類維振，耿亞楠，韓東升，張偉，周林

（中國人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東泰安271000）

UHRF1表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機制

類維振，耿亞楠，韓東升，張偉，周林

（中國人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東泰安271000）

目的 探討泛素樣含PHD和環(huán)指域1（UHRF1）表達(dá)下調(diào)后對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討其作用機制。方法 將培養(yǎng)好的人胃癌細(xì)胞系（MKN45）隨機分為空白對照組、陰性對照組（shNC）和干擾組，后兩組分別感染病毒shNC、shUHRF1，采用短發(fā)夾RNA（shRNA）技術(shù)下調(diào)MKN45細(xì)胞中UHRF1表達(dá)，XTT法測定各組細(xì)胞生長情況，平板克隆形成試驗測算細(xì)胞克隆形成率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率；裸鼠皮下成瘤試驗檢測細(xì)胞體內(nèi)生長能力。結(jié)果 UHRF1表達(dá)下調(diào)后，MKN45細(xì)胞生長速度明顯下降、克隆形成減少（P均＜0.05）；干擾組G0／G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少（P均＜0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P均＜0.05）；裸鼠皮下腫瘤生長速度下降（P＜0.01）。結(jié)論 下調(diào)UHRF1的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，該作用可能通過延長細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。

胃腫瘤；泛素樣含PHD和環(huán)指域1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

胃癌是常見惡性腫瘤之一，包括中國在內(nèi)的東亞地區(qū)是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)［1］。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多基因、多分子水平變化、多階段的一個復(fù)雜過程，而基因的表觀遺傳學(xué)修飾在其中發(fā)揮重要作用［2］。泛素樣含PHD和環(huán)指域1（UHRF1）作為重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因子，參與DNA甲基化、細(xì)胞增殖和異染色質(zhì)形成等過程［3］，并且在肝癌［4］、前列腺癌［5］和乳腺癌［6］等腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤形成密切相關(guān)。2014年6月～2015年12月，本研究通過分子生物學(xué)方法觀察UHRF1基因沉默對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料 RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，RNA裂解液TRIzol購自美國Invitrogen公司；總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊，UHRF1和β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；UHRF1 shRNA及病毒由上海吉凱基因公司合成；XTT試劑盒購自羅氏公司；RT-PCR試劑盒購自大連Takala公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，熒光定量PCR分析儀7500購自美國ABI公司；Annexin V／碘化丙啶（propidiumiodide，PI）檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞系（MKN45）來源于第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。利用GV209載體構(gòu)建UHRF1短發(fā)夾RNA（shRNA）（shUHRF1）和陰性對照（shNC）的慢病毒載體，滴度測定為1× 109TU／mL。將MKN45細(xì)胞鋪于96孔板，隨機分為空白對照組、陰性對照組（shNC）和干擾組（shUHRF1），待陰性對照組和干擾組細(xì)胞生長至50%時按病毒滴度10、50、100、200分別進(jìn)行病毒感染，12 h后更換培養(yǎng)液，3 d后熒光顯微鏡下通過綠色熒光觀察病毒感染情況。接著收集病毒滴度100、200的細(xì)胞進(jìn)行擴大培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀分選帶有綠色熒光的細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實驗?？瞻讓φ战M不接受任何干擾。

1.3病毒感染后細(xì)胞中UHRF1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。裂解各組細(xì)胞后提取總蛋白，配制12%分離膠及5%積層膠，上樣，電流恒定20 mA進(jìn)行SDS-PAGE電泳50 min，用半干法轉(zhuǎn)膜17 min（電壓恒定20 V），5%脫脂奶粉于室溫封閉20 min，2%脫脂奶粉稀釋一抗（鼠抗人UHRF1單克隆抗體1∶400），4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。TBST洗滌，2%脫脂奶粉稀釋HRP標(biāo)記的二抗（羊抗鼠，1∶2 000），于室溫孵育1～1.5 h，TBST洗滌，ECL顯色，凝膠成像儀拍照（Biorad），QuantityOne軟件進(jìn)行定量分析，以空白對照組為參照，計算其他各組UHRF1蛋白相對表達(dá)量。

1.4細(xì)胞生長情況測定 采用XTT法。將各組細(xì)胞以1×103個／孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個復(fù)孔，共接種7塊板，常規(guī)培養(yǎng)7 d，每天取出1塊板進(jìn)行檢測。檢測前將XTT標(biāo)記試劑（最終濃度為0.3 mg／mL）和電子偶聯(lián)試劑（PMS，N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸鹽）混合，每孔加入50 μL配好的混合液，與細(xì)胞共培養(yǎng)6 h，于酶標(biāo)儀波長466 nm處檢測吸光度值，對照波長為650 nm，由此繪制各組細(xì)胞生長曲線，以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)。

1.5細(xì)胞克隆形成率測算 采用平板克隆形成試驗。各組細(xì)胞按1×103個／孔接種于90 mm2培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)2周后，待形成肉眼可見的集落時終止培養(yǎng)，PBS清洗3遍，甲醇固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，流水緩慢沖洗后晾干，計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量，計算克隆形成率。

1.6細(xì)胞周期和凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個／mL，用70%冰乙醇溶液固定。檢測前PBS洗滌1次，加入含RNA酶的碘化丙啶，避光溫育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，計算各周期細(xì)胞百分比及細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次取平均值。

1.7裸鼠皮下成瘤試驗 BALB／C裸小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，4～6周齡，17～21 g，均為雌性。寄養(yǎng)在動物中心，選擇恒溫25～28℃、恒濕45%～50%的半屏障系統(tǒng)環(huán)境下飼養(yǎng)。裸鼠攝入的飼料和水均需滅菌處理。取對數(shù)生長期的MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細(xì)胞，消化計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107／mL，用注射器抽取MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細(xì)胞懸液分別注入裸鼠尾右側(cè)和左側(cè)后背，每點0.2 mL（含活細(xì)胞數(shù)2×106個）。每次取5只裸鼠，實驗重復(fù)3次。每2天測量腫瘤1次，體積＝（D×d2）／2，其中D為最長直徑，d為最短直徑。4周后處死裸鼠，稱量腫瘤質(zhì)量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組UHRF1蛋白表達(dá) 空白對照組、陰性對照組和干擾組UHRF1蛋白相對表達(dá)量分別為1.00 ±0.00、1.05±0.13、0.09±0.01，與其他兩組比較，shUHRF1組UHRF1蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）。

2.2下調(diào)UHRF1表達(dá)對MKN45細(xì)胞增殖、凋亡的影響 見圖1、表1。

2.3下調(diào)UHRF1表達(dá)對MKN45體內(nèi)成瘤能力的影響 將MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細(xì)胞分別注射于裸鼠兩側(cè)皮下，經(jīng)過4周觀察后發(fā)現(xiàn)：注射MKN45-shUHRF1細(xì)胞的瘤體生長速度慢于注射MKN45-shNC細(xì)胞的瘤體；4周后同一只裸鼠MKN45-shNC側(cè)瘤體體積明顯大于MKN45-shUHRF1側(cè)，兩組瘤體的質(zhì)量分別為（1.07±0.26）、（0.48±0.18）g，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　MKN45細(xì)胞生長曲線

表1　下調(diào)UHRF1表達(dá)對MKN45細(xì)胞增殖、凋亡的影響（%±s）

表1　下調(diào)UHRF1表達(dá)對MKN45細(xì)胞增殖、凋亡的影響（%±s）

注：與干擾組比較，*P＜0.05。

組別細(xì)胞克隆形成率G0／G1期細(xì)胞S 期細(xì)胞細(xì)胞凋亡率空白對照組100±0*50.34±5.03*30.31±2.06*6.53±1.85*陰性對照組96±11*49.98±4.61*30.01±2.72*7.69±1.62*干擾組54±1168.46±3.0619.27±1.6413.94±2.06

3　討論

UHRF1是UHRF超家族成員之一，又稱ICBP90，包含N端泛素樣結(jié)構(gòu)域UBL、植物同源性PHD結(jié)構(gòu)域、SRA結(jié)構(gòu)域和C端的環(huán)狀RING結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；讣敖M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用，實現(xiàn)對DNA甲基化、組蛋白乙?；敖M蛋白甲基化的調(diào)控，從而參與細(xì)胞增殖、周期轉(zhuǎn)換及DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)過程，是一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子［7］。研究發(fā)現(xiàn)抑制UHRF1表達(dá)可增強和恢復(fù)抑癌基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。Unoki等［9］研究發(fā)現(xiàn)，E2F-1調(diào)控UHRF1促進(jìn)細(xì)胞G1／S期轉(zhuǎn)換。UHRF1在肝癌［4］、乳腺癌［8］和膀胱癌［10］等腫瘤中異常高表達(dá)，在癌旁組織中的表達(dá)低于癌組織。證實了UHRF1在DNA甲基化、促細(xì)胞增殖和抗凋亡以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中UHRF1表達(dá)顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者年齡和性別無關(guān)，并且UHRF1表達(dá)強度可以作為胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)［11］。該結(jié)果初步提示了UHRF1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是一種潛在的癌基因。本研究首先通過RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的UHRF1表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織，然后通過shRNA技術(shù)下調(diào)MKN45細(xì)胞中的UHRF1表達(dá)后，細(xì)胞生長速度顯著下降，其中G0／G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，從而特異性地抑制了細(xì)胞分裂，使細(xì)胞增殖速度減慢，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，UHRF1在維持DNA甲基化包括腫瘤抑癌基因的啟動子甲基化方面非常重要，如果這種維持作用被破壞，各種基因的隨機表達(dá)將被觸發(fā)，細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞周期阻滯［12］。

綜上所述，下調(diào)UHRF1的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡、延長細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制胃癌細(xì)胞生長。這一發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)生機制，并可望為胃癌防治提供新的靶標(biāo)。

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Inhibitory effect of down-regulated expression of UHRF1
on cell proliferation of gastric cancer

LEI Weizhen，GENG Yanan，HAN Dongsheng，ZHANG Wei，ZHOU Lin
（1 The 88th Hospital of PLA，Taian 271000，China）

Objective To investigate the inhibitory effect of down-regulated expression of ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1（UHRF1）on cell proliferation of gastric cancer（GC）and to explore its mechanism.Methods The gastric cancer cell line（MKN45）were randomly divided into the blank control group，the negative control group（shNC group）and the interference group（shUHRF1 group）；the latter two group were infected with shNC and shUHRF1.After UHRF1 expression was down-regulated by shRNA in MKN45 cells，the cell growth was examined by XTT and the clone formation rate was calculated by plate clone formation assay.Cell cycle and apoptosis of MKN45 cells were detected by flow cytometry（FCM）.In vivo tumorigenicity assay was conducted to examine growth ability in vivo.Results After UHRF1 expression was down-regulated in MKN45 cells by shRNA，the cell growth significantly decreased and colony formation reduced（all P＜0.05）.In the shUHRF1 group，the proportion of cells in G0／G1 phase increased and in S phase decreased，the apoptosis rate was increased and the difference was statistically significant（all P＜0.05）.The tumor growth rate in nude mice was significantly decreased（P＜0.01）.Conclusion The down-regulation of UHRF1 expression may inhibit the proliferation of gastric cancer possibly through extending the cell cycle progression and inducing cell apoptosis.

gastric neoplasms；ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1；cell proliferation；apoptosis

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.003

R735.2

A

1002-266X（2016）21-0007-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（81402337）。

類維振（1987-），男，護(hù)師，本科，主要研究方向為胃癌的增殖與轉(zhuǎn)移機制。E-mail：122238256＠qq.com

簡介：周林（1988-），男，主治醫(yī)師，博士，主要研究方向為胃腸道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：zhoulin1105＠163.com

（2016-02-16）