李薪芳，索亞萍，樓鴛鴦，徐超,*，劉維屏

1.浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，杭州310014

2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，杭州310058

酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)影響及氧化損傷效應(yīng)

李薪芳1，索亞萍1，樓鴛鴦1，徐超1,*，劉維屏2

1.浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，杭州310014

2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，杭州310058

酰胺類除草劑的廣泛使用對(duì)水生生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了潛在風(fēng)險(xiǎn)。為探究其對(duì)藻類的毒性作用,以銅綠微囊藻為對(duì)象,分別從藻類生長(zhǎng)和氧化損傷效應(yīng)角度探討了甲草胺、乙草胺和丁草胺對(duì)銅綠微囊藻的毒性影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,酰胺類除草劑對(duì)藻類的影響存在明顯的滯后效應(yīng)和劑量–效應(yīng)關(guān)系,低濃度暴露組刺激藻類增長(zhǎng),高濃度表現(xiàn)為抑制作用；3種酰胺類除草劑增加了銅綠微囊藻的氧化壓力,并隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加而增強(qiáng)。其中,藻體內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量明顯增加,同時(shí)超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性也顯著增強(qiáng)。經(jīng)96 h暴露后,甲草胺(32.0mg·L-1)、乙草胺(32.0mg·L-1)和丁草胺(15.0mg·L-1)暴露溶液中相對(duì)MDA含量分別為138%、204%和154%,相對(duì)SOD活性分別為116%、87%和115%,相對(duì)POD活性分別475%、278%和627%。結(jié)合生物量及氧化損傷效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,3種除草劑對(duì)銅綠微囊藻的毒性大小順序?yàn)槎〔莅罚疽也莅罚炯撞莅贰?/p>

酰胺類除草劑；銅綠微囊藻；氧化損傷效應(yīng)；生長(zhǎng)抑制

酰胺類除草劑是一種高效、高選擇性的觸殺性除草劑。最早開(kāi)發(fā)出的酰胺類除草劑是二丙烯草胺(allidochlor)和敵稗(propanil)。隨后一系列氯乙酰胺類除草劑如毒草胺(propachlor)、丁草胺(butachlor)、甲草胺(alachlor)、乙草胺(acetochlor)、異丙甲草胺(metolachlor)等相繼問(wèn)世[1]。目前,酰胺類除草劑仍是世界范圍內(nèi)使用最為廣泛的除草劑之一,對(duì)多類動(dòng)物、植物和微生物具有毒性,其中一些被證實(shí)具有內(nèi)分泌干擾活性和“三致”效應(yīng)[2-3],在土壤和水體中均可檢測(cè)到不同程度的含量[4],如李體文等[5]在某耕作區(qū)附近土壤中檢測(cè)出乙草胺平均濃度為38.2～45.3μg·L-1。近年來(lái)關(guān)于酰胺類除草劑的水生毒性較多地關(guān)注于魚(yú)類及水生植物[6-7],但對(duì)于藻類的毒性研究較少。

藻類是一種單細(xì)胞生物,具有生長(zhǎng)周期短,對(duì)毒物敏感、易獲得、個(gè)體小、繁殖快等特點(diǎn),因而可作為水生生態(tài)毒理研究的模式生物[8]。許多國(guó)家在化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)測(cè)試中選用藻類進(jìn)行生物測(cè)試,并建立了多個(gè)藻類生物測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)方法[9]。銅綠微囊藻屬藍(lán)藻系,是一種原核單細(xì)胞生物,普遍存在于天然水體中,生命周期短,易于培養(yǎng),可在較短時(shí)間內(nèi)提供有意義的毒性指標(biāo),是生物實(shí)驗(yàn)中一種普遍使用的模式生物。

當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí),如外源性物質(zhì)等會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)發(fā)生氧脅迫反應(yīng),產(chǎn)生過(guò)量的活性氧,對(duì)植物造成不同程度的危害?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)是一種高度活性的非特異分子,具有抗菌作用,其作為有氧代謝的副產(chǎn)物,大量產(chǎn)生于植物的線粒體、葉綠體和原生質(zhì)膜等,如超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫H2O2等[10]。正常情況下,植物細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)。在外來(lái)脅迫下,植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和代謝將失去平衡,引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),從而形成脂質(zhì)過(guò)氧化物,如醛基(丙二醛MDA)。脂質(zhì)過(guò)氧化作用不僅可將ROS轉(zhuǎn)化為活性化學(xué)物質(zhì),即非自由基性的脂類分解產(chǎn)物,而且具有通過(guò)鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)放大活性氧作用[11]。此類脂類分解產(chǎn)物可能引起細(xì)胞代謝及功能障礙,甚至導(dǎo)致植物死亡。

為減輕氧化脅迫造成的傷害,植物體內(nèi)衍生出一套抗氧化防御系統(tǒng)(包括酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)),使ROS含量處于平衡狀態(tài)[12-13]。在酶促抗氧化系統(tǒng)中,超氧化物歧化酶(SOD)作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,將細(xì)胞中多余的歧化為H2O2,過(guò)氧化物酶(POD)接著清除H2O2[14]。SOD及POD活性的增強(qiáng)保證了藻細(xì)胞體內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除的平衡。

本研究以銅綠微囊藻作為受試生物,圍繞酰胺類除草劑對(duì)藻的水生毒理,首先通過(guò)在酰胺類除草劑作用下檢測(cè)銅綠微囊藻生長(zhǎng)量變化,再檢測(cè)藻體內(nèi)MDA、SOD和POD活性的變化判斷除草劑對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響,從而進(jìn)一步推斷酰胺類除草劑在誘導(dǎo)銅綠微囊藻細(xì)胞凋亡過(guò)程中所起的作用機(jī)理。為評(píng)價(jià)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)、環(huán)境保護(hù)以及合理使用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試藥劑

甲草胺(95%)、乙草胺(90%)、丁草胺(93%)均購(gòu)自浙江大有化工有限公司。

1.2 儀器與試劑

儀器:多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司),Multifuge 1S-R型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

試劑:丙酮(色譜純,Tedia,美國(guó))?？捡R斯亮藍(lán)試劑盒,超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒,丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒,過(guò)氧化物酶(POD)測(cè)定試劑盒(所有試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。其它試劑均為分析試劑。

磷酸鹽緩沖溶液(PBS,50 mmol·L-1):2.96 g NaH2PO4·H2O,4.40 g Na2HPO4；加雙蒸水溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)至pH 7.0,定容至1 L,4℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa) FACHB 905購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生所。藻細(xì)胞采用BG11(pH 8.0)培養(yǎng)基培養(yǎng)[15],置于RXZ智能人工氣候箱,溫度(28±1)℃,光強(qiáng)40μmol·m-2·s-1,濕度70%,光暗比14 h:10 h；儲(chǔ)備藻種培養(yǎng)于500 mL錐形瓶,200～400 mL培養(yǎng)液,培養(yǎng)至藻對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,顏色為深藍(lán)綠色,利用4層紗布封口以防污染[16]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

通過(guò)血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行藻類計(jì)數(shù),于波長(zhǎng)685 nm下測(cè)定藻類光密度,建立不同藻類細(xì)胞密度和光密度之間線性關(guān)系,以計(jì)數(shù)的藻細(xì)胞濃度和光密度表示藻生物量,通過(guò)二者線性關(guān)系進(jìn)行檢驗(yàn)。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻接種于50 mL三角錐形瓶中,接種密度為3.7×106cells·mL-1左右,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置甲草胺和乙草胺的一系列濃度梯度為8.0、16.0、24.0、32.0mg·L-1,丁草胺為2.0、5.0、10.0、15.0mg·L-1。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,分別于培養(yǎng)24、48、96、120、144、168 h后測(cè)定不同處理組在紫外光685 nm下的吸光度值,根據(jù)藻細(xì)胞數(shù)量與光密度之間的線性關(guān)系,繪制藻液生長(zhǎng)曲線圖。

圖1 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻生物量的影響注:(a)甲草胺；(b)乙草胺；(c)丁草胺?！?”和“**”分別表示P＜0.05和P＜0.01。P＜0.05時(shí),表示處理和對(duì)照之間具有顯著性差異；P＜0.01時(shí),表示處理與對(duì)照之間差異極其顯著。另外,“′”在圖(a)和圖(b)表示8.0mg·L-1,在圖(c)表示2.0mg·L-1,“′”在圖(a)和圖(b)表示16.0mg·L-1,在圖(c)表示5.0mg·L-1,“′′”在圖(a)和圖(b)表示24.0mg·L-1,在圖(c)表示10.0mg·L-1,“′′”在圖(a)和圖(b)表示32.0mg·L-1,在圖(c)表示15.0mg·L-1。不同小寫字母代表各濃度之間的顯著性差異,字母相同代表沒(méi)有差異,沒(méi)有字母代表沒(méi)有差異。Fig.1 Effects of acetanilide herbicides on the biomass ofM.aeruginosaNote:(a)alachlor;(b)acetochlor;(c)butachlor.“*”indicatesP＜0.05 and“**”indicatesP＜0.01.P＜0.05 means that there is a significant difference between the treatment and the control;P＜0.01 means that there is a very significant difference between the treatment and the control.“′”in Fig.(a)and Fig.(b)indicates 8.0mg·L-1,2.0mg·L-1in Fig.(c).“′”in Fig.(a)and Fig.(b)indicates 16.0mg·L-1,5.0mg·L-1in Fig.(c).“′′”in Fig.(a)and Fig.(b)indicates 24.0mg·L-1,10.0mg·L-1in Fig.(c).“′′”in Fig.(a)and Fig.(b)indicates 32.0mg·L-1, 15.0mg·L-1in Fig.(c).Different small letters represent significant difference between the various concentrations.Same letters represent no difference and no letters represent no difference.

1.4.2 藻細(xì)胞提取液的制備

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻接種于100 mL三角錐形瓶中,接種密度為3.7×106cells·mL-1左右,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定甲草胺和乙草胺的一系列濃度梯度為16.0、24.0、32.0mg·L-1,丁草胺為5.0、10.0、15.0mg·L-1。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,分別收集50 mL藻溶液培養(yǎng)24、48、96 h后的細(xì)胞。加入1 mL PBS緩沖液使細(xì)胞重新懸浮于溶液中。細(xì)胞破碎儀輸出功率為200 W,置于冰浴破碎5 min(每次破5 s,停10 s)。4℃下12 000 r·min-1離心10 min,取上清液于冰水浴中保存[16]。

1.4.3 分析方法

藻細(xì)胞提取液蛋白含量:采用bradford法[17],以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),加入考馬斯亮藍(lán)顯色劑,紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)595 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算蛋白含量。

丙二醛(MDA):根據(jù)過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成的紅色產(chǎn)物在532 nm處最大吸收峰的原理[18],按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定組織及細(xì)胞中MDA的含量。

超氧化物歧化酶(SOD):采用黃嘌呤氧化酶法[19],在550 nm處測(cè)定吸光度值,按試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法取上清液測(cè)定組織及細(xì)胞中SOD的活力。

過(guò)氧化物酶(POD):利用POD催化過(guò)氧化氫反應(yīng)的原理,按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定POD活性,檢測(cè)波長(zhǎng)為420 nm,蒸餾水調(diào)零,比色。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Origin 8.0和SPSS進(jìn)行顯著性檢測(cè),P＜0.05表示具有顯著性差異,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可知,3種酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)具有一定的影響,表現(xiàn)為低濃度(8.0mg·L-1)暴露組刺激藻類增長(zhǎng),高濃度(15.0mg·L-1)則抑制增長(zhǎng),且與暴露時(shí)間和暴露濃度成正相關(guān)關(guān)系。以乙草胺組為例(圖1a),暴露前3天各濃度組對(duì)藻的生物量無(wú)顯著影響,存在滯后效應(yīng)；暴露第4天,藻類生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,且高濃度組(＞16mg·L-1)與對(duì)照之間差異顯著；暴露7 d后,32mg·L-1處理組的抑制率達(dá)到56.1%。甲草胺和丁草胺暴露組存在相似的抑制規(guī)律。尤其在丁草胺暴露組中,15mg L-1時(shí),其抑制率已達(dá)到38.3%。低濃度(＜16mg·L-1)甲草胺和乙草胺處理組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異,而10mg·L-1丁草胺處理組與對(duì)照組之間差異已顯著,說(shuō)明藻對(duì)丁草胺的敏感性大于甲草胺和乙草胺。在實(shí)驗(yàn)后3天內(nèi)甲草胺、乙草胺和丁草胺對(duì)藻的EC50值分別從76.6mg·L-1、53.8mg·L-1和34.1mg·L-1,降到37.7mg·L-1、32.2mg·L-1和20.5mg·L-1,說(shuō)明除草劑對(duì)藻的毒性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng),同時(shí)也說(shuō)明丁草胺的毒性相對(duì)較大。整體上看,不同除草劑對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)影響較為一致,表現(xiàn)出明顯的劑量–效應(yīng)關(guān)系。

圖2 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻體內(nèi)MDA的變化注:(a)甲草胺；(b)乙草胺；(c)丁草胺。“*”和“**”分別表示P＜0.05和P＜0.01。P＜0.05時(shí),表示處理和對(duì)照之間具有顯著性差異；P＜0.01時(shí),表示處理與對(duì)照之間差異極其顯著。不同小寫字母代表各濃度之間的顯著性差異,字母相同代表沒(méi)有差異,沒(méi)有字母代表沒(méi)有差異。Fig.2 The MDA change of acetanilide herbicides on M.aeruginosaNote:(a)alachlor;(b)acetochlor;(c)butachlor.“*”indicatesP＜0.05 and“**”indicatesP＜0.01.P＜0.05 means that there is a significant difference between the treatment and the control;P＜0.01 means that there is a very significant difference between the treatment and the control.Different small letters represent significant difference between the various concentrations.Same letters represent no difference and no letters represent no difference.

2.2 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻MDA含量的影響

圖2表示銅綠微囊藻細(xì)胞在不同濃度除草劑暴露24、48和96 h后體內(nèi)MDA的含量。以乙草胺為例(圖2b),MDA的含量隨濃度增加而增加,32.0mg·L-1處理組與對(duì)照組存在顯著性差異,尤其在96 h時(shí),相對(duì)MDA水平達(dá)到204%,說(shuō)明藻受到外來(lái)脅迫產(chǎn)生的多余氧自由基,與生物膜中的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化作用,造成脂質(zhì)過(guò)氧化物增加。類似地,在甲草胺暴露后期,各處理組的MDA含量明顯高于對(duì)照組,存在極顯著性差異,16.0、24.0和32.0mg·L-1處理組分別為對(duì)照組的131%、134%及138%,但48 h內(nèi)無(wú)顯著影響作用。丁草胺暴露下, 10.0mg·L-1處理組MDA含量最高,與對(duì)照之間具有顯著性差異；96 h時(shí),5.0、10.0和15mg·L-1處理組相對(duì)MDA水平分別為151%、163%和154%。與乙草胺和丁草胺不同,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),甲草胺濃度的變化對(duì)藻細(xì)胞體內(nèi)MDA含量的影響不大?？傮w上,處理組的MDA含量均比對(duì)照組高,隨除草劑濃度的升高呈上升趨勢(shì)。

2.3 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻SOD水平的影響

圖3表示不同濃度除草劑處理銅綠微囊藻24、48和96 h后細(xì)胞內(nèi)SOD活性的大小。以甲草胺組為例(圖3a),藻細(xì)胞體內(nèi)的SOD活性被激發(fā),隨時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加而增強(qiáng)；第48小時(shí)開(kāi)始,各處理組均與對(duì)照之間存在顯著性差異；96 h時(shí)32mg·L-1甲草胺對(duì)SOD活性具有極顯著促進(jìn)作用,相對(duì)SOD水平為116%。說(shuō)明為去除細(xì)胞體內(nèi)增多的氧自由基,SOD活性增強(qiáng),使在催化作用下轉(zhuǎn)化為O2和H2O2,減輕了對(duì)藻細(xì)胞的傷害。丁草胺組也存在類似的規(guī)律,48 h后SOD活性與濃度呈極顯著正相關(guān),各濃度組間也存在顯著性差異；96 h時(shí)15mg·L-1處理組的相對(duì)SOD水平為115%。特別地,乙草胺組在96 h時(shí)不同濃度組之間雖然也存在顯著性差異,但SOD活性與濃度呈極顯著負(fù)相關(guān),32mg·L-1處理組的相對(duì)SOD水平僅為87%。高濃度組(＞16mg·L-1)出現(xiàn)抑制作用,SOD活性下降明顯。這可能是由于在高濃度乙草胺的環(huán)境下隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞體內(nèi)ROS的產(chǎn)生量大于抗氧化酶的清除能力,產(chǎn)生氧化損傷,使得藻體部分代謝機(jī)能下降,藻類不能正常生長(zhǎng),導(dǎo)致SOD活性降低,與圖1b中96 h時(shí)高濃度暴露下藻類生長(zhǎng)受到抑制的現(xiàn)象相一致。從整體上看,處理組的SOD活性均比對(duì)照組高,且除草劑濃度越高,SOD活性也越高。

圖3 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻體內(nèi)SOD的變化注:(a)甲草胺；(b)乙草胺；(c)丁草胺。“*”和“**”分別表示P＜0.05和P＜0.01。P＜0.05時(shí),表示處理和對(duì)照之間具有顯著性差異；P＜0.01時(shí),表示處理與對(duì)照之間差異極其顯著。不同小寫字母代表各濃度之間的顯著性差異,字母相同代表沒(méi)有差異,沒(méi)有字母代表沒(méi)有差異。Fig.3 The SOD change of acetanilide herbicides onM.aeruginosaNote:(a)alachlor;(b)acetochlor;(c)butachlor.“*”indicates P＜0.05 and“**”indicatesP＜0.01.P＜0.05 means that there is a significant difference between the treatment and the control; P＜0.01 means that there is a very significant difference between the treatment and the control.Different small letters represent significant difference between the various concentrations.Same letters represent no difference and no letters represent no difference.

圖4 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻體內(nèi)POD的變化注:(a)甲草胺；(b)乙草胺；(c)丁草胺?！?”和“**”分別表示P＜0.05和P＜0.01。P＜0.05時(shí),表示處理和對(duì)照之間具有顯著性差異；P＜0.01時(shí),表示處理與對(duì)照之間差異極其顯著。不同小寫字母代表各濃度之間的顯著性差異,字母相同代表沒(méi)有差異,沒(méi)有字母代表沒(méi)有差異。Fig.4 The POD change of acetanilide herbicides onM.aeruginosaNote:(a)alachlor;(b)acetochlor;(c)butachlor.“*”indicatesP＜0.05 and“**”indicatesP＜0.01.P＜0.05 means that there is a significant difference between the treatment and the control;P＜0.01 means that there is a very significant difference between the treatment and the control.Different small letters represent significant difference between the various concentrations. Same letters represent no difference and no letters represent no difference.

2.4 酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻POD水平的影響

圖4表示隨時(shí)間的延長(zhǎng),不同除草劑的濃度變化對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)POD活性的影響。藻發(fā)生氧脅迫不僅使SOD活性增強(qiáng),同時(shí)也導(dǎo)致了POD活性增強(qiáng),以去除過(guò)多的H2O2。同樣以甲草胺組為例(圖4a),在暴露期間內(nèi),POD活性與濃度呈顯著劑量–效應(yīng)正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05),16.0mg·L-1和32.0mg·L-1處理組具有顯著性差異,96 h時(shí)相對(duì)POD水平分別為379%和475%。乙草胺和丁草胺組存在類似的促進(jìn)作用,48 h開(kāi)始,處理組POD活性與對(duì)照組之間差異極顯著(P＜0.01)。尤其是丁草胺組,10.0mg·L-1濃度組POD活性持續(xù)顯著增強(qiáng),24、48和 96 h時(shí)相對(duì) POD水平分別達(dá)到127%、221%、576%；48 h內(nèi),不同濃度組之間對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)POD活性的影響差異不顯著；96 h時(shí),高濃度與低濃度之間存在顯著差異,5、10和15mg·L-1處理組相對(duì)POD水平分別為412%、576%和627%。乙草胺組在96 h時(shí),32.0mg·L-1濃度組的POD活性相比16.0mg·L-1和24.0mg·L-1濃度組明顯降低,相對(duì)POD水平為278%,這與圖3b中96 h時(shí)高濃度SOD活性最低的現(xiàn)象具有一定的聯(lián)系,高濃度暴露下細(xì)胞受到損傷,SOD活性的降低導(dǎo)致產(chǎn)生的H2O2減少,POD活性相應(yīng)地也隨之降低。從整體上看,處理組的藻細(xì)胞體內(nèi)POD活性明顯增強(qiáng),且暴露時(shí)間越長(zhǎng),除草劑濃度越高,POD活性也越強(qiáng)。

3 討論(Discussion)

從酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,前3天不同濃度除草劑對(duì)銅綠微囊藻生物量的影響與對(duì)照組相比差異性極小,說(shuō)明除草劑在短時(shí)間內(nèi)對(duì)銅綠微囊藻影響甚小,存在滯后效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),甲草胺、乙草胺和丁草胺對(duì)銅綠微囊藻的毒性作用有較好的劑量–效應(yīng)關(guān)系,但低濃度的毒性效果不顯著。王秀紅等[20]發(fā)現(xiàn)丁草胺濃度在4～20mg·L-1范圍內(nèi)時(shí)促進(jìn)3種魚(yú)腥藻生長(zhǎng),大于20mg·L-1時(shí)抑制生長(zhǎng)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)10mg·L-1丁草胺對(duì)銅綠微囊藻已呈現(xiàn)顯著抑制作用,抑制率為25%。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到后3天內(nèi),除草劑對(duì)藻的EC50值呈現(xiàn)下降趨勢(shì),如丁草胺第7天的EC50值降至20.5mg·L-1,與賀鴻志等[21]研究發(fā)現(xiàn)丁草胺對(duì)鈍頂螺旋藻的EC50值在7 d內(nèi)從82mg·L-1急劇降至15.2mg·L-1的結(jié)果相一致。楊志強(qiáng)等[22]在普通小球藻對(duì)嗪草酮、驃馬和甲草胺的敏感性研究中也發(fā)現(xiàn)類似的毒性增強(qiáng)現(xiàn)象。這可能是由于培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)的缺乏或其他條件的變化使得藻細(xì)胞密度減少降低EC50值。

由于不同除草劑的類型或結(jié)構(gòu)不同,因此藻類對(duì)除草劑的敏感性存在差異[23]。蔡衛(wèi)丹等[24]在對(duì)映體水平上研究發(fā)現(xiàn)Rac-和S-異丙甲草胺對(duì)微藻細(xì)胞的急性毒性存在立體選擇性差異,表現(xiàn)為S-異丙甲草胺的毒性較大,且對(duì)斜生柵藻的抑制作用比普通核小球藻顯著。本研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻對(duì)丁草胺的毒性最敏感,乙草胺次之,甲草胺較不敏感。吳曉霞等[25]也發(fā)現(xiàn)丁草胺相比乙草胺濃度的升高對(duì)金魚(yú)藻生物量的下降更顯著。

從氧化損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,銅綠微囊藻體內(nèi)MDA含量隨著除草劑濃度的增加而增加(圖2)。不同濃度處理組的MDA含量均明顯高于對(duì)照組,且差異性顯著。這與湛靈芝等[26]研究結(jié)論相一致。其中MDA作為植物體內(nèi)脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物,細(xì)胞損傷程度越嚴(yán)重,其含量越高[27],因此MDA含量可作為一種有效的生物標(biāo)志物對(duì)酰胺類除草劑引起藻類的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)除草劑濃度超過(guò)藻類耐受極限時(shí),藻細(xì)胞機(jī)體功能受到傷害,MDA含量降低,如15.0mg·L-1丁草胺濃度組MDA含量低于10.0mg·L-1濃度組(圖2(3))。本實(shí)驗(yàn)中,SOD、POD活性在整體上具有隨除草劑濃度增加而增加的趨勢(shì)。與本文研究結(jié)果類似,Wu等[28]研究結(jié)果表明,藍(lán)藻在銅的作用下,SOD和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性均比空白顯著增加,其增加的SOD活力用于對(duì)抗增加的氧化壓力。Pflugmacher等[29]也曾報(bào)道在外來(lái)化合物氧化壓力下菠菜中SOD活性比空白高。

特別地,在高濃度乙草胺處理下,SOD、POD活性隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象(圖3b)。有研究表明酶的活性大小與體內(nèi)和H2O2的積累程度有關(guān)[30],說(shuō)明高濃度乙草胺誘發(fā)了藻體內(nèi)ROS的生成,為減輕氧化損傷程度,SOD和POD活性增加,清除過(guò)多的和H2O2[13]。 但當(dāng)?shù)漠a(chǎn)生量大于抗氧化酶的清除能力時(shí),藻細(xì)胞功能受到破壞,生理代謝機(jī)能下降,不能正常生長(zhǎng),導(dǎo)致SOD活性受到抑制而降低。高濃度下POD活性雖呈現(xiàn)降低趨勢(shì),但仍高于對(duì)照組,說(shuō)明H2O2累積含量未達(dá)到銅綠微囊藻受損程度。這與湛靈芝等[26]對(duì)乙草胺進(jìn)行單一處理時(shí)的結(jié)果相一致。Yin等[31]研究也發(fā)現(xiàn)煙草細(xì)胞受藻毒素刺激后,SOD活性出現(xiàn)先增加后減少現(xiàn)象。Qian等[32]研究發(fā)現(xiàn),高濃度的阿特拉津和草胺磷會(huì)引起普通小球藻體內(nèi)MDA含量的增高,而SOD及POD的活性均低于對(duì)照組,說(shuō)明和H2O2含量的積累達(dá)到小球藻受害程度。

除草劑對(duì)藻類抗氧化酶活性的影響報(bào)道已有很多,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大,同一除草劑對(duì)不同水生植物具有不同的毒性效應(yīng)。本研究結(jié)果表明,當(dāng)乙草胺和丁草胺濃度分別為24.0mg·L-1和15.0mg·L-1時(shí),銅綠微囊藻POD的活性最高。梁衛(wèi)玲等[33]對(duì)浮萍的毒性效應(yīng)研究結(jié)果表明在上述濃度作用下,除草劑對(duì)POD的活性表現(xiàn)為抑制作用。POD活性達(dá)到最高時(shí),乙草胺和丁草胺濃度為7.65mg·L-1和2.50mg·L-1,激活率分別可達(dá)6.29%和22.68%。湛靈芝等[26]發(fā)現(xiàn)乙草胺濃度為3.5mg·L-1時(shí)少根紫萍POD活性最大,而后呈下降趨勢(shì)。陳傳紅等[34]則發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻在低濃度(0.01mg·L-1和0.02mg·L-1)丁草胺處理下,POD活性有所增加。

結(jié)合酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻生物量和抗氧化酶活性的影響,可以發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi),除草劑暴露下藻類生長(zhǎng)速率降低(圖1),與對(duì)照組相比,處理組的生物量減少,但總體上MDA、SOD和POD活性呈上升趨勢(shì),這與文獻(xiàn)[19,35]的研究結(jié)果一致。

酰胺類除草劑對(duì)銅綠微囊藻的毒性作用方式有很多,除本研究所討論的氧化損傷外,還可能通過(guò)影響葉綠素的合成等其他方式進(jìn)而抑制藻類的生長(zhǎng),且實(shí)驗(yàn)溫度、pH和氮磷含量等水體環(huán)境均會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響[36-37],故其具體毒性機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

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Effects of Acetanilide Herbicides on Growth and Oxidative Damage of Microcystis aeruginosa

Li Xinfang1,Suo Yaping1,Lou Yuanyang1,Xu Chao1,*,Liu Weiping2
1.College of Environment,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China
2.College of Environmental and Resource Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China

20 May 2015 accepted 14 July 2015

The widespread use of acetanilide herbicides causes potential risks to aquatic ecological environment.In order to reveal their toxic effect on algae,we usedMicrocystis aeruginosaas the model organism,the impacts on biomass and oxidative damage of alachlor,acetochlor and butachlor toM.aeruginosawere investigated.The results showed an obvious lag effect and dose-response relationship.Lower concentrations of herbicides stimulated the growth of algae,but higher concentrations inhibited the growth.The oxidative pressure onM.aeruginosaincreased with the extension of exposure time and the increasing concentrations of the three acetanilide herbicides.Levels of malondialdehyde(MDA)which is a lipid peroxide degradation product,were markedly increased,meanwhile,theactivities of superoxide dismutase(SOD)and peroxidase(POD)were also significantly increased.After 96 h exposure,the relative MDA contents in alachlor(32.0mg·L-1),acetochlor(32.0mg·L-1)and butachlor(15.0mg·L-1)exposure solution were 138%,204%and 154%,the relative SOD activities were 116%,87%and 115%,the relative POD activities were 475%,278%and 627%,respectively.Combined the results of biomass and oxidative damage, the order of toxicity to theM.aeruginosaof the three acetanilide herbicides was butachlor＞acetochlor＞alachlor.

acetanilide herbicides;Microcystis aeruginosa;oxidative damage;growth inhibition

2015-05-20 錄用日期:2015-07-14

1673-5897(2016)1-239-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150520001

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國(guó)家自然科學(xué)基金(21277126)；浙江省自然科學(xué)基金(LY15B070007)；教育部科技創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目培育資金項(xiàng)目(708052)

李薪芳(1992-),女,碩士,研究方向?yàn)檗r(nóng)藥水生毒性,E-mail:lixinfang@zjut.edu.cn

),E-mail:chaoxu@zjut.edu.cn

簡(jiǎn)介:徐超(1979—)，男，環(huán)境科學(xué)博士，副教授，主要研究方向環(huán)境化學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇。