黃益艷，廖麗云， 許小紅

成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 (成都 610083)

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·論 著·

RP-HPLC測定間苯三酚栓劑含量*

黃益艷，廖麗云△， 許小紅

成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 (成都 610083)

目的 建立同時測定間苯三酚(phlorogluciol,PG)栓劑中兩種成分含量的方法。方法 采用RP-HPLC法，色譜柱為Nuanalytical C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào) pH值為 3.0)，梯度洗脫，檢測波長265 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果 PG、三甲基間苯三酚(trimethylphlorogluciol,TMP)tR分別為4.1和9.3 min；PG在6.02～40.16 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，TMP在6.05～40.32 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。線性方程分別為y=45.919x+0.080(R2=0.999 9)、y=49.424x-0.291(R2=0.999 7)。平均回收率分別為99.97% (RSD=0.67%，n=9)、100.34%(RSD=1.2%，n=9)。結(jié)論 本方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性好，可同時測定PG栓劑中兩種成分含量。

反相高效液相色譜法；間苯三酚；三甲基間苯三酚；間苯三酚栓劑；含量測定

間苯三酚(phlorogluciol，PG)是一種親肌性非阿托品非粟堿類純平滑肌解痙藥，能直接作用于胃腸道和泌尿生殖道的平滑肌[1-2]。PG多與三甲基間苯三酚(trimethylphlorogluciol，TMP)聯(lián)合使用，兩者可以抑制兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，減少平滑肌痙攣，從而緩解疼痛[3]。其特點是解除平滑肌痙攣的同時不會產(chǎn)生一系列抗膽堿樣不良反應(yīng),且只作用于痙攣平滑肌，對正常平滑肌影響很小[4]。臨床上主要用于治療消化系統(tǒng)和膽道功能障礙引起的急性痙攣性疼痛,已成為治療痙攣性疼痛的首選藥[5]。

文獻(xiàn)報道的 PG 分析方法通常有熒光法、薄層色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法等[6]，國外有關(guān)于PG片劑的含測，未見有對PG栓劑的含測。由于 PG 與 TMP 極性相差較大，同時栓劑基質(zhì)對含量測定易產(chǎn)生干擾，因此，本文重點篩選了色譜條件及樣品處理方法,進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗證，建立了PG栓劑含量測定的高效液相色譜法，為本品質(zhì)量研究提供方法學(xué)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HPLC 系統(tǒng)(包括 Dionex ultimate 3000 四元泵，Dionex ultimate 3000 自動進(jìn)樣器，Dionex ultimate 3000 二極管陣列檢測器，變色龍色譜工作站，美國戴安中國有限公司Ultimate 3000)NuAnalytical C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；優(yōu)普系列超純水器(UPH-II-10T,四川優(yōu)普超純科技有限公司)；PG二水合物對照品(中檢所，420011-201401，純度77.7%)；TMP對照品(中檢所，101022-201302，純度100%)；自制栓劑(20160701，20160702，20160703) 磷酸二氫鉀(成都市科龍化工試劑場，2014071901)；乙腈(色譜純)；其余試劑均為分析純。

1.2 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取 PG、TMP 對照品各 25 mg 置于 25 mL 容量瓶中，加流動相(乙腈：磷酸鹽緩沖液1∶1)溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取PG栓劑 10 粒，精密稱定，置于小燒杯中，于 55 ℃水浴鍋中加熱熔化。充分?jǐn)嚢杈鶆?，放冷至室溫，切成碎片。精密稱定適量(相當(dāng)于 PG、TMP 各約 20 mg) 置于 100 mL 容量瓶中，加熱融化后加流動相(乙腈∶磷酸鹽緩沖液=1∶1)40 mL， 超聲 20 min 左右，待基質(zhì)完全溶解，冷卻至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3 色譜條件

采用 NuAnalytical C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)； 流動相 A 為乙腈，流動相 B 為磷酸二氫鉀溶液，梯度洗脫，程序見表1，檢測波長為265 nm；柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

1.4 方法的專屬性

1.4.1 空白輔料干擾性試驗 分別取按處方配比的基質(zhì)、PG 對照品、TMP 對照品、PG栓劑溶液各 20 μL，按 “1.3”項色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果各色譜峰均分離很好，基質(zhì)在該色譜條件下無吸收，不會干擾樣品的測定(圖1A～C)。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 酸破壞試驗 分別取 PG、TMP 對照品適量，加入2 mL 濃度為1 mol·L-1HCL，搖勻，室溫放置 0.5 h，用 1 mol·L-1NaOH 溶液中和，用流動相稀釋至刻度，過濾，按“ 1.3 ”項色譜條件測定。結(jié)果 PG 在酸破壞條件下產(chǎn)生雜質(zhì)，主峰與各雜質(zhì)峰能有效分離，TMP 酸破壞條件下較穩(wěn)定，未產(chǎn)生明顯雜質(zhì)(圖 1D)。

1.4.3 堿破壞試驗 分別取 PG、TMP 對照品適量，加入 2 mL 濃度為1 mol·L-1NaOH，搖勻，室溫放置 0.5 h，用濃度為 1 mol·L-1HCL 中和，用流動相稀釋至刻度，過濾，按“ 1.3 ”項色譜條件測定。結(jié)果堿破壞的 PG、TMP 均與其雜質(zhì)峰分離良好 (圖 1E)。

1.4.4 氧化破壞試驗 分別取 PG、TMP 對照品適量于 10 mL 容量瓶中，加入 2 mL 濃度為 30% 的雙氧水，搖勻，室溫放置 1 h，用流動相稀釋至刻度，過濾，按“1.3”項項色譜條件測定。結(jié)果 PG、TMP 氧化破壞均未產(chǎn)生雜質(zhì)(圖 1F)。

1.5 線性關(guān)系的考察

精密吸取 PG、TMP 對照品溶液適量，將其逐漸稀釋制成 0.40、0.30、0.20、0.10、0.08和0.06 mg·mL-1的 PG、TMP 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾，按“1.3”項色譜條件測定，記錄色譜圖。以樣品濃度對峰面積進(jìn)行回歸，回歸方程分別為AP=45.919 C+0.080(R2=0.999 9)、 ATMP=49.424 C-0.291(R2=0.999 7)。 范圍分別為6.02～40.16 μg·mL-1和6.05～40.32 μg·mL-1。

1.6 回收率試驗

分別精密稱取 PG、TMP 對照品各 9 份，按處方比例加入基質(zhì)，按供試品方法配制成高、中、低3種濃度的樣品溶液，過濾，照“1.3”項色譜條件測定，用回歸方程計算回收率(表2)。

表2 PG回收率試驗結(jié)果(n=9)

1.7 精密度試驗

分別取線性下 0.3 mg·mL-1PG、TMP 對照品溶液。照“ 1.3 ”項色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣 6次，結(jié)果見表3。PG 和 TMP 峰面積的 RSD 分別為0.21%和0.08%(n=6)，結(jié)果表明本方法進(jìn)樣精密度良好。

1.8 重復(fù)性試驗

分別精密量取供試品貯備液 2、3和4 mL置于3個 25 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制得 3 個不同濃度的供試品溶液，照“1.3”項色譜條件進(jìn)樣，每個樣品平行測定3次，記錄峰面積。結(jié)果見表4。結(jié)果表明：PG 平均標(biāo)示量含量為 101.78%，RSD為 0.90%；TMP 平均標(biāo)示量含量為 100.67%、RSD 為 0.92%，本法重復(fù)性良好。

圖1 HPLC 方法專屬性考察圖譜

注：A．混合標(biāo)準(zhǔn)品，1.PG，2.TMP； B.自制PG栓劑, 1.PG，2.TMP；C.空白基質(zhì)；D1.PG酸破壞，D2.TMP酸破壞；E1. PG堿破化，E2. TMP 堿破壞；F1. PG氧化破壞，F(xiàn)2. TMP氧化破壞

表3 溶液精密度試驗結(jié)果

表4-1 PG含量測定重復(fù)性結(jié)果

表4-2 TMP含量測定重復(fù)性結(jié)果

1.9 溶液穩(wěn)定性試驗

取“1.2”項供試品溶液 20 μL按“1.3”項色譜條件分別在 0、1、2、4、6、8和10 h 內(nèi)測定。結(jié)果見表5。PG、TMP 峰面積的 RSD 分別為 0.56%、0.62%，結(jié)果表明 PG、TMP 在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 溶液穩(wěn)定試驗結(jié)果

1.10 耐用性

分別在不同品牌批號的色譜柱、pH=2.8、3.0和3.2 的磷酸緩沖液， 28、30和32 ℃ 柱溫下測定 PG、TMP 含量。結(jié)果顯示理論塔板數(shù)均大于 10 000， 拖尾因子<1.5，PG、TMP 含量的 RSD 均<2%。結(jié)果表明將色譜條件中磷酸鹽緩沖液 pH 值、柱溫及色譜柱的品牌型號等做微小變化對測定結(jié)果不會產(chǎn)生顯著性影響，表示該方法的耐用性好。

1.11 3批小試測定結(jié)果

采用本文建立的 HPLC 法對3批自制栓劑的 PG、TMP 含量進(jìn)行測定，結(jié)果該方法能較好的同時滿足PG、TMP 含量測定的要求。結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可作為PG栓劑的質(zhì)量控制方法。結(jié)果見表 3。

表6 3批小試樣品含量測定結(jié)果

2 討論

本文對甲醇-磷酸鹽緩沖液和乙腈-磷酸鹽緩沖液流動相體系進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示乙腈-磷酸緩沖液明顯優(yōu)于甲醇-磷酸鹽緩沖液，并對等度洗脫與梯度洗脫進(jìn)行了對比分析。由于采用等度洗脫PG和TMP的極性相差較大，致出峰時間間隔長。而采用梯度洗脫可明顯縮減兩個物質(zhì)的出峰時間間隔，因此本文色譜條件采用梯度洗脫。開始流速設(shè)為0.7 mL·min-1，少見于PG含量測定的其他報道，主要原因是將流速設(shè)為1.0 mL·min-1，PG極性大導(dǎo)致出峰時間過早，理論塔板數(shù)低。但在0.7 mL·min-1流速下,目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰完全分開,且理論板數(shù)>9 000。 因此本文色譜條件將開始流速設(shè)定為0.7 mL·min-1。

本文對PG和TMP進(jìn)行強制降解實驗，包括酸破壞、堿破壞和氧化破壞，并對破壞條件包括破壞的強度和時間進(jìn)行考察，最終確定破化試驗方法。在該色譜條件下PG和TMP能產(chǎn)生雜質(zhì)且其主峰與各雜質(zhì)峰均能有效分離，具有較好的專屬性。

栓劑由藥物與基質(zhì)組成，油脂性基質(zhì)對藥物測定有影響，因此在含量測定時減少基質(zhì)影響很重要。本實驗樣品處理的方法為先將樣品在55 ℃ 水浴鍋中融化，待融化后用流動相乙腈與磷酸緩沖液1∶1溶解，將其置于超聲機中超聲20 min左右，至基質(zhì)全部溶解且無絮狀物后即可，白色絮狀物存在會吸附一部分藥物導(dǎo)致含量偏低。待其冷卻至室溫后定容。用45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

試驗結(jié)果表明在本試驗的色譜條件下，PG回收率高，耐受性好且可以充分的分離出PG、TMP及其破壞后的有關(guān)物質(zhì)，具有較好的專屬性，能滿足PG和TMP含量測定的要求，可作為PG栓劑的質(zhì)量控制方法。

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A Study on the Content Determination of Phloroglucinol Suppository by RP-HPLC

Huang Yiyan, Liao Liyun△, Xu Xiaohong.

School of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China

Objective To establish a RP-HPLC method to determine the content of phloroglucinol and trimethylphloroglucinol simultaneously in phloroglucinol suppository. Methods High performance liquid chromatography (HPLC) was adopted with the Nuanalytical C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) as the chromatographic column, the acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate solution with the pH of 3.0 adjusted with phosphoric acid as the mobile phase, the gradient elution, the detection wavelength of 265 nm, and the column temperature of 30 ℃. Results The phloroglucinol tR is 4.1 min and the trimethylphlorogluciol tR is 9.3 min. The linear range of phloroglucinol was 6.02-40.16 μg·mL-1and that of trimethylphloroglucinol was 6.05-40.32 μg·mL-1. The linear equations wereY=45.919x+0.080(R2=0.999 9),Y=49.424x-0.291(R2=0.999 6) respectively. The average recovery rate of phloroglucinol was 99.97% (RSD 0.67%,n=9) and that of Trimethylphloroglucinol was 100.34% (RSD 1.2%,n=9). Conclusion The established method is simple, accurate and specific in determining the content of phloroglucinol and trimethylphloroglucinol in phloroglucinol suppository.

High performance liquid chromatography; Phloroglucinol; Trimethylphloroglucinol; Phloroglucinol suppository; Content determination

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1704.050.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.008

四川省教育廳基金(No:16Z009、16Z010)

R927；O657.7+2

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△通信作者:廖麗云，Email: llyhx@tom.com