李信申,肖運(yùn)萍,魏林根,黃瑞榮,華菊玲*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,江西 南昌 330200;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 資源與環(huán)境研究所,江西 南昌 330200)

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芝麻青枯雷爾氏菌生化特性及致病力分化的研究

李信申1,肖運(yùn)萍2,魏林根2,黃瑞榮1,華菊玲1*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,江西 南昌 330200;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 資源與環(huán)境研究所,江西 南昌 330200)

將采自江西12個(gè)縣(市)的芝麻青枯雷爾氏菌29株菌株分別人工接種到寄主植物番茄、茄子、馬鈴薯和煙草上，鑒定結(jié)果表明：全部菌株屬于生理小種1；25株菌株屬生化變種Ⅲ,3株屬生化變種Ⅳ,1株為生化變種Ⅲ-1亞種。對(duì)致病力測(cè)定結(jié)果的聚類分析表明：來(lái)自進(jìn)賢、都昌、南昌、樟樹(shù)4個(gè)紅壤旱地傳統(tǒng)種植區(qū)的菌株致病力最強(qiáng);來(lái)自鄱陽(yáng)砂壤及潮洲地傳統(tǒng)種植區(qū)的菌株致病力中等；來(lái)自其它6個(gè)區(qū)域的菌株致病力最弱。因此，江西芝麻青枯雷爾氏菌的致病力存在明顯的分化現(xiàn)象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生態(tài)是影響青枯雷爾氏菌致病力分化的重要因子。

芝麻;青枯雷爾氏菌;生理小種;生化變種;致病力分化

芝麻青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種土傳病害,系我國(guó)南方芝麻生產(chǎn)的重要限制因子[1]?，F(xiàn)有的全基因組測(cè)序研究結(jié)果表明,青枯雷爾氏菌的基因組由染色體(chromosome)和大質(zhì)粒(megaplasmid)2個(gè)閉合環(huán)狀復(fù)制子構(gòu)成[2-3]。大質(zhì)粒上除包含一些重要持家基因副本外,還攜帶了為數(shù)眾多的菌株特有基因(strain-specific gene)和有助于提高病菌致病及適應(yīng)能力的基因簇或遺傳島,如III型和VI型分泌系統(tǒng)、胞外多糖合成、鞭毛合成的基因簇等[2，4]。在分子進(jìn)化過(guò)程中,青枯雷爾氏菌的染色體相對(duì)保守,而大質(zhì)粒則更為活躍,其可變基因(variable gene)所占的比例高達(dá)63%[5]。青枯雷爾氏菌的這一遺傳特性,使得其致病力及生化特性呈現(xiàn)豐富的多樣性。研究青枯雷爾氏菌的生化特性和致病力分化可為作物抗病品種選育和病害的流行預(yù)測(cè)奠定基礎(chǔ)。潘哲超等[6]、鄧正平等[7]、何云昆等[8]、謝世勇等[9]、徐麗慧等[10]、呂志強(qiáng)等[11]、何自福等[12]先后研究了煙草、花生、桑及茄科作物青枯雷爾氏菌的生化特性和致病力分化,但目前尚未見(jiàn)芝麻青枯雷爾氏菌生化特性及致病力分化的研究報(bào)道。為此,筆者對(duì)江西芝麻青枯雷爾氏菌的生理小種、生化變種以及致病力分化進(jìn)行了系統(tǒng)研究,以期為芝麻抗病資源篩選、抗病育種及病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試青枯雷爾氏菌菌株30株,其中來(lái)自江西省進(jìn)賢、豐城、都昌、樟樹(shù)、鄱陽(yáng)五個(gè)芝麻主產(chǎn)縣(市)的芝麻青枯病菌株有15株,來(lái)自其它7個(gè)縣(區(qū))的芝麻青枯病菌株有14株(表1)。R.solanacearum的標(biāo)準(zhǔn)菌株GMI 1000(生理小種1，分離自番茄)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所提供。

1.2 生理小種的鑒定

鑒別寄主植物為番茄(早豐)、茄子(長(zhǎng)虹茄子)、馬鈴薯(市售)和煙草(本生煙)。將供試菌株配成1×108CFU/mL的菌懸液；對(duì)番茄、茄子和馬鈴薯進(jìn)行針刺接種，病情嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照任欣正等[13]。煙草過(guò)敏反應(yīng)試驗(yàn)參照方中達(dá)[14]的方法進(jìn)行。生理小種鑒定參照Hayward[15]和He[16]的劃分標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 生化變種的鑒定

生化變種測(cè)定方法參考French等[17]。

1.4 致病力測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

供試芝麻品種為感病品種“中芝13”。在芝麻初花期進(jìn)行針刺接種,每個(gè)處理接種10株苗。從接種后第7天開(kāi)始,參照江西省地方標(biāo)準(zhǔn)DB36/T 879─2015分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情調(diào)查,每隔10 d調(diào)查1次；在芝麻盛花后期各處理的病情基本穩(wěn)定時(shí),統(tǒng)計(jì)各處理的病情指數(shù)。采用卡方距離法計(jì)算各處理間的相似系數(shù),用離差平方和法進(jìn)行聚類分析[18 ]。

表1 供試芝麻青枯雷爾氏菌的來(lái)源

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生理小種

針刺接種鑒定結(jié)果(表2)顯示,29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株與對(duì)照菌株GMI 1000均能侵染番茄、茄子和馬鈴薯這3種寄主植物。注射接種結(jié)果表明,上述分離菌株與對(duì)照菌株均可在煙葉上產(chǎn)生典型的深褐色壞死斑。根據(jù)Hayward和He的生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn),這些菌株均屬于生理小種1。

2.2 菌株的生化變種

29株供試菌株對(duì)三糖(乳糖、麥芽糖、纖維二糖)和三醇(甜醇、甘露醇、山梨醇)的碳源利用測(cè)定結(jié)果(表3)表明：Jsjx02、JSjx23、JSzs01等25株菌株對(duì)供試的6種碳源均呈陽(yáng)性反應(yīng),屬生化變種Ⅲ,占86.21%;JSjx11、JSzs19、JSnc05這3株菌株對(duì)3種糖呈陰性反應(yīng),屬生化變種Ⅳ,占10.34%;菌株JSfy01僅對(duì)山梨醇呈陰性反應(yīng),定為生化變種Ⅲ-1亞種,占3.45%。

2.3 菌株的致病力分化

針刺接種試驗(yàn)結(jié)果表明,供試的29株青枯雷爾氏菌菌株均對(duì)芝麻具有致病力,但致病力強(qiáng)弱存在明顯差異(表4)。聚類分析結(jié)果(圖1)顯示,上述29株菌株可聚類為3個(gè)組,第Ⅰ組共有13株菌株,來(lái)自進(jìn)賢、南昌、豐城、樟樹(shù)、都昌的菌株均聚在該組中。該組還可再分為2個(gè)亞組,A亞組7株菌株的致病力最強(qiáng),其中來(lái)自進(jìn)賢3株，豐城2株，樟樹(shù)和南昌各1株;B亞組6株菌株的致病力次強(qiáng),其中來(lái)自樟樹(shù)和都昌各2株，豐城和南昌各1株。第Ⅱ組共有16株菌株。該組可再分為3個(gè)亞組,C亞組4株菌株的致病力中等,來(lái)自鄱陽(yáng)3株,都昌1株;D亞組和E亞組分別有8株和4株菌株,這兩個(gè)亞組的菌株的致病力均較弱,來(lái)自余干、分宜、九江等6個(gè)縣(區(qū))的菌株均聚類在這兩個(gè)亞組中。

表2 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株生理小種鑒定結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)為病情嚴(yán)重度級(jí)別;“+”表示煙草過(guò)敏反應(yīng)產(chǎn)生褐色壞死斑。

表3 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株生化變種鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng);“-”表示陰性反應(yīng)。

表4 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株致病力測(cè)定結(jié)果

3 討論

不同地理起源的青枯雷爾氏菌在與其寄主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中,演化出明顯的生理分化和遺傳多樣性。根據(jù)其致病范圍,可分為5個(gè)生理小種(race 1～5)。其中,寄主范圍廣泛的生理小種1是我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌系[19 ]。本研究對(duì)來(lái)自江西12個(gè)縣(市)不同土壤類型、不同栽培季節(jié)及不同芝麻品種上的29株代表性菌株的生理小種鑒定結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。29株菌株的生化變種鑒定結(jié)果顯示,生化變種Ⅲ菌群是誘發(fā)江西芝麻青枯病流行的優(yōu)勢(shì)種群,也是芝麻青枯病流行結(jié)構(gòu)的主要組成部分。現(xiàn)有研究揭示,青枯雷爾氏菌生理小種1、生化變種Ⅲ可侵染茄子、花生、馬鈴薯、番茄、煙草等多種作物,因此,選擇與非寄主作物進(jìn)行合理輪作對(duì)芝麻及其它寄主作物青枯病的有效防控極為關(guān)鍵。

圖1 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株 致病力測(cè)定結(jié)果的聚類分析

本研究測(cè)定了不同縣(市)青枯雷爾氏菌對(duì)芝麻的致病力,結(jié)果表明,來(lái)自進(jìn)賢、南昌、豐城、樟樹(shù)四個(gè)縣(市)的所有菌株以及來(lái)自都昌的2株菌株的致病力明顯強(qiáng)于來(lái)自芝麻主產(chǎn)區(qū)之一的鄱陽(yáng)及其它區(qū)域菌株的。影響青枯雷爾氏菌致病力分化的外在因子主要有寄主植物種類、品種抗性水平、土壤生態(tài)及耕作栽培制度(尤其是前茬作物) 等。進(jìn)賢、豐城、都昌均屬芝麻主產(chǎn)區(qū),南昌縣菌株采集地亦為芝麻傳統(tǒng)種植區(qū),這些區(qū)域多為排水不良的紅壤旱地,且生產(chǎn)上芝麻大多與花生、番茄、茄子、馬鈴薯等青枯雷爾氏菌寄主作物輪作,這些因素必然對(duì)青枯雷爾氏菌的致病力分化產(chǎn)生定向誘導(dǎo)作用,導(dǎo)致強(qiáng)致病力菌株成為優(yōu)勢(shì)種群,從而致使這些區(qū)域芝麻青枯病連年嚴(yán)重發(fā)生。鄱陽(yáng)雖亦屬傳統(tǒng)芝麻產(chǎn)區(qū),但該區(qū)域大多為排水良好的砂壤地及潮洲地,且該區(qū)域?yàn)閭鹘y(tǒng)棉花產(chǎn)區(qū),所以其菌株的致病力受到寄主植物及土壤生態(tài)的影響較小,因而菌株的致病力相對(duì)較低。在余干、分宜、九江等6個(gè)縣(區(qū)),由于青枯雷爾氏菌菌株的致病力受到寄主植物及栽培制度的影響小,因而它們的致病力最弱。因此,從本研究結(jié)果可以得出:青枯雷爾氏菌與其寄主植物在長(zhǎng)期互作中,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生態(tài)是影響青枯雷爾氏菌致病力分化的主要外在因子。

青枯雷爾氏菌的致病力分化不僅與植物種類、品種抗性水平、土壤生態(tài)及耕作栽培制度等外在因素有關(guān),更與其內(nèi)在的致病基因、調(diào)控因子,以及與寄主抗病基因的互作密切相關(guān)。先后完成的9個(gè)青枯雷爾氏菌基因組全序列分析結(jié)果也表明,青枯雷爾氏菌在寄主植物的致病過(guò)程中,通過(guò)啟動(dòng)復(fù)雜的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò),協(xié)調(diào)各類分泌系統(tǒng)適時(shí)組裝以及各種毒性因子時(shí)序性表達(dá)和泌出,從而順利完成侵染循環(huán)[20 ]。參與青枯病致病過(guò)程的分泌系統(tǒng)包括:Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型及雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)分泌系統(tǒng);致病因子主要包括脂多糖、胞外多糖、胞外蛋白以及Ⅲ型效應(yīng)子等[21 ]。尤其是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)及其效應(yīng)子(effector)是完成致病過(guò)程和參與寄主互作反應(yīng)最為重要的決定因子[22 ]。因此,關(guān)于芝麻青枯雷爾氏菌的遺傳譜型與致病力分化之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Study on Biochemical Characteristics and Pathogenicity Differentiation ofRalstoniasolanacearumfrom Sesame

LI Xin-shen1, XIAO Yun-ping2, WEI Lin-gen2, HUANG Rui-rong1, HUA Ju-ling1*

(1. Plant Protection Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, 330200, China; 2. Soil and Fertilizer & Resource and Environment Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

A total of 29 strains ofRalstoniasolanacearumisolated from sesame in 12 counties (cities) of Jiangxi Province were artificially inoculated into the host plants tomato, eggplant, potato and tobacco, respectively, and the classification results indicated that: all strains belonged to the physiological race 1; among them, 25 strains, 3 strains and 1 strain belonged to biovar Ⅲ, biovar Ⅳ and biovar Ⅲ-1, respectively. The clustering analysis of pathogenicity test results showed that: the strains isolated from sesame planted in red-soil dryland of Jinxian, Duchang, Nanchang and Zhangshu possessed the strongest pathogenicity; the strains from sesame planted in sandy loam soil and tidal sandy soil of Poyang possessed a middle pathogenicity; while those from other 6 regions had the weakest pathogenicity. Therefore, the pathogenicity differentiation ofRalstoniasolanacearumfrom sesame in Jiangxi was obvious, and it was affected mainly by host plant, cropping system and soil ecology.

Sesame;Ralstoniasolanacearum; Physiological race; Biovar; Differentiation of pathogenicity

2016-10-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360428);農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303015);江西省支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20121BBF60015)。

李信申(1980─),男,安徽蚌埠人,博士,從事植物病理學(xué)研究。*通訊作者:華菊玲。

S435.653

A

1001-8581(2016)12-0061-05