品溶液3 份，分別加0.5 mL質量分數(shù)5%的苯酚溶液和2 mL濃硫酸溶液，1 mL質量分數(shù)0.5%的α-萘酚溶液和2 mL濃硫酸溶液，1 mL質量分數(shù)2%的蒽酮溶液和2 mL濃硫酸溶液，進行顯色反應，觀察實驗現(xiàn)象，檢識多糖化合物的有無[13]。

1.3.4 多糖含量測定

1.3.4.1 標準曲線制備

[14-15]的方法，略作改動。準確移取質量濃度1.00 mg/mL的葡萄糖標準溶液各0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7 個50 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，備用。再分別精密移取這7 種溶液2.0 mL置于7支25 mL的比色管中，依次精密加入1.0 mL新配制的5%苯酚溶液，搖勻，再緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻后置70 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，用2 mL蒸餾水按同樣的操作作空白對照，用紫外分光光度計于波長490 nm處測定其吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖標準溶液質量濃度（C，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。得回歸方程A=15.424C+0.001 0，相關系數(shù)R=0.999 4。結果表明葡萄糖質量濃度在0.00～0.06 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

1.3.4.2 多糖提取率的測定

準確移取2.0 mL提取液于25 mL的比色管中，依次精密加入1.0 mL新配制的質量分數(shù)5%苯酚溶液，搖勻，再緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻后置70 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，用2 mL蒸餾水按同樣的操作作空白對照，用紫外分光光度計于波長490 nm處測定其吸光度，平行測定3 次，取平均值。多糖提取率按式（1）計算：

式中：C為多糖的質量濃度/（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液的定容體積/mL；M為澳洲堅果殼粉末的質量/g。

1.3.5 提取工藝單因素試驗

在預試驗的基礎上，選水作為提取溶劑，微波法作為提取方法。分別考察以下單因素影響：1）選擇微波功率分別為100、200、300、400、500 W的條件下進行比較，料液比1∶50（g/mL），微波時間2.5 min；2）確定了微波功率300 W提取效果較好后，分別在微波時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min的條件下進行提取，料液比1∶50（g/mL）；3）確定了微波時間3.0 min提取效果較好后，分別在料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL）的條件下進行提取，微波功率300 W，從而確定各因素的影響作用。

1.3.6 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以微波功率、微波時間、料液比為試驗考察因素，以澳洲堅果殼多糖的提取率為評價指標，設計L9（33）正交試驗優(yōu)化提取條件，因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array experiments

1.3.7 澳洲堅果殼多糖抗氧化活性的測定

1.3.7.1 澳洲堅果殼多糖對?OH的清除作用

參考文獻[16-17]的方法，稍作改動。分別配制0.005 5、0.011 0、0.016 5、0.022 0、0.027 5 mg/mL質量濃度的澳洲堅果殼多糖溶液，取1.0 mL于試管中，分別加9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液各2.0 mL，再加8.8 mmol/L的過氧化氫溶液2.0 mL，最后用蒸餾水定容至10 mL，在37 ℃水浴中恒溫反應30 min后，在波長510 nm處測定吸光度，以蒸餾水作空白。同時，以VC作陽性對照，多糖提取液對?OH的清除率按式（2）計算：

式中：A0為空白對照液的吸光度；Ax為加H2O2提取液的吸光度；Ax0為不加H2O2提取液的本底吸光度。

1.3.7.2 澳洲堅果殼多糖對DPPH自由基清除作用

參考文獻[18-19]的方法，稍作改動。向2.5 mL 2×10－4mol/L的DPPH-乙醇溶液中分別加入不同質量濃度（0.005 5、0.011 0、0.016 5、0.022 0、0.027 5 mg/mL）的澳洲堅果殼多糖提取液1.0 mL，混勻，在室溫條件下反應30 min后在波長517 nm處測定吸光度Ai，同時測定2.5 mL 2×10－4mol/L的DPPH-乙醇溶液與1.0 mL乙醇溶液混合液的吸光度Ac，及2.5 mL無水乙醇與不同質量濃度（0.005 5、0.011 0、0.016 5、0.022 0、0.027 5 mg/mL）的澳洲堅果殼多糖提取液1.0 mL，混合液的吸光度Ab。同時，以VC作陽性對照，多糖提取液對DPPH自由基清除率按式（3）計算：

參考文獻[20]的方法，稍作改動。在25 mL比色管中依次加入50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.2）4.5 mL，超純水4.2 mL，混勻，在25 ℃水浴中恒溫20 min后，加入25 ℃水浴中預熱好的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL（以0.3 mL10 mmol/L的HCl溶液代替鄰苯三酚作為空白對照），混勻后在325 nm波長處每隔30 s測1 次吸光度，直到5 min時停止。計算空白液的吸光度隨時間的變化率F0。

依照上述方法，在5 支25 mL比色管中分別加入質量濃度0.005 5、0.011 0、0.016 5、0.022 0、0.027 5 mg/mL的澳洲堅果殼多糖提取液1.0 mL，再依次加入4.5 mL Tris-HCl溶液（pH 8.2），3.2 mL的超純水，混勻，在25 ℃水浴鍋中恒溫20 min后，加入25 ℃水浴中預熱好的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，混勻后在325 nm波長處每隔30 s測1 次吸光度，直到5 min時停止。計算對照液的吸光度隨時間的變化率FX。同時，以VC作陽性對照，多糖提取液對?的清除率按式（4）計算：

2 結果與分析

2.1 澳洲堅果殼多糖類化合物顏色反應檢識

加質量分數(shù)5%的苯酚溶液和硫酸溶液，樣品提取液呈橙黃色環(huán)；加質量分數(shù)0.5%的α-萘酚溶液和濃硫酸溶液，樣品提取液呈紫色環(huán)；加質量分數(shù)2%的蒽酮溶液和濃硫酸溶液，樣品提取液呈藍綠色環(huán)。顯色反應結果表明澳洲堅果殼的提取溶液中含有多糖類化合物。

2.2 澳洲堅果殼多糖提取單因素試驗結果

圖1 微波功率（A）、微波時間（B）和料液比（CC）對多糖提取效果的影響Fig. 1 Effects of microwave power (A), microwave irradiation time (B) and solid/solvent ratio (C) on the extraction yield of polysaccharide

2.2.1 微波功率對澳洲堅果殼多糖提取效果的影響

在料液比1∶50（g/mL）、微波提取時間2.5 min的條件下，考察微波功率對澳洲堅果殼多糖提取效果的影響，結果見圖1A。由圖1A可知，開始隨微波功率的增大，澳洲堅果殼多糖的提取率增大，當微波功率為300 W時，提取率最大，之后隨微波功率的繼續(xù)增大，提取率呈下降趨勢。出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是當微波時間一定時，微波功率升高，物料吸收的微波熱能隨之增加，有效促進植物細胞的破碎，溶出物質增加；當微波功率增加達到一定水平后，會引起多糖降解，多糖提取率反而減小[21]。故選擇微波功率200、300、400 W 3個水平進行正交試驗。

2.2.2 微波時間對澳洲堅果殼多糖提取效果的影響

在料液比1∶50（g/mL）、微波功率300 W的條件下，考察微波時間對澳洲堅果殼多糖提取效果的影響，結果見圖1B。由圖1B可知，開始隨微波時間的延長，多糖提取率逐漸增大，當微波提取時間為3.0 min時，提取率最大，之后再繼續(xù)延長微波時間，提取率呈下降趨勢。出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是較短時間內，微波對植物細胞壁及細胞膜的破壞作用大，導致細胞內物質大量溶出，多糖提取率顯著提高；另一方面，隨著細胞破碎程度越來越大，細胞中其他雜質的溶出也增加，多糖提取率反而下降[22]。故選擇微波提取時間2.5、3.0、3.5 min 3個水平進行正交試驗。

2.2.3 料液比對澳洲堅果殼多糖提取效果的影響

在微波功率300 W、微波時間3.0 min的條件下，考察料液比對澳洲堅果殼多糖提取效果的影響，結果見圖1C。由圖1C可知，開始隨提取液用量的增大，多糖提取率逐漸增大，當料液比在1∶10～1∶40（g/mL）時，提取率上升很快，當料液比在1∶40～1∶50（g/mL）時，多糖提取率增長趨于緩慢。出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是對于一定量的澳洲堅果殼粉末，溶劑用量的增加可以增加固液接觸面積和質量濃度差，有利于擴散速度的提高。當提取液用量繼續(xù)增大，固液質量濃度差的增幅逐漸降低，多糖提取率的增加也趨于平緩，過多使用提取溶液會造成后續(xù)處理的難度和提高成本[23-24]。故選擇料液比為1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）3 個水平進行正交試驗。

2.3 提取工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗結果

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

從表2可知，不同因素對澳洲堅果殼多糖提取效果的影響程度不同，其影響的主次順序為A（微波功率）＞B（微波時間）＞C（料液比）。由表2還可以得出，微波功率為顯著影響因素，極差分析最佳組合為A1B1C3，即最佳提取工藝參數(shù)為微波功率200 W、微波時間2.5 min、料液比1∶50（g/mL）。在該工藝條件下進行驗證性實驗，測得澳洲堅果殼多糖平均提取率為0.70%，相對標準偏差為1.17%，表明該方法重復性良好，適合于澳洲堅果殼多糖的提取。

2.4 澳洲堅果殼多糖抗氧化性分析

圖2 澳洲堅果殼多糖對·OH（A）、DPPH自由基（BB）和OO-2?（CC）的清除作用Fig. 2 Scavenging effects of polysaccharides from Macadamia integrifolia shell on hydroxyl (A), DPPH (B) and superoxide anion (C) radicals

2.4.1 清除·OH的能力評價

·OH是目前已知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，可與細胞中的任何分子發(fā)生反應對機體造成損傷，清除·OH的能力是評價抗氧化物的重要指標[25-26]。從圖2A可以看出，澳洲堅果殼多糖對由H2O2/ Fe2+體系通過Fenton反應產(chǎn)生的·OH具有清除作用，且隨澳洲堅果殼多糖質量濃度的增加，其清除·OH的能力逐步增強，即清除率與多糖的質量濃度間存在一定的量效關系。在0.005 5～0.027 5 mg/mL范圍內，當多糖質量濃度為0.0275 mg/mL時，·OH清除率最大為63.11%；質量濃度為0.005 5 mg/mL時，清除·OH的效果大于VC，表明澳洲堅果殼多糖具有較強的清除·OH的能力。

2.4.2 清除DPPH自由基的能力評價

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，當待測物中含有抗氧化物時，抗氧化物能提供一個孤對電子與其配對結合，使DPPH的特征紫色逐漸變成黃色或消失，根據(jù)褪色程度的大小可間接評價其抗氧化劑的抗氧化性[27]。從圖2B可以看出，隨著澳洲堅果殼多糖質量濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐步增強，即清除率與多糖的質量濃度間存在一定的量效關系。在0.005 5～0.027 5 mg/mL范圍內，當多糖質量濃度為0.027 5 mg/mL時，DPPH自由基清除率最大為61.90%，雖然澳洲堅果殼多糖清除DPPH自由基的效果稍差于VC，但是澳洲堅果殼多糖依然表現(xiàn)出較強的清除DPPH自由基的能力，表明澳洲堅果殼多糖具有較好的抗氧化能力。

2.4.3 清除O2-?的能力評價

O2-?可通過鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化產(chǎn)生，并生成有色中間產(chǎn)物，多糖能夠抑制O2-?的形成，通過檢測有色中間物的生成量，可測定多糖的清除能力。多糖能夠與O2-?結合形成穩(wěn)態(tài)自由基，終止自由基鏈反應，而發(fā)揮抗氧化作用[28-29]。從圖2C可知，澳洲堅果殼多糖對由鄰苯三酚自氧化體系所產(chǎn)生的O2-?有清除率作用，且隨澳洲堅果殼多糖質量濃度的增加，其清除O2-?的能力逐步增強，即清除率與多糖的質量濃度間也存在一定的量效關系。在0.005 5～0.027 5 mg/mL范圍內，當多糖質量濃度為0.027 5 mg/mL時，O2-?清除率最大為80.09%，而且清除O2-?的效果與VC很接近，表明澳洲堅果殼多糖具有很強的清除O2-?的能力。

3 結論與討論

一般來說，單糖羥基多、極性大、易溶于水、難溶于低極性的有機溶劑，多糖則隨著聚合度的增加，性質與單糖的差別越來越大，難溶于冷水，易溶于熱水成膠體溶液。目前提取植物多糖的常用方法有：熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、酶法、超聲提取、微波提取和超臨界CO2等[30]，本實驗采用微波提取，微波法具有選擇性強、省時快速、提取率高等特點。從植物中提取得到的多糖常含有較多的蛋白質，常用除蛋白質的方法有三氯乙酸沉淀法、Sevag法、蛋白酶水解法和鞣酸法等，本實驗采用Sevag法除澳洲堅果殼多糖中的蛋白，Sevag法具有操作簡便、速度快、損失小等特點。

正交試驗結果表明，微波功率、微波時間、料液比對澳洲堅果殼多糖提取率的影響很大，影響程度由大到小依次為微波功率、微波時間、料液比，本實驗優(yōu)化的最佳提取工藝參數(shù)為微波功率200 W、微波時間2.5 min、料液比1∶50（g/mL）。在此工藝條件下進行驗證實驗，測得澳洲堅果殼多糖平均提取率為0.70%。該方法準確度高、重復性好，可用于澳洲堅果殼多糖提取和含量測定。

本研究結果表明，澳洲堅果殼中含有多糖類化合物，澳洲堅果殼多糖具有較強的體外抗氧化活性，相關研究結果對澳洲堅果殼多糖的提取及抗氧化活性成分的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，而其抗氧化活性成分及抗氧化作用機理還有待進一步的研究。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Polysaccharides from Macadamia integrifolia Shell and Evaluation of Their Antioxidant Activities

YANG Shenming, FAN Shuguo, WEN Meiqiong, WANG Zhenji*, XIE Jing
(School of Chemistry and Life Sciences, Chuxiong Normal University, Chuxiong 675000, China)

In this study, the microwave-assisted extraction of polysaccharides from Macadamia integrifolia shell was optimized, and the antioxidant properties of the extracted polysaccharides were determined. Optimization of extraction parameters for improved extraction effi ciency of polysaccharides was done using single factor experiment and an orthogonal array design L9(33). Meanwhile, the antioxidant activities were evaluated by hydroxyl, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and superoxide anion free radical scavenging assays. The optimum extraction parameters were determined as follows: microwave power, 200 W; microwave irradiation time, 2.5 min; and solid-to-solvent ratio, 1:50 (g/mL). Under these conditions, the average extraction yield of polysaccharides was 0.70%. At a polysaccharide concentration of 0.027 5 mg/mL, the percentage scavenging of ·OH, DPPH free radical and O2-· were 63.11%, 61.90% and 80.09%, respectively, implying that these polysaccharides have good ability to scavenge ·OH, DPPH free radical and O2-·.

Macadamia integrifolia shell; microwave-assisted extraction; polysaccharide; antioxidant properties

10.7506/spkx1002-6630-201610004

TQ35

A

1002-6630（2016）10-0017-06

楊申明, 范樹國, 文美瓊, 等. 微波輔助提取澳洲堅果殼多糖的工藝優(yōu)化及抗氧化性評價[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 17-22. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610004. http://www.spkx.net.cn

YANG Shenming, FAN Shuguo, WEN Meiqiong, et al. Optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharides from Macadamia integrifolia shell and evaluation of their antioxidant activities[J]. Food Science, 2016, 37(10): 17-22. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610004. http://www.spkx.net.cn

2015-08-12

國家自然科學基金青年科學基金項目（31300370）；云南省重點建設學科基金項目（05YJJSXK03）；云南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃項目（IRTSTYN）；楚雄師范學院教改項目（1510）

楊申明（1976—），男，實驗師，學士，研究方向為天然有機產(chǎn)物化學。E-mail：ysm@cxtc.edu.cn

*通信作者：王振吉（1983—），男，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：wangzj@cxtc.edu.cn