肖代雯，楊永長，姜 偉，喻 華，劉 華，黃文芳

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 檢驗科(成都 610072)

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·論 著·

血液來源肺炎克雷伯菌耐藥表型及基因型分析

肖代雯，楊永長，姜 偉，喻 華，劉 華，黃文芳△

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 檢驗科(成都 610072)

目的 了解臨床血液來源的肺炎克雷伯菌的耐藥表型和基因型分布情況。方法 收集2014年10月至2015年10月四川省人民醫(yī)院檢驗科臨床分離的37株肺炎克雷伯菌進行耐藥分析，采用雙紙片擴散法檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，PCR擴增CTX-M、TEM和SHV耐藥基因, PCR產(chǎn)物測序確定其基因型。結(jié)果 37株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)ESBLs菌株的陽性率為27.03%(10/37)。與不產(chǎn)ESBLs 的菌株相比，產(chǎn)ESBLs 的肺炎克雷伯菌對氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢曲松、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮/他唑巴坦、妥布霉素和復(fù)方新諾明的敏感性明顯下降，但對亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、頭孢吡肟和哌拉西林/他唑巴坦保持較好的敏感性；大部分產(chǎn)ESBLs 的菌株表現(xiàn)出對青霉素類、頭孢類和氨基糖甙類等藥物的多重耐藥。產(chǎn)ESBLs 的菌株CTX-M基因陽性率為60.00%(6/10)，3株為CTX-M-14型；TEM基因陽性率為80.00%(8/10)，均為TEM-1型；SHV基因陽性率為90.00%(9/10)，5株為SHV-11型。 結(jié)論 臨床血液來源的肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs的陽性率較高，耐藥性明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株，其基因型以TEM-1型和SHV-11型為主。

血液來源；肺炎克雷伯菌；表型；基因型

肺炎克雷伯菌是一種重要的條件致病菌，可引起肺炎、尿路感染、眼內(nèi)炎和敗血癥等疾病。據(jù)文獻[1-2]統(tǒng)計，肺炎克雷伯菌引起血流感染的發(fā)病率位居第3位，僅次于凝固酶陰性的葡萄球菌和大腸埃希菌。隨著抗生素的廣泛使用，血液來源的肺炎克雷伯菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的檢出率不斷增高，為24%～50%[1]；該菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率也呈逐年上升的趨勢，從2010年9.6%～13.2%上升至2012年11.2%～19.8%[2-3]，給臨床抗感染治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。根據(jù)質(zhì)粒所攜帶編碼基因同源性的不同，ESBLs主要分為TEM 型、SHV型、CTX-M型及一些少見的型別，如PER、VEB和GES等，但不同地區(qū)分離菌株優(yōu)勢β-內(nèi)酰胺酶基因型有一定的差異。本研究對四川省人民醫(yī)院臨床血液來源的肺炎克雷伯菌進行耐藥表型和基因型檢測分析，了解其流行分布的規(guī)律，為臨床診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年10月至2015年10月四川省人民醫(yī)院各科患者送檢的血培養(yǎng)標本中， Bact/Alert 3D 120 血培養(yǎng)儀報陽后經(jīng)全自動微生物分析儀VITEK-2鑒定的肺炎克雷伯菌37株，菌種-80 ℃保存。

1.1.2 試劑 DNA提取液購自中山大學(xué)達安基因，Taq masterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司，ESBLs CTX-M、TEM和SHV型基因特異性引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟/克拉維酸和頭孢他啶/克拉維酸紙購自杭州微生物試劑有限公司，Mueller-Hiton培養(yǎng)基購自英國OXOID公司。

1.1.3 儀器 細菌濁度儀購自法國梅里埃公司，PTC-200 全自動PCR 擴增儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 采用全自動微生物分析儀VITEK-2鑒定。質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2.2 藥敏試驗 采用VITEK-2全自動微生物分析儀進行藥敏試驗，抗生素包括：阿米卡星、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、左旋氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、復(fù)方新諾明、厄他培南。

1.2.3 ESBLs的測定 按NCCLS要求，采用雙紙片擴散法進行ESBLs的測定。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922(陰性對照)，肺炎克雷伯菌ATCC700603(陽性對照)。

1.2.4 DNA提取 挑取MAC培養(yǎng)基上經(jīng)過分離培養(yǎng)的菌落，加入DNA提取液100 μL，混勻，煮沸10 min，冷卻后10 000 r/min，離心10 min，取上清備用。

1.2.5 PCR擴增 根據(jù)參考文獻[4]合成引物 CTX-M/F: 5′-GTTACAGCCCTTCGGCGATGA TTC-3′, CTXM/R: 5′-GCGCATGGTGACAAAG AGAGTGCA- 3′,TEM/F:5′-TCGGGGAAATG TGCG-3′ TEM/R: 5′-TGCTTAATCAGTGAGG CACC-3′ SHV/F: 5′ -GCCGGGTTATTTTATTT GTCGC- 3′ SHV/R:5′-TCTTTCCGATGCCGCC GCCAGTCA-3′。擴增長度分別為CTX-M 877 bp，TEM 972 bp，SHV 1 015 bp。反應(yīng)體系(20 μL)為10 μL Taq masterMix, 1 μL上下游引物, 1 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min, CTX-M 55 ℃ 1 min(SHV 68 ℃, TEM 55 ℃), 72 ℃ 1 min, 30 cycles, 72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。陽性的PCR擴增產(chǎn)物送測序，結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫比對分析后確定其基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，藥敏結(jié)果采用例數(shù)(%)描述，不同菌株的耐藥性比較采用2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗

37株肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs陽性率為27.03%(10/37)。與不產(chǎn)ESBLs 菌株相比，產(chǎn)ESBLs 的肺炎克雷伯菌菌株對氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢曲松、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮/他唑巴坦、妥布霉素和復(fù)方新諾明的敏感性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而阿米卡星、頭孢吡肟和哌拉西林/他唑巴坦對產(chǎn)ESBLs 菌株具有較好的抗菌活性。37株菌對氨芐西林全部耐藥，但未發(fā)現(xiàn)對亞胺培南和厄他培南耐藥的株菌(表1)。

2.2 PCR擴增

用特異性引物擴增10株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌，其擴增片段大小與預(yù)期相符(圖1)。其中6株CTX-M基因陽性，8株TEM基因陽性，9株SHV基因陽性。有6株菌同時攜帶CTX-M、TEM和SHV基因，有1株同時攜帶TEM和SHV基因(表2)。

表1 血液來源肺炎克雷伯菌耐藥性分析

圖1 部分產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥基因擴增電泳圖

注：M: marker； 1: TEM-44； 2:TEM-93； 3:CTX-44； 4:CTX-93； 5:SHV-44

表2 產(chǎn)ESBLs菌株耐藥基因擴增及測序結(jié)果

2.3 PCR產(chǎn)物測序

經(jīng)測序證明，6株CTX-M基因陽性擴增產(chǎn)物中，3株為CTX-M-14型，1株為CTX-M-3型，8株TEM基因陽性擴增產(chǎn)物均為TEM-1型，9株SHV基因陽性擴增產(chǎn)物中5株為SHV-11型，2株為SHV-1型(表2)。

3 討論

近年來，隨著免疫抑制劑及大型有創(chuàng)操作的廣泛應(yīng)用，血流感染的發(fā)病率不斷上升。肺炎克雷伯菌是血培養(yǎng)最常分離到的革蘭陰性桿菌之一，據(jù)統(tǒng)計，由肺炎克雷伯菌引起血流感染的發(fā)病率占血流感染總數(shù)的6%～9%[1-2]。隨著抗生素的廣泛使用，肺炎克雷伯菌耐藥問題日益嚴重，ESBLs及對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的陽性檢出率呈上升趨勢。本研究所收集的37株血液來源的肺炎克雷伯菌，其中產(chǎn)ESBLs菌株陽性率為27.03%(10/37)。 ESBLs多在β-內(nèi)酰胺類抗生素的選擇壓力下誘導(dǎo)產(chǎn)生，能水解包括第三代頭孢菌素、單環(huán)酰胺類抗生素和第四代頭孢菌素等含1個氧亞氨基基團側(cè)鏈的β-內(nèi)酰胺類抗生素。本研究中10株產(chǎn)ESBLs菌株耐藥性明顯高于不產(chǎn)ESBLs菌株，對氨芐西林和呋喃妥因的耐藥率為100.00%(10/10)，對氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松和復(fù)方新諾明的耐藥率為90.00%(9/10)，且大部分表現(xiàn)出對青霉素類、頭孢類和氨基糖甙類等藥物的多重耐藥，這可能與這幾類藥物的臨床廣泛運用有關(guān)，應(yīng)引起臨床工作者的高度重視。目前，四川省人民醫(yī)院血液來源的產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對第四代頭孢菌素如頭孢吡肟、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦及碳青霉烯類抗生素保持了較好的抗菌活性(>90.00%)，可作為產(chǎn)ESBLs 肺炎克雷伯菌治療的首選藥物。

不同國家、地區(qū)由于使用抗生素的種類和數(shù)量不同，ESBLs的流行株也各有差異，其基因型各不相同。如美國紐約和突尼斯以CTX-M-15型為主[5-6]，臺灣地區(qū)主要流行SHV型[7]，廣東地區(qū)以CTX-M型為主，山西地區(qū)以TEM型常見[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，6株CTX-M陽性菌株中，3株為CTX-M-14型，其特征是該基因型產(chǎn)生的ESBLs對頭孢噻肟和頭孢曲松的水解力較強，而對頭孢他啶的水解能力相對較弱。8株TEM陽性菌株全為TEM-1型，對頭孢他啶的水解能力較強。SHV型ESBLs耐藥基因主要存在于克雷伯菌屬中,其特點是能水解頭孢噻肟和頭孢他啶。本研究中SHV陽性菌株有9株，5株為SHV-11型。7株菌同時攜帶了2種以上耐藥基因，其中2株為CTX-M-14+TEM-1+SHV-11模式。

綜上所述，抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致細菌的耐藥性呈現(xiàn)出高水平、多重耐藥和交叉耐藥的趨勢。加強細菌耐藥的監(jiān)測，對疾病的預(yù)防和指導(dǎo)臨床合理選用抗菌藥物具有十分重要的意義。

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Analysis of the Drug-resistant Phenotype and Genotype of Klebsiella Pneumonia Isolated from Blood

Xiao Daiwen, Yang Yongchang, Jiang Wei, Yu Hua, Liu Hua, Huang Wenfang△.

Clinical Laboratory Department, Sichuan Academy of Medical Science & Sichuan Provincial People′s Hospital, Chengdu 610072, China

Objective To investigate the drug-resistant phenotype and genotype of Klebsiella pneumonia strains isolated from blood. Methods Drug resistance of 37 Klebsiella pneumonia strains isolated from October of 2014 to October of 2015 in Sichuan Provincial People′s Hospital was analyzed. Extended-Spectrum β-Lactamases (ESBLs) producing strains were confirmed by double disk diffusion test. The drug resistant genes of CTX-M, TEM, SHV were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and the amplified products were sequenced to identify the genotype. Results The positive rate of ESBLs-producing Klebsiella pneumonia was 27.03%(10/37). The drug resistance of ESBLs-producing strains to ampicillin/sulbactam, aztreonam, ceftraxone, ceftazidime, ciprofloxacin, gentamicin, levofloxacin, cefoperazone/tazobatam, tobramycin and selectrin was much higher than ESBLs-negative ones, but ESBLs-producing isolates showed good susceptibility to imipenem, ertapenem, amikacin, cefepime and piperacillin/tazobactam sodium. Most of ESBLs-producing strains were multi-resistant to penicillins, cephalosporin and aminoglycoside antibiotics. The drug-resistance genes of CTX-M, TEM, SHV were found in 60.00%，80.00% and 90.00% ESBLs-producing strains respectively. The results of sequencing showed that 3 strains of 6 CTX-M were identified as CTX-M-14, 8 strains of TEM as TEM-1 and 5 strains of SHV as SHV-11. Conclusion The prevalence of ESBLs-producing Klebsiella pneumonia is high and the drug-resistance of ESBLs-positive isolates is significantly better than that of ESBLs-negative ones. The dominating genotyes of ESBLs are TEM-1 and SHV-11.

Isolated from blood; Klebsiella pneumonia; Phenotype; Genotype

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.012

R446.5

A

△通信作者：黃文芳， E-mail： huangwf2002@21cn.com