項聰英 蔡年俊 李靜 羊健 陳劍平,* 張恒木,*

(1浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 金華 321004； 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所， 杭州310021；*通訊聯(lián)系人， E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

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一個水稻小熱休克蛋白基因的克隆和鑒定

項聰英1, 2蔡年俊1, 2李靜2羊健2陳劍平2,*張恒木2,*

(1浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 金華 321004；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所， 杭州310021；*通訊聯(lián)系人， E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

XIANG Congying, CAI Nianjun, LI Jing, et al. Cloning and characterization of a small heat shock protein (SHSP) gene in rice plant. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 587-592.

小分子熱休克蛋白(SHSP)廣泛存在于各類生物體中且在生物發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。我們克隆了一個水稻小熱休克蛋白基因(OsSHSP17.6)，序列分析表明該基因編碼區(qū)為477 bp，可編碼一個含158 個氨基酸的多肽，分子量約17.6 kD。序列分析顯示該類SHSP在不同的植物中是保守的，在分類上隸屬于CI類。實時定量RT-PCR分析顯示熱激處理可顯著增強該基因的轉(zhuǎn)錄；Western blotting分析顯示該蛋白大小與預(yù)期一致，且其含量在熱激處理時大幅度增加。這些結(jié)果一致表明OsSHSP17.6可能參與了水稻熱應(yīng)激反應(yīng)，這為進一步鑒定OsSHSP17.6的功能提供了基礎(chǔ)。

小熱休克蛋白； 熱激處理； 表達模式

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)被認為是一類高度進化、結(jié)構(gòu)保守的分子伴侶蛋白[1-2]，因其在高溫脅迫下被高水平誘導(dǎo)表達而得名。實際上，植物熱休克蛋白基因的表達受很多生物或非生物逆境的影響，除了受熱刺激誘導(dǎo)，還會受低溫、干旱、鹽堿以及重氮化合物、2，4-二硝基苯酚、水楊酸鹽等化學(xué)物質(zhì)的影響[2]，同時還受到病毒、細菌、真菌等多種病原侵染的誘導(dǎo)[3-4]。

熱休克蛋白廣泛存在于各類細胞中，其分子量為10 kD～200 kD，其中小熱休克蛋白(small heat shock protein，SHSP)是一類分子量在15～30kD之間的蛋白[1]。SHSP是植物體內(nèi)最為豐富的一類熱休克蛋白，被認為是植物抗逆過程中的第一條防線[5]，保護細胞免受諸多環(huán)境脅迫，如重金屬、干旱、冷凍、氧化脅迫等。最近也有少數(shù)報道顯示，SHSP參與生物逆境響應(yīng)過程[4,6]。據(jù)統(tǒng)計，哺乳動物中含有4個SHSP，果蠅中有4個SHSP，細菌中有2個SHSP，而擬南芥中有19個[7]，很顯然，相比之下，植物SHSP明顯具有更為復(fù)雜的多樣性。根據(jù)進化樹分析，植物SHSP至少被分為14個亞類(subfamilies)，亞細胞定位預(yù)測顯示，這些SHSP可能定位于不同的細胞器，包括細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物體[8]。SHSP在不同細胞器中定位至少在一定程度上反應(yīng)了植物SHSP的功能差異和功能多樣性，但對于它們的功能特點至今仍然了解很少。本實驗室在研究水稻條紋病毒與水稻基因互作的過程中首次發(fā)現(xiàn)了植物病毒侵染可改變SHSP在細胞內(nèi)的定位和分布模式[4]，進一步分析顯示水稻條紋病毒復(fù)制酶可特異性地與宿主水稻一個SHSP在細胞質(zhì)中相互作用，表明植物SHSP參與了病毒與宿主之間的互作過程。為了進一步探索該基因的功能特性，本研究從日本晴水稻中克隆鑒定了該基因，并進一步通過qRT-PCR和Western blotting技術(shù)分析了其在熱激條件下的表達特點。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為日本晴。大腸桿菌(Eschrichiacoli)菌株DH5α購于北京全式金生物有限公司；pGEM-T Easy載體購自Promega公司；SDS-PAGE低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購自Invitrogen公司；T4DNA連接酶、BamHⅠ和NdeⅠ購自TaKaRa公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒購自康為世紀公司；反轉(zhuǎn)錄所用的第一鏈 cDNA 合成試劑盒購自TOYOBO公司；熒光定量PCR所用的SYBR Green I PCR 試劑盒購自Invitrogen公司；引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 水稻培養(yǎng)及其總RNA、總蛋白質(zhì)提取

日本晴水稻幼苗在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(26±2)℃，16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)3周后在設(shè)定溫度下熱激2 h。熱激處理后，分別采集對照和處理的水稻葉片，用Trizol試劑(Invitrogen)參照商家說明提取水稻葉片總RNA；參照羊健等[9]方法提取植物總蛋白。

1.3 水稻cDNA合成

取1 μg總RNA作模板，以O(shè)ligo(dT)18作為逆轉(zhuǎn)引物，采用第一鏈cDNA 合成試劑盒(TOYOBO)參照商家說明配制好反應(yīng)體系，反應(yīng)總體積20 μL，然后在42℃條件下孵育2 h，合成好的cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 OsSHSP17.6基因擴增和克隆

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中Os03G026700(編碼OsSHSP17.6的序列號)獲得的序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計了一對引物，即pF1(5′-ATG TCG CTG ATC CGC CGC AG-3′)和pR1(5′- CTA GCC GGA GAT CTG GAT G-3′)。取上述cDNA 1 μL作為基因擴增的模板，分別取濃度為20 μmol/L的引物pF1和pR1各0.3 μL，其他按照PCR試劑盒說明配制總體積為25 μL的反應(yīng)體系。先94℃下預(yù)變性3 min；然后94℃下 30 s， 60℃下 30 s，72℃下 1 min的條件下反應(yīng)30個循環(huán)；最后72℃下延伸10 min，即獲得PCR擴增產(chǎn)物。

1.5 基因克隆和測序

擴增產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳分離后，應(yīng)用PCR產(chǎn)物切膠純化試劑盒(Promega公司)切膠回收預(yù)期大小的片段，回收純化的具體步驟參照商家說明。純化的產(chǎn)物連接至pGEM-T-Easy載體(Promega公司)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂于氨芐抗性的LB平板，37℃下培養(yǎng)16 h后，選取若干菌落進行菌落PCR和雙酶切驗證，將含預(yù)期大小插入片段的克隆送至杭州博尚公司進行測序。

1.6 序列分析

測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN Version 6軟件(Lynnon公司)組裝后，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對。采用NCBI中保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Database，CDD，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析。采用MEGA6[10]中Neighbor-Joining算法構(gòu)建進化樹，其中bootstrap值設(shè)置為1000。利用swiss-model 分子建模服務(wù)系統(tǒng)(http://www.swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測[11]，并采用rasmol軟件(http://www.openRasmol.org)對模型結(jié)構(gòu)進行分析。

1.7 實時定量PCR(real time Quantitative PCR，qRT-PCR)

根據(jù)測定的OsSHSP17.6基因序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計了2對引物(pQF，5′-AAG TTC CTC CGC AGG TTC C-3′；pQR，5′-GAG CAC GCC GTT CTC CAT-3′)用于qPCR分析。每個qPCR含有10 μL 2×SYBR PCR master mix(購自TOYOBO公司)、10 μmol/L濃度的引物pQF和pQR各0.8 μL 、 0.5 μL cDNA，然后加ddH2O至20 μL， 反應(yīng)置于Applied Biosystems公司7900定量PCR儀上進行，反應(yīng)條件為95℃下先預(yù)變性3 min，接著95℃下15 s，60℃下20 s，72℃下30 s，循環(huán)40次；然后樣品從60℃加熱至95℃獲得擴增產(chǎn)物的熔解曲線。每個反應(yīng)至少3個重復(fù)，以Actin基因作為內(nèi)參[12]，通過2-ΔΔCT方法計算相對表達量[13]。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用OsSHSP17.6兔抗作為一抗，參照梁國棟[14]的方法進行蛋白質(zhì)印跡分析，用eECL Western Blot Kit顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因克隆及序列分析

為了克隆該水稻基因，設(shè)計了1對引物(pF1：5′-ATG TCG CTG ATC CGC CGC AG-3′和pR1：5′- CTA GCC GGA GAT CTG GAT G-3′)以水稻總cDNA為模板進行了擴增，擴增產(chǎn)物長度約500 bp，與預(yù)期結(jié)果一致；回收純化擴增的預(yù)期片段并將其連接至pGEM-T Easy載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌經(jīng)菌落PCR鑒定后利用通用引物T7、SP6進行雙向測序。測序結(jié)果表明，該基因的編碼區(qū)長度為477 bp，可編碼一個含158 個氨基酸的多肽，分子量約17.6 kD。

登錄號分別為：SiSHSP(XP004984667，谷子)、AtSHSP(EMT09347，粗山羊草)、BdSHSP(XP010228221，二穗短柄草)、ZmSHSP(ACG35098，玉米)、SbSHSP(KXG39718，高粱)。

Accession numbers: SiSHSP (XP004984667,Setariaitalica), AtSHSP (EMT09347,Aegilopstauschii), BdSHSP (XP010228221,Brachypodiumdistachyon), ZmSHSP (ACG35098,Zeamays), SbSHSP (KXG39718，Sorghumbicolor).

圖1 OsSHSP17.6序列同源性(A)及保守結(jié)構(gòu)域(B)分析

Fig. 1. Sequence homology (A) and conserved domain (B) analyses of OsSHSP17.6.

利用BLASTp程序搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，顯示該類蛋白在其他植物中也存在高度同源的類似蛋白，序列比對分析顯示其序列同源性高達84.28%～89.94%(圖1-A)，表示該蛋白在植物中是保守的。二級結(jié)構(gòu)分析顯示該類蛋白至少含有2個α螺旋，10個β折疊；蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析顯示該蛋白近C-端區(qū)域(aa52-143)存在一個保守的個α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(α-crystallin domain，ACD)(圖1-B)，該結(jié)構(gòu)域包含92個氨基酸殘基序列，類似的結(jié)構(gòu)多存在于小熱休克蛋白(small heat shock proteins，SHSP)及其他具有分子伴侶的蛋白中[15]，表明該基因可能編碼一個水稻小熱休克蛋白，暫命名為OsSHSP17.6。

目前擬南芥SHSP研究得較多，分類已經(jīng)明確[8]。為了確定本研究所克隆的熱休克蛋白OsSHSP17.6所屬類型，我們從數(shù)據(jù)庫中下載了擬南芥SHSP序列[8]，采用MEGA6軟件進行進化樹分析(圖2)， OsSHSP17.6恰好與擬南芥CI類SHSP位于一簇，表明本研究克隆的OsSHSP17.6應(yīng)歸屬于CI類SHSP。

2.2 熱激對OsSHSP17.6轉(zhuǎn)錄水平的影響

前面的分析表明OsSHSP17.6是一個熱休克蛋白。為了檢測OsSHSP17.6的表達是否受高溫影響，我們將在(26±2)℃條件下培養(yǎng)3周的水稻苗分為2組，一組為對照組，繼續(xù)在(26±2)℃條件下培養(yǎng)；另一組為處理組，在(45±2)℃條件(其他條件不變)下熱激培養(yǎng)2 h，隨后提取2組水稻總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再利用實時定量PCR技術(shù)分析OsSHSP17.6轉(zhuǎn)錄水平的變化(圖3)。相對于(26±2)℃的條件，(45±2)℃的溫度條件使得OsSHSP17.6基因在轉(zhuǎn)錄水平上增加了約74倍，表明OsSHSP17.6基因具有熱激轉(zhuǎn)錄活性。

圖2 OsSHSP17.6與擬南芥中的小熱休克蛋白進化關(guān)系

Fig. 2. Phylogenetic relationship of OsSHSP17.6 with SHSPs from Arabidopsis thaliana.

圖3 實時定量PCR分析OsSHSP17.6基因轉(zhuǎn)錄水平

Fig. 3. Transcription level of OsSHSP17.6 by real-time quantitative PCR.

2.3 熱激對OsSHSP17.6蛋白質(zhì)翻譯水平的影響

為了確定熱激后OsSHSP17.6在蛋白水平上的變化，我們又提取了上述對照組和熱激處理組的水稻總蛋白，并利用OsSHSP17.6兔抗進行Western blotting分析(圖4)。在熱激處理的水稻中可特異性地在17.6 kD處檢測到一條顯色較強的條帶，且分子量與OsSHSP17.6的預(yù)期大小一致；而對照組中在17.6 kD處則未檢測到相應(yīng)的條帶，表明了該蛋白在翻譯水平也是顯著增加的，也表明熱激有利于OsSHSP17.6的積累，這與該基因轉(zhuǎn)錄水平在熱激處理時增強的結(jié)果一致；另一方面，我們還發(fā)現(xiàn)在約80 kD處也檢測到顯色較強的條帶，而且在對照和熱激處理樣品中均檢測到該條帶，但很顯然熱激處理樣品中該條帶更強，相比之下，對照樣品中該條帶則弱得多，表明該條帶蛋白也是熱誘導(dǎo)蛋白。從該條帶的特異性推測該條帶可能是OsSHSP17.6蛋白的寡聚體，已有報道顯示小熱休克蛋白通常作為分子伴侶蛋白在脅迫響應(yīng)過程中起作用[1,2]，而且小熱休克蛋白在植物體內(nèi)和SDS-PAGE時均可以寡聚體的形式存在[4,16,17]；該條帶蛋白的水平與OsSHSP17.6基因轉(zhuǎn)錄水平在熱激條件下都顯著提高，這種相關(guān)性看上去支持該蛋白是OsSHSP17.6蛋白的寡聚體形式。但由于在17.6 kD處未檢測到相應(yīng)的條帶，尚不能排除該大分子量蛋白條帶是一種與OsSHSP17.6同源蛋白的可能性，因此，該大分子量蛋白尚待進一步鑒定以明確其本質(zhì)。

M-蛋白標(biāo)記; 第1泳道為對照組樣品; 第2泳道為熱激處理樣品。

M, Protein marker; Lane 1, Control sample; Lane 2, Sample treated with heat shock.

圖4 Western blot分析OsSHSP17.6蛋白的表達水平

Fig. 4. Translational level of OsSHSP17.6 by Western blotting.

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Cloning and Characterization of a Small Heat Shock Protein (SHSP) Gene in Rice Plant

XIANG Cong-ying1, 2, CAI Nian-jun1, 2, LI Jing2, YANG Jian2, CHEN Jian-ping2, *, ZHANG Heng-mu2, *

(1College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Key Laboratory of Biotechnology in Plant Protection of MOA and Zhejiang Province, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;*Corresponding author, E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

Small heat shock proteins (SHSPs) exist widely in all kinds of creatures and play an important role in both development and stress responses. A gene encoding a SHSP (OsSHSP17.6) was cloned fromOryzasativaand the sequence assembly showed the encoding region of OsSHSP17.6 was 477 bp in length, encoding a polypeptide of 158 aa with a molecular weight of 17.6 kD. Sequence analysis showed that such kind of SHSPs was conserved in different plants and belonged to the cytosolic class I (CI). The transcriptional level of OsSHSP17.6 was significantly up-regulated by heat shock with qRT-PCR. The protein appeared to be accumulated up to higher level under the condition of heat shock in western blotting assays. Taken together, these findings consistently indicated that OsSHPS17.6 could be involved into the response to heat shock, which could contribute to understanding the function of OsSHSP17.6.

small heat shock protein (SHSP)； heat shock； expression pattern

2016-03-30； 修改稿收到日期: 2016-04-29。

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LQ14-C140003)。

Q785; S511.01

A

1001-7216(2016)06-0587-06

項聰英, 蔡年俊, 李靜, 等. 一個水稻小熱休克蛋白基因的克隆和鑒定. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(6)： 587-592.