楊玲，鞏俊霞，李嫻 張龍崗，付佩勝，張金路

山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實驗室，農(nóng)業(yè)部黃河下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，山東省淡水漁業(yè)研究院，山東濟(jì)南250017

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泰山螭霖魚線粒體16S rRNA基因片段序列及分子系統(tǒng)發(fā)育分析

楊玲，鞏俊霞，李嫻 張龍崗，付佩勝，張金路

山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實驗室，農(nóng)業(yè)部黃河下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，山東省淡水漁業(yè)研究院，山東濟(jì)南250017

以泰山螭霖魚(Varicorhinusmacrolepis)30個個體為材料，對其線粒體16S rRNA基因片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列對比，檢測了泰山螭霖魚的遺傳多樣性；結(jié)合從GenBank中下載的同源性較高的鯉科7屬部分魚類的同源序列，利用MGEA軟件計算遺傳距離，采用聚類分析方法，構(gòu)建了NJ和UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：30個體泰山螭霖魚線粒體16S rRNA基因片段長度為468bp，無堿基的插入和缺失，共檢測到1個多態(tài)位點(diǎn)，存在2種單倍型，其單倍型多樣性(Hd)為0.067，核苷酸多樣性(Pi)為0.00015，平均核苷酸差異數(shù)(K)0.067。遺傳距離和NJ、UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，泰山螭霖魚與多鱗白甲魚的16SrRNA序列一致，泰山螭霖魚所在的突吻魚屬與光唇魚屬的親緣關(guān)系最近，與扁吻魚屬遺傳距離最遠(yuǎn)。

泰山螭霖魚(Varicorhinusmacrolepis)；16S rRNA；遺傳多樣性

泰山螭霖魚(Varicorhinusmacrolepis)屬鯉科鲃亞科突吻魚屬，是生活在泰山海拔270～800m山澗溪流中的小型野生魚類，其肉嫩味美、營養(yǎng)豐富，有獨(dú)特的藥用保健價值[1]，是泰山特有的珍貴魚類，為我國“五大貢魚”之一[2]。自20世紀(jì)90年代起，魚類學(xué)者們對生態(tài)習(xí)性和生物學(xué)特點(diǎn)[2]、人工馴化和繁殖[3]、解剖學(xué)[4]、生長性能[5]、同工酶[6]、染色體核型[7]進(jìn)行了研究。近年來，利用分子標(biāo)記技術(shù)對泰山螭霖魚的遺傳多樣性[8，9]和部分功能基因進(jìn)行了研究[10～12]，陳紅菊[11]對其線粒體cyt b和D-loop進(jìn)行過研究，但有關(guān)泰山螭霖魚線粒體16S rRNA基因的研究尚未見報道。為此，本研究通過對泰山螭霖魚的16S rRNA基因部分序列的分析，探討其與鯉科7個屬魚類的進(jìn)化關(guān)系，確定泰山螭霖魚的分類地位，以期為其種質(zhì)資源的管理與保護(hù)及遺傳育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用泰山螭霖魚取自泰安市泰山螭霖魚原種場，樣本數(shù)量為30個； PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；DNA提取試劑盒購自上海生工；Taq DNA聚合酶、dNTP 、MgCl2、Marker等為大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)；PCR儀為Takara TP650型。

1.2 方法1.2.1 基因組DNA的提取

取泰山螭霖魚背部肌肌肉約20mg，用DNA提取試劑盒(上海生工)提取樣品的基因組DNA，經(jīng)D260/D280比值和瓊脂糖凝膠電泳來檢測所提取DNA的濃度和純度后，置-20℃冰箱備用。

1.2.2 引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank(NC_NC_023799.1)中的相應(yīng)序列設(shè)計引物，用于16S rRNA基因序列的擴(kuò)增，引物序列16S-F：5’-GAAAATCACCTAACCTCCC-3’,16S-R：5’-GTTGAACAAACGAACCCTT-3’。

PCR擴(kuò)增體系50μL，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；之后進(jìn)行35個循環(huán)(94℃ 40s,55℃ 50s，72℃ 50s)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳(0.5×TBE 5V/cm恒壓)檢測，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，送上海生工生物技術(shù)有限公司，純化后采用上述引物進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 序列分析

測序結(jié)果經(jīng)校對，與從GenBank中下載的同源性比較高的鯉科7屬部分魚類的同源序列用Clustal W方法進(jìn)行比對分析，用MEGA6.06軟件統(tǒng)計序列的堿基組成和變異位點(diǎn)，采用Kimura 2-parameter模型計算遺傳距離，分別用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并采用bootstrap 1000次重復(fù)檢驗分子系統(tǒng)樹各分枝置信度；用DNASP V5.10軟件計算單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(K)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用引物16S-F和16S-R對30尾泰山螭霖魚的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果都擴(kuò)增出1條約500bp的條帶(圖1)。

1～24:泰山螭霖魚個體，M：DL-2000 Marker圖1 泰山螭霖魚16S rRNA基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 16S rRNA基因片段的序列分析2.2.1 序列分析

泰山螭霖魚30個樣本線粒體16S rRNA基因的測序結(jié)果經(jīng)校對，去除部分端序列后，獲得468bp的片段。采用MEGA6.06軟件經(jīng)BLAST分析，該片段與GenBank中多鱗白甲魚(Onychostomamacrolepis)的16S rRNA基因片段同源性高達(dá)100%，確定該產(chǎn)物為泰山螭霖魚16S rRNA基因的部分序列。

用MGEA 6.06 軟件對測得序列進(jìn)行比對分析，在測定的468bp的片段中，無堿基的插入與缺失，其中保守位點(diǎn)467個，變異位點(diǎn)1個，占整個序列的0.2%，變異位點(diǎn)為轉(zhuǎn)換(C←→G)，發(fā)生在第3位密碼子上，所編碼的氨基酸沒有發(fā)生變化。

用DNASP 5.10 軟件分析30個樣本16S rRNA序列，共檢測到2種單倍型，絕大多數(shù)個體為單倍型Hap-1，單倍型Hap-2出現(xiàn)的頻率很低，只有1個樣本。

2.2.2 堿基組成和遺傳距離

泰山螭霖魚堿基含量平均為：T 22.6%、C 23.1%、A 32.7%、G 21.6%，G+C含量(44.7%)低于A+T含量(55.3%)(表1)。基于Kimura-2-parameter計算遺傳距離,30個個體的相對遺傳距離為0～0.22%。

表1 樣品種類、GenBank序列號、堿基組成

采用MGEA 6.06軟件比較泰山螭霖魚和GenBank中查到的同源性較高的鯉科白甲魚屬(Onychostoma)、光唇魚屬(Acrossocheilus)、鯪屬(Cirrhinus)、華鯪屬(Sinilabeo)、野鯪屬(Labeo)、裂腹魚屬(Schizothorax)、扁吻魚屬(Aspiorhynchus)7屬9種魚的同源序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果見圖2。得到471個比對位點(diǎn)，有45個變異位點(diǎn)，包括4個插入/缺失位點(diǎn)、29個簡約信息位點(diǎn)和14個單突變子。泰山螭霖魚單倍型Hap1與多鱗白甲魚序列完全一致；與扁吻魚序列間的變異位點(diǎn)最多，有23個。

圖2 泰山螭霖魚及鯉科9種魚類線粒體16S rRNA序列直接的變異位點(diǎn)

泰山螭霖魚16S rRNA基因片段2種單倍型與GenBank中鯉科7屬部分魚類的遺傳距離見表2?？梢钥闯觯┥襟ち佤~2個單倍型間的遺傳距離為0.21%，泰山螭霖魚單倍型(Hap-1)與白甲魚屬幾種魚的的遺傳距離在0～3.07%，其中與多鱗白甲魚的遺傳距離為0。泰山螭霖魚與白甲魚屬幾種魚類遺傳距離最近，其次是光唇魚屬，再次是裂腹魚屬，與野鯪屬、華鯪屬、鯪屬魚類遺傳距離較遠(yuǎn)，與扁吻魚屬遺傳距離最遠(yuǎn)。

表2 泰山螭霖魚2種單倍型與鯉科9種魚類的遺傳距離 %

2.2.3 遺傳多樣性分析

利用DNASP 5.10軟件分析30個樣品泰山螭霖魚16S rRNA基因的遺傳多樣性，結(jié)果表明，其單倍型數(shù)(h)為2，單倍型多樣性(Hd)為0.067，核苷酸多樣性(Pi)為0.00015，平均核苷酸差異數(shù)(K)為0.067，遺傳多樣性水平非常低。

2.2.4 聚類及系統(tǒng)發(fā)育分析

將泰山螭霖魚16S rRNA基因2個單倍型序列與同源性較高的鯉科7屬部分魚類同源序列一起進(jìn)行聚類分析，采用雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter)作為距離參數(shù)，分別以鄰接法(neighber-joining，NJ)和UPGMA法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，自舉檢測(bootstrap)1000次計算各分枝置信度(圖3、圖4)。由2種聚類圖均可看出，7個屬的魚類可以聚為2個大的分支，泰山螭霖魚與白甲魚屬及光唇魚屬聚為一大類，另外5屬魚類聚為一大類。泰山螭霖魚的2個單倍型先與多鱗白甲魚聚在一起，再與粗須白甲魚、小口白甲魚聚在一起，然后與光唇魚屬聚為一類，泰山螭霖魚絕大多數(shù)個體為單倍型Hap-1，與多鱗白甲魚關(guān)系最近，與光唇魚屬親緣關(guān)系次之，與其他5屬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

O.macrolepis：多鱗白甲魚；O.barbatum：粗須白甲魚；O.lini：小口白甲魚；Ac.barbodon：光唇魚；Ac.Paradoxus臺灣石賓魚；O.rara：稀有白甲魚；Sc.Prenanti：齊口裂腹魚；Sc.yunnanensis：云南裂腹魚；As.laticeps：新疆扁吻魚；Si.dero：墨脫華鯪；Labeoboggut:野鯪；Labeobata:巴塔野鯪；Banganatungting：洞庭華鯪；Cirrhinusmrigala：印度鯪。圖3同。圖3 基于16SrRNA序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹

圖4 基于16S rRNA序列構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)樹

3 討論

動物線粒體DNA(mitochondrial DNA，mt DNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、變異性大、母系遺傳及易于擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，在動物種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、物種及品系鑒定方面得到廣泛應(yīng)用，線粒體16S rRNA基因進(jìn)化速率低，比較保守，適合于種以上水平的分子系統(tǒng)學(xué)研究及遺傳分析研究[13]。在魚類進(jìn)化研究中，16S rRNA基因已得到廣泛應(yīng)用，如王茜等[13]、童馨等[14]、孫悅娜等[15]、邵愛華等[16]、任崗等[17]、陳子安等[18]分別對尖塘鱧、黃姑魚、日本沼蝦、暗紋東方鲀、石鱸科魚類、星蟲等線粒體16S rRNA基因序列和分子系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了研究。但是對于泰山螭霖魚16S rRNA的研究較少，目前尚未見報道，本研究通過分析泰山螭霖魚16S rRNA基因序列的差異及其與同亞科其他屬魚類同源序列進(jìn)行比對，在分子水平上探討泰山螭霖魚與鲃亞科及鯉科部分魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以確定其分類地位。

3.1 遺傳多樣性

泰山螭霖魚30個樣本擴(kuò)增的16S rRNA基因468bp片段中，有1個突變位點(diǎn)，存在2種單倍型，核苷酸多樣性(Pi)為0.00015，平均核苷酸差異數(shù)(K)0.0067，其單倍型多樣性(Hd)為0.067，表明泰山螭霖魚群體具有較低的遺傳多樣性水平。這與公維華等[8]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對泰山螭霖魚的遺傳多樣性的研究結(jié)果相似，即泰山螭霖魚野生群體和養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)無差異，是一個非常純合的群體。這是泰山螭霖魚特殊的生存環(huán)境和生活習(xí)性所決定的，它生存在泰山，分布在海拔270～800m的山澗中，缺乏與外界水域的交流，經(jīng)長期的近交繁殖和瓶頸效應(yīng)，多數(shù)基因已純合，加之環(huán)境的選擇壓力對其影響也不大，形成基因突變和重組的概率很小，所以會呈現(xiàn)出遺傳多樣性水平低的現(xiàn)象。

3.2 分類地位及分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

泰山螭霖魚的學(xué)名為Varicorhinusmacrolepis，屬突吻魚屬，有學(xué)者認(rèn)為突吻魚屬和白甲魚屬是同物異名；也有學(xué)者認(rèn)為突吻魚屬(Varicorhinus)分2個亞屬，即白甲魚亞屬(Onychostoma)和鏟頜魚亞屬(Scaphesthes)[19]。陳紅菊[11]通過對泰山螭霖魚線粒體Cyt b 和D-loop序列分析，發(fā)現(xiàn)泰山螭霖魚和多鱗鏟頜魚聚在一起，二者之間無任何分別，確定泰山螭霖魚就是多鱗鏟頜魚。本研究通過對泰山螭霖魚同源性較高的鯉科7屬部分魚類基于線粒體16S rRNA基因片段的聚類和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，泰山螭霖魚2個單倍型中，絕大多數(shù)個體為單倍型為Hap1，與多鱗白甲魚(O.macrolepis)的16S rRNA基因片段序列完全一致，泰山螭霖魚Hap1首先與多鱗白甲魚聚在一起，再與粗須白甲魚、小口白甲魚聚為一類。泰山螭霖魚系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與陳紅菊的研究結(jié)果相似，即泰山螭霖魚所在的突吻魚屬與光唇魚屬的親緣關(guān)系最近，與其他屬魚類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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2016-07-19

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系魚類創(chuàng)新團(tuán)隊項目(SDAIT-12-04)。

楊玲(1967-)，女，研究員，主要從事魚類遺傳育種研究。通信作者：張金路,18953160608@163.com。

S917; Q731

A

1673-1409(2016)33-0037-06

[引著格式]楊玲，鞏俊霞，李嫻，等.泰山螭霖魚線粒體16S rRNA基因片段序列及分子系統(tǒng)發(fā)育分析[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版),2016，13(33)：37～42.