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        三氯乙基磷酸酯阻燃劑對日本鵪鶉胚胎的發(fā)育毒性

        2016-12-06 06:11:08張俊江張效偉于紅霞
        生態(tài)毒理學(xué)報 2016年1期
        關(guān)鍵詞:鵪鶉臟器鳥類

        張俊江,張效偉,于紅霞

        南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院污染控制與資源化研究國家重點實驗室,南京210023

        三氯乙基磷酸酯阻燃劑對日本鵪鶉胚胎的發(fā)育毒性

        張俊江,張效偉*,于紅霞

        南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院污染控制與資源化研究國家重點實驗室,南京210023

        三氯乙基磷酸酯(tris(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)是有機磷阻燃劑的一種。文獻報道TCEP在多種環(huán)境介質(zhì)中均有檢出,且檢出濃度較高,同時被報道能夠產(chǎn)生神經(jīng)毒性與致癌性,然而其對生態(tài)生物在敏感生命階段的發(fā)育毒性還不清楚。為研究TCEP對鳥類的發(fā)育毒性,本次試驗采用胚胎注射的方法,用TCEP對日本鵪鶉胚胎進行21 d暴露,研究TCEP對鵪鶉胚胎的致死效應(yīng)和對體重以及臟器系數(shù)的影響。實驗結(jié)果顯示TCEP對鵪鶉胚胎的LD50為118μg·g-1egg,95%置信區(qū)間為73.3~163μg·g-1egg,最低效應(yīng)濃度(LOEL)是83.1μg·g-1egg,最高無效應(yīng)濃度(NOEL)是8.31μg·g-1egg。臟器系數(shù)的方差分析結(jié)果顯示TCEP對幼鳥的肝臟、腦、心臟的發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響,166μg·g-1egg濃度下,鵪鶉胚胎的肝臟(P=0.0005),腦(P= 0.0024)和心臟(P=0.0005)的臟器系數(shù)受到了明顯的影響。本次試驗的結(jié)果為開展TCEP對鳥類的生態(tài)風(fēng)險評估提供了數(shù)據(jù)支撐。

        三氯乙基磷酸酯;日本鵪鶉;器官發(fā)育

        鳥類胚胎注射實驗是一種在國外使用廣泛,方法成熟的毒性實驗方法,最早在Allred等[1]發(fā)表的論文中使用。研究鳥類胚胎發(fā)育毒性的傳統(tǒng)方法是通過母代暴露,然后通過富集傳遞給子代。這種方法不僅實驗周期長,而且進入鳥蛋中的濃度也具有不確定性,需要通過化學(xué)分析后進行毒性實驗。而鳥類胚胎注射實驗?zāi)軌蛎黠@縮短實驗周期,保證實驗的平行性,并且,針對一些不便養(yǎng)殖的野生鳥類,我們也可以通過收集野生鳥蛋注射的方法進行毒性試驗,這對化學(xué)品的生態(tài)風(fēng)險評估具有很大的推動作用。有文獻報道,與成鳥暴露實驗相比,鳥類胚胎注射實驗的敏感性強[2]。鳥類胚胎注射實驗研究的是從受精卵開始,發(fā)育到幼體的過程,而這個過程在哺乳類動物中很難進行研究,實驗成本很高,同時,鳥類又是與哺乳類動物在進化上最接近的物種,鳥類的胚胎注射結(jié)果能夠近似體現(xiàn)哺乳類動物的結(jié)果。美國環(huán)保局在2001年的報告中詳細(xì)描述了鳥類胚胎注射實驗在二惡英類似物的的生態(tài)風(fēng)險評估中的應(yīng)用[3]。而2006年發(fā)布“Study Plan For Avian Egg Injection Study”(http://www.dec.ny.gov/docs/ wildlife_pdf/wpavwldin.pdf)文中對野生鳥蛋的采集與孵化條件以及暴露方式有詳盡的描述。但目前在國內(nèi),很少有研究使用鳥類胚胎注射的方法進行化學(xué)品的生態(tài)風(fēng)險評估。

        三氯乙基磷酸酯(TCEP)作為有機磷阻燃劑的一種被廣泛的使用在家具、塑料、油漆等領(lǐng)域[4]。在國內(nèi),許多環(huán)境介質(zhì),例如飲用水[5]和底泥[6]之中都有TCEP的檢出,最高濃度分別達到了48.8 ng·L-1和3.17μg·kg-1。環(huán)境中TCEP能夠通過食物鏈的富集進入鳥類體內(nèi),進而對鳥類產(chǎn)生影響。針對鳥類體內(nèi)TCEP的濃度,最近的研究表明,在廣州省養(yǎng)殖場內(nèi)的雞鴨體內(nèi)的TCEP濃度達到了33.7~162 ng·g-1脂重[7]。休倫湖地區(qū)的銀鷗(herring gull)蛋內(nèi)TCEP的濃度達到了0.02~0.55 ng·g-1濕重[8]。另一項研究表明,五大湖區(qū)銀鷗蛋白中TCEP濃度達到了(1.46±0.77)ng·g-1濕重,蛋黃中濃度達到了(1.38 ±0.31)ng·g-1濕重[9]。這些數(shù)據(jù)引起我們對TCEP對鳥類毒性的興趣。

        毒理學(xué)研究證明,TCEP具有致癌性[10],同時對大鼠[11]和小鼠[12]產(chǎn)生神經(jīng)毒性。在H295R細(xì)胞中, TCEP能夠引起17β雌二醇和睪酮濃度的上升,暗示了TCEP的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[13]。大鼠在TCEP的暴露下,顯示出生殖方面的負(fù)效應(yīng),例如生殖力的下降,生殖周期的增長,以及精子的密度和活力的下降[14]。以上的毒理學(xué)信息提示我們,TCEP可能對幼體的發(fā)育過程產(chǎn)生毒性效應(yīng)。但是目前并沒有關(guān)于鳥類的毒性數(shù)據(jù)報道出來。發(fā)育毒性作為生態(tài)風(fēng)險評估中的重要一部分,對于群落演替以及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有重要的影響。而日本鵪鶉(Coturnix coturnix japonica)作為本土的模式生物的一種,具有很高的經(jīng)濟價值??紤]到鳥類在生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用,本次實驗選擇鵪鶉胚胎作為受試生物,研究TCEP對鵪鶉胚胎的發(fā)育毒性以及器官臟器系數(shù)的影響。

        1 材料與方法(Materials and methods)

        1.1 實驗材料

        日本鵪鶉種蛋從南京本地的養(yǎng)殖場中一次性購買,二甲亞砜(HPLC級,dimethyl sulfoxide,DMSO, Sigma Aldrich),TCEP(97%,Sigma Aldrich),無水乙醇(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 鵪鶉蛋準(zhǔn)備

        將購買來的鵪鶉蛋進行篩選,將蛋殼有裂縫或破損以及大小異常的蛋剔除掉。稱重記錄,并用記號筆編號,然后放在13~15℃的培養(yǎng)箱中儲藏(時間不超過1周),濕度65%左右。在注射開始前的一天,將鵪鶉蛋取出置于室溫下復(fù)蘇。在儲藏和復(fù)蘇時保證鈍端向上。

        1.2.2 濃度設(shè)置與胚胎注射

        胚胎注射的方法參考前人的研究并做了少許改動[15]。前人的研究表明,0.1~0.2μL·g-1蛋的注射劑量不會引起明顯的胚胎死亡[16]。根據(jù)上一步得出鵪鶉蛋的平均重量(12.03±0.95)g,確定每個蛋注射2μL。由于蛋的重量差異并不顯著,所以采用統(tǒng)一的劑量注射,而不是根據(jù)不同蛋的重量進行不同劑量的注射。由于TCEP的密度為1.39 g·mL-1,所以注射劑量的最大值為2.78mg,另外設(shè)置濃度組0.831、8.31、83.1、166μg·g-1egg 4個濃度組,以DMSO為助溶劑,溶劑對照組和空白對照組。

        鵪鶉蛋的注射在生物安全柜(ESCD CLASSⅡ)內(nèi)完成。每個蛋在移入超生物安全柜前先用70%酒精擦拭消毒。根據(jù)前人的研究,氣室由于能夠使化學(xué)物質(zhì)更加容易且快速的進入胚胎中所以在本次試驗中被選為注射位點[17]。用銼刀將蛋鈍端蛋殼銼薄,用移液槍(Rainin pipetman pipet-lite 20xls with RFID LTS)和針形槍頭在銼薄的蛋殼的位置打孔,并將2μL對應(yīng)溶液打到鵪鶉蛋氣室靠近內(nèi)膜的位置。槍頭每次注射完進行更換。每個濃度組設(shè)置30個蛋。注射后的鳥蛋用融化的石蠟封口。每個胚胎的注射過程要在30 min之內(nèi)完成。

        1.2.3 鳥蛋孵化與解剖

        將鵪鶉蛋放在孵化機(萬盛微電腦全自動數(shù)顯孵化機,南京萬盛孵化設(shè)備有限公司)內(nèi)孵化,孵化條件遵循前人的研究[18]。孵化時鈍端朝上,溫度控制在37.8℃左右,濕度控制在65%左右。每一個半小時翻蛋一次,每次翻轉(zhuǎn)90°。鵪鶉的孵化期大約是17~18 d。在第15天的時候?qū)Ⅸg鶉轉(zhuǎn)移到對應(yīng)劑量組的籠子里。孵化21 d后如果仍不出殼,就將蛋殼打開進行觀察和記錄。將出殼以后的鵪鶉稱重并記錄,對明顯的病理學(xué)特征進行記錄。然后斷頭處死,解剖。取出鵪鶉的肝臟、腦、心臟、肺,分別稱量。對于21 d沒有出殼的鳥蛋進行破殼,觀察胚胎是否存活,并對實驗組中未受精的蛋進行排除。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        本次試驗的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0 software(San Diego,CA)和SPSS18.0(SPSS Inc.)處理。LD50使用logistic擬合求得,將器官的濕重除以對應(yīng)鵪鶉的體重獲得該個體的臟器系數(shù)。對死亡率數(shù)據(jù)進Fisher exact test。對于鵪鶉的體重以及臟器系數(shù),首先采用shapiro-wilk法進行正態(tài)分布的檢驗,對于符合正態(tài)分布的組進levene檢驗方差齊性,對于符合方差齊性的數(shù)據(jù)進行one-way ANOVA,Dunnett法進行兩兩比較檢驗顯著性差異,對于不符合正態(tài)分布或者方差齊性的進行Mann-Whitney檢驗。

        2 結(jié)果(Results)

        2.1 TCEP對鵪鶉胚胎的毒性效應(yīng)

        Fisher exact test結(jié)果顯示,空白組和溶劑對照組的死亡率并沒有顯著性差異(P=0.419)。說明助溶劑DMSO并不會對胚胎死亡率產(chǎn)生顯著性的影響,后續(xù)分析均采用溶劑對照進行比較。TCEP對鵪鶉胚胎致死率見圖1,說明0.831~231μg·g-1egg TCEP對鵪鶉胚胎產(chǎn)生明顯的劑量效應(yīng)相關(guān)的致死現(xiàn)象,致死率隨著濃度的升高而上升。結(jié)果顯示, 83.1、166、231μg·g-1egg 3個濃度的TCEP會導(dǎo)致顯著性致死效應(yīng)。經(jīng)計算TCEP對鵪鶉胚胎的LD50=118μg·g-1egg。95%置信區(qū)間為73.3~163μg·g-1egg。本次試驗的最低效應(yīng)濃度(LOEL)是83.1μg·g-1egg,最高無效應(yīng)濃度(NOEL)是8.31μg·g-1egg。

        圖1 TCEP對鵪鶉胚胎的劑量效應(yīng)曲線注:圖中“*”表示Fisher exact test中P<0.05,“n”表示處理組中的個體數(shù)。Fig.1 Dose-response curve of TCEP on quail embryoNote:”*”meansPvalue<0.05 in the Fisher exact test.“n”means the sample number in each treatment group.

        2.2 TCEP對鵪鶉幼鳥的體重以及臟器系數(shù)的影響

        臟器系數(shù)作為毒理學(xué)中一項敏感指標(biāo),臟器系數(shù)的上升往往意味著器官可能出現(xiàn)了水腫、充血、積水、增生等病變[19]。T檢驗的結(jié)果顯示空白對照和溶劑對照之間的體重與臟器系數(shù)均不存在顯著性差異,說明助溶劑DMSO對這些指標(biāo)不產(chǎn)生影響,后續(xù)分析均采用溶劑對照數(shù)據(jù)進行比較(圖2)。

        方差分析的結(jié)果顯示,TCEP對鵪鶉幼鳥的體重并不產(chǎn)生影響,但對于幼鳥的肝臟(P=0),腦(P= 0.01),心臟(P=0.005)的發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響。尤其是肝臟和腦的臟器系數(shù),在0.831~166μg·g-1egg濃度區(qū)間內(nèi)表現(xiàn)出隨濃度上升而增加的趨勢。在166μg·g-1egg濃度下,肝臟(P=0.0005),腦(P= 0.0024)和心臟(P=0.0005)臟器系數(shù)均有顯著增加。

        對于231μg·g-1egg濃度組,雖然數(shù)據(jù)顯示出從幼鳥體重到臟器系數(shù)都觀測到減輕的趨勢,但是由于樣本數(shù)太少,統(tǒng)計檢驗的結(jié)果并不具有顯著性。在231μg·g-1egg濃度下,死亡率已經(jīng)達到了87.5%,而且出殼以后的幼鳥均發(fā)現(xiàn)有腿部發(fā)育不良,不能穩(wěn)定站立的現(xiàn)象,說明231μg·g-1egg濃度對鵪鶉的發(fā)育已經(jīng)造成很大影響。

        圖2 TCEP對鵪鶉幼鳥體重(A)和臟器系數(shù)(B)的影響注:標(biāo)注“*”為Dunnett檢驗中P<0.05。Fig.2 Effect on body weight(A)and organ coefficient(B) of quail embryo by TCEPNote:“*”meantPvalue<0.05 in Dunnett test.

        3 討論(Discussion)

        把鳥類胚胎注射實驗應(yīng)用到化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險評估的研究在國內(nèi)還不常見。本研究通過鳥類胚胎注射實驗獲得TCEP對日本鵪鶉胚胎發(fā)育毒性的LD50、NOEL、LOEL值,對盡快開展該類污染物對鳥類生態(tài)風(fēng)險評估起到了推動作用。WHO報道TCEP大鼠經(jīng)口急性毒性LD50為1 150mg·kg-1體重[10],ECOTOX數(shù)據(jù)庫中收錄小鼠90 d暴露TCEP的LOEL為700mg·kg-1[20],而日本青鳉急性毒性LC50為66~245mg·L-1[21]。本次實驗首次報道了此類化合物對鳥類的毒性效應(yīng),彌補了TCEP在鳥類中毒性效應(yīng)的空白。

        TCEP暴露對鵪鶉胚胎體重及臟器系數(shù)產(chǎn)生影響,可以推斷,TCEP對鳥類發(fā)育的毒性效應(yīng),主要通過影響幼鳥肝臟、腦、心臟的發(fā)育產(chǎn)生,不是首先對個體體重產(chǎn)生影響。同時觀測到0.83~166μg·g-1egg濃度范圍內(nèi)臟器系數(shù),尤其是肝臟和腦,隨暴露濃度的升高而升高,但是231μg·g-1egg濃度組卻表現(xiàn)出下降趨勢。這個結(jié)果暗示:可能0.83~166μg·g-1egg濃度范圍內(nèi)的TCEP的暴露仍然在生物體恢復(fù)機制能承受范圍內(nèi),致毒機理在這個濃度范圍內(nèi)保持一致;而在231μg·g-1egg濃度的TCEP已經(jīng)超出了本身恢復(fù)機制的承受范圍,對鵪鶉胚胎造成不可逆的毒性效應(yīng),致毒機理也與之前有很大區(qū)別。

        前人的研究表明,700mg·kg-1的TCEP對大鼠進行16周的暴露,觀測到肝臟和腎臟重量的上升,并且觀測到對腦海馬組織的損傷,腦部的損傷主要體現(xiàn)在海馬組織CA1區(qū)域錐體細(xì)胞的缺失[22],上述肝臟重量上升的現(xiàn)象與本次實驗觀測到對肝臟的影響相符合。WHO報道 50μmol·kg-1C14標(biāo)記的TCEP在進行大鼠暴露實驗時,富集最明顯的器官是肝臟和腎臟[10]。這暗示了TCEP進入生物體內(nèi)以后作用機理可能是首先會在肝臟進行代謝,因此對肝臟造成了明顯的毒性效應(yīng),然后通過腎臟代謝排出體外。另一項研究中,2年時間的44和88mg·kg-1TCEP暴露對前腦和腦干產(chǎn)生了由膠質(zhì)細(xì)胞增生,礦化,出血,以及血鐵黃素的積累構(gòu)成的衰退損傷[23],這又與本次實驗中腦部臟器系數(shù)的上升相吻合,暗示本研究中鵪鶉幼鳥的腦部同樣有出現(xiàn)增生與礦化的可能。針對TCEP神經(jīng)化學(xué)機制的藥理學(xué)研究表明,TCEP能夠?qū)Ζ?氨基丁酸(GABA)有拮抗作用,而不是類膽堿型的激活劑[12]。這可能就是TCEP對腦部發(fā)育產(chǎn)生影響的原因。本次試驗發(fā)現(xiàn)TCEP的暴露對鳥類心臟發(fā)育的影響實屬首次。

        針對TCEP的鳥類風(fēng)險評估,可以利用風(fēng)險熵法(Hazard Quotient,HQ)模型進行:HQ=EEC/ERC,其中EEC為環(huán)境暴露濃度,ERC為環(huán)境風(fēng)險臨界基準(zhǔn)。由于目前針對鳥類只有本文的數(shù)據(jù),就取本次實驗的NOEL(8.31μg·g-1egg)作為ERC進行計算, EEC取前文提到的Chen等[8]和Greaves等[9]報道的鳥蛋中TCEP的濃度。按照這個公式計算,2個文獻中TCEP濃度計算所得HQ均小于10-3,所以當(dāng)?shù)豑CEP產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險很小。

        本次實驗沒有測定TCEP實際暴露濃度與在器官中的富集情況,如果能有這些信息,對于進一步推測其在鳥類體內(nèi)的代謝途徑有很大幫助,對TCEP對鳥類的生態(tài)風(fēng)險有一個更加詳盡的理解。另外對TCEP依然需要更加深入的毒性機理研究,通過尋找生物標(biāo)志物來進行更加敏感的毒性篩選與風(fēng)險評估。

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        Assessment on the Developmental Toxicity of Tris(2-Chloroethyl)Phosphate in Japanese Quail Embryo

        Zhang Junjiang,Zhang Xiaowei*,Yu Hongxia
        State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse,School of the Environment,Nanjing University,Nanjing 210023,China

        30 April 2015 accepted 11 June 2015

        Tris(2-chloroethyl)phosphate(TCEP),one of the organophosphate flame retardants,has been frequently detected in the environment at a wide concentration range.It has also been reported to cause neurotoxicity and carcinogenicity in mammals.However,limited knowledge is available on the developmental toxicity of TCEP on avian species.Here TCEP was assessed by use of embryos of Japanese quail(Coturnix coturnix japonica).The quail embryos were exposed to TCEP for 21 days and the mortality rate was assessed.The effect on the organ coefficients and body weight were also evaluated.Results showed LD50of TCEP on quail embryos was 118μg·g-1egg with a 95%confidence interval of 73.3~163μg·g-1egg.The lowest observed effect level(LOEL)was 83.1μg·g-1egg and the no observed effect level(NOEL)was 8.31μg·g-1egg.Furthermore,TCEP had a significant effect on the development of brain,liver and heart.The organ coefficients of liver,brain and heart from 166μg·g-1eggTCEP exposure group,were altered significantly(Pvalue=0.0005,0.0024 and 0.0005,respectively).These results provided valuable development toxicity data for the ecological risk assessment of TCEP to avian species.

        TCEP;Japanese quail;organ development

        2015-04-30 錄用日期:2015-06-11

        1673-5897(2016)1-167-06

        X171.5

        A

        10.7524/AJE.1673-5897.20150430003

        張俊江,張效偉,于紅霞.三氯乙基磷酸酯阻燃劑對日本鵪鶉胚胎的發(fā)育毒性[J].生態(tài)毒理學(xué)報,2016,11(1):167-172

        Zhang J J,Zhang X W,Yu H X.Assessment on the developmental toxicity of tris(2-chloroethyl)phosphate in Japanese quail embryo[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):167-172(in Chinese)

        環(huán)保公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201209016);江蘇省科技支撐計劃社會發(fā)展基金項目(BE2011776)

        張俊江,男,碩士研究生,研究方向為生態(tài)毒理學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué),E-mail:921514080@qq.com;

        ),E-mail:zhangxw@nju.edu.cn

        簡介:張效偉(1978—),男,動物學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)博士、教授、博士生導(dǎo)師,主要從事生態(tài)毒理學(xué)和健康風(fēng)險評估方面的研究,發(fā)表英文SCI論文80多篇,包括以一作或通訊作者在環(huán)境領(lǐng)域高影響刊物Environmental Science&Technology和Toxicological Science等上發(fā)表論文20多篇。

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